FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Ki-67 Antigen Klon

advertisement
FLEX
Monoclonal Mouse
Anti-Human
Ki-67 Antigen
Klon MIB-1
Ready-to-Use
(Dako Autostainer/Autostainer Plus)
Nr kat. IS626
Przeznaczenie
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Przeciwciało FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Ki-67 Antigen, klon MIB-1, Ready-to-Use (Dako
Autostainer/Autostainer Plus), jest przeznaczone do stosowania w immunohistochemii w aparatach Dako
Autostainer/Autostainer Plus. Przeciwciało okazało się cennym narzędziem do wykrywania antygenów Ki-67
w komórkach prawidłowych i nowotworowych, na przykład w mięsakach tkanek miękkich (1), gruczolaku stercza (2)
i raku sutka (3). Wyniki panelu przeciwciał są pomocne w diagnostyce róŜnicowej. Interpretacja kliniczna dodatniego
lub ujemnego odczynu musi być uzupełniona przez ocenę morfologiczną, wykonanie odpowiednich prób kontrolnych
i interpretowana przez doświadczonego patologa w kontekście historii choroby pacjenta i innych badań
diagnostycznych.
Streszczenie
i informacje ogólne
Antygen Ki-67 jest białkiem jądrowym, definiowanym przez swoją reaktywność z przeciwciałem monoklonalnym
z klonu Ki-67 (4). Zidentyfikowano dwie izoformy, o masach cząsteczkowych 345 i 395 kDa (5). Antygen Ki-67
podlega preferencyjnej ekspresji w trakcie wszystkich faz aktywnych cyklu komórkowego (fazy G1, S, G2 i M),
jednak nieobecny jest w komórkach spoczynkowych (faza G0) (4). W trakcie interfazy antygen wykrywany jest
wyłącznie w jądrze, podczas gdy w trakcie mitozy większość białka relokowana jest na powierzchni chromosomów.
Po przejściu komórki do interfazy antygen ulega gwałtownej degradacji (6) i wydaje się, Ŝe ekspresja Ki-67 nie
następuje w trakcie procesu naprawy DNA (7).
Zobacz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub następujące
części instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasada przeprowadzenia odczynu, 2) Niezbędne materiały
niedostarczone z zestawem, 3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie barwienia, 6) Kontrola
jakości, 7) Rozwiązywanie problemów, 8) Interpretacja wyniku barwienia, 9) Ograniczenia metody.
Dostarczany
odczynnik
Gotowe do uŜycia mysie przeciwciała monoklonalne są dostarczane w postaci ciekłej w buforze zawierającym białko
stabilizujące i roztwór azydku sodu o stęŜeniu 0,015 mol/L.
Klon: MIB-1 (8). Izotyp: IgG1, kappa.
Immunogen
Ludzki rekombinowany peptyd opowiadający fragmentowi cDNA dla Ki-67 o długości 1002 par zasad (8).
Swoistość
W badaniach metodą Western blot lizatów linii komórek szpiczaka mnogiego IM-9 przeciwciało MIB-1 znakuje prąŜki
odpowiadające masie 345 i 395 kDa, te same, które znakuje oryginalne przeciwciało Ki-67. Doświadczenia
prowadzone w technice Western blot i wiązania konkurencyjnego jasno dowodzą, Ŝe MIB-1, podobnie jak oryginalne
przeciwciało Ki-67, reaguje z epitopem kodowanym przez powtarzalny element złoŜony z 66 par zasad w genie Ki-67.
W immunohistochemii przeciwciała MIB-1 i Ki-67 wywołują identyczne odczyny na serii zamroŜonych skrawków
mieszkowych (8). Przeciwciała MIB-1 rozpoznają natywny antygen Ki-67 oraz rekombinowane fragmenty cząsteczki
Ki-67 (8).
Środki ostroŜności
1. Odczynniki przeznaczone dla przeszkolonych UŜytkowników.
2. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek — azydek sodu (NaN3), w czystej postaci. StęŜenie NaN3
występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w wyniku reakcji NaN3 z ołowiem lub
miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe azydki metali.
Przy usuwaniu resztek odczynnika uŜywać duŜych ilości wody do przepłukiwania, aby uniknąć gromadzenia się
azydków w instalacji kanalizacyjnej.
3. Podobnie jak w przypadku kaŜdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, naleŜy stosować
odpowiednie procedury postępowania.
4. NaleŜy stosować właściwe wyposaŜenie ochronne, zabezpieczające przed kontaktem odczynnika ze skórą
bądź oczami.
5. Niewykorzystany odczynnik naleŜy usuwać zgodnie ze stosownymi przepisami lokalnymi i krajowymi.
Przechowywanie
(116571-004)
Dako Denmark A/S
Przechowywać w temperaturze 2–8 °C. Nie stosowa ć po upływie terminu waŜności podanego na opakowaniu.
JeŜeli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane na ulotce dołączanej do opakowania,
uŜytkownik powinien je zweryfikować. Nie ma jednoznacznych oznak świadczących o niestabilności produktu. Z tego
względu jednocześnie z badaniem próbek pochodzących od pacjentów, naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby
kontrolne. W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach
laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z przeciwciałem, naleŜy się skontaktować z działem wsparcia
technicznego firmy Dako.
IS626/PL/KIA/2011.09.20 str. 1/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
Przygotowanie
próbek oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie.
Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o wymiarach około 4 µm.
Wymagane jest poddanie cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER) z uŜyciem Dako PT Link (nr kat.
PT100/PT101). Szczegółowe instrukcje zawiera Instrukcja uŜytkownika aparatu PT Link. Optymalne wyniki uzyskuje
się po wstępnej obróbce tkanek przy uŜyciu roztworu EnVision FLEX, Target Retrieval Solution, Low pH (50x)
(nr kat. K8005).
Skrawki zatapiane w parafinie: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych, zalecana jest procedura 3 w 1 z uŜyciem odczynnika Dako PT Link. Postępować według procedury
wstępnej obróbki zamieszczonej w ulotce roztworu EnVision FLEX, Target Retrieval Solution, Low pH (50x) (nr kat.
K8005). Uwaga: Po przeprowadzeniu barwienia skrawki muszą być odwodnione, oczyszczone i zakryte za pomocą
środka do trwałego zatapiania.
Odparafinowane skrawki: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych, zalecane jest uŜycie odczynnika Dako PT Link i przeprowadzenie procedury opisane dla skrawków
parafinowych. Po zakończeniu barwienia szkiełka naleŜy zatopić w wodnym lub trwałym środku do zatapiania.
W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny
wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych, zaleca się stosowanie
szkiełek FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020).
Wykonanie odczynu
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX, High pH (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat.
K8010) zastępujący odczynnik High pH Target Retrieval Solution z tego zestawu przez roztwór EnVision™ FLEX
Target Retrieval Solution, Low pH (50x) (kod K8005). Oprogramowanie aparatów Dako Autostainer/Autostainer Plus
zawiera wstępnie zaprogramowane etapy odczynu i czas barwienia, które są aktywne podczas korzystania z
następujących protokołów:
Protokół wzorcowy: FLEXRTU2 (dawka odczynnika 200 µL) lub FLEXRTU3 (dawka odczynnika 300 µL) Autoprogram:
Ki67 (bez barwienia kontrastowego) lub Ki67H (z barwieniem kontrastowym)
Dla etapu „Auxiliary” naleŜy ustawić opcję „rinse buffer” w programach barwienia ≤10 szkiełek. Przy programach z
więcej niŜ 10 szkiełkami, etap „auxiliary” naleŜy ustawić na „none”. Zapewnia to porównywalne czasy płukania.
Wszystkie procedury inkubacji naleŜy równieŜ przeprowadzać w temperaturze pokojowej. Szczegółowe informacje
zawiera instrukcja obsługi odpowiedniego aparatu. Jeśli protokoły nie są dostępne w uŜywanym aparacie
Autostainer, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
Optymalne warunki mogą się zmieniać w zaleŜności od rodzaju materiału i sposobu jego przygotowania i powinny
być określone indywidualnie w kaŜdym laboratorium. Aby moŜliwe było wykonanie oceny przez patologów z róŜnym
nasileniem odczynu preparatów, naleŜy skontaktować się z działem obsługi/obsługą techniczną firmy Dako w celu
uzyskania informacji dotyczącej zmiany programowania protokołu. NaleŜy upewnić się, Ŝe działanie
zmodyfikowanego protokołu jest prawidłowe — w tym celu naleŜy ocenić, czy odczyn jest taki jak opisany w części
„Charakterystyka wydajnościowa”.
Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną za pomocą EnVision FLEX Hematoxylin (Dako
Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8018). Zaleca się stosowanie bezwodnego, trwałego środka do zatapiania.
Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby
kontrolne z uŜyciem identycznego protokołu. Dodatnia kontrola tkankowa powinna obejmować migdałki, natomiast
we wszystkich dodatnich preparatach komórki/struktury powinny wskazywać odczyn reakcji taki jak opisany dla tej
tkanki w części „Charakterystyka wydajnościowa”. Zalecana kontrola ujemna to FLEX Negative Control, Mouse
(Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. IS750).
Interpretacja odczynu
Komórki znakowane przez przeciwciało wykazują odczyn jądrowy, z wyjątkiem komórek mitotycznych, w których
znakowane są chromosomy i cytoplazma.
Charakterystyka
wydajnościowa
Tkanki prawidłowe: Komórki podśluzowe tkanki łącznej oraz głębokie komórki mieszkowe w jelicie cienkim i
okręŜnicy, jak teŜ komórek zarodkowych kępki Peyera wykazują reakcję dodatnią z przeciwciałem. Komórki
powierzchniowe nabłonka i inne komórki śluzówki, np. komórki Panetha i komórki podśluzowe tkanki łącznej, dają
wyniki całkowicie ujemne. To samo dotyczy komórek mięśniowych, z wyjątkiem kilku dodatnich komórek w
mięśniach gładkich. Nerki, wątroba, trzustka i mózg dają wyniki ujemne (9). W badaniach immunohistochemicznych
obserwowano sporadyczne znakowanie składników tkanek ścian naczyń i zrębu trzustki. W migdałkach komórki B
ośrodków rozmnaŜania w fazie ciemnej wykazują umiarkowany lub silny odczyn, a komórki B ośrodków rozmnaŜania
w fazie jasnej wykazują odczyn słaby lub umiarkowany.
Tkanki nieprawidłowe: W badaniach 123 mięsaków tkanek miękkich przy uŜyciu przeciwciała MIB-1 najwyŜszą
ekspresję Ki-67 wykazano w złośliwych włókniakach histiocytarnych, a najniŜszą w mięsakach tłuszczowych.
Przeciwciało zostało równieŜ z sukcesem zastosowane do wykazania obecności antygenu Ki-67 w 221 rakach
gruczołu krokowego (2) i 919 rakach sutka (3). Barwienie błonowe/cytoplazmatyczne wystąpiło w badaniu 322
przypadków inwazyjnych raków przewodowych sutka i błonowe/cytoplazmatyczne Ki-67 okazało się być powiązane
z występowaniem nowotworów stopnia 3, negatywnym wynikiem ER i amplifikacją HER2 (10).
(116571-004)
Dako Denmark A/S
IS626/PL/KIA/2011.09.20 str. 2/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
Piśmiennictwo
1.
Huuhtanen RL, Blomqvist CP, Wiklund TA, Böhling TO, Virolainen MJ, Tukiainen EJ, et al. Comparison of the
Ki-67 score and S-phase fraction as prognostic variables in soft-tissue sarcoma. Br J Cancer 1999; 79:945-51.
2.
Borre M, Bentzen SM, Nerstrøm B, Overgaard J. Tumor cell proliferation and survival in patients with prostate
cancer followed expectantly. J Urol 1998; 159:1609-14.
3.
Seshadri R, Leong AS-Y, McCaul K, Firgaira FA, Setlur V, Horsfall DJ. Relationship between p53 gene
abnormalities and other tumour characteristics in breast-cancer prognosis [published erratum appears in Int J
Cancer 1996;69:354]. Int J Cancer 1996; 69:135-41.
4.
Gerdes J, Lemke H, Baisch H, Wacker H-H, Schwab U, Stein H. Cell cycle analysis of a cell proliferationassociated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67. J Immunol 1984;133:1710-5.
5.
Gerdes J, Li L, Schlueter C, Duchrow M, Wohlenberg C, Gerlach C, et al. Immunobiochemical and molecular
biologic characterization of the cell proliferation-associated nuclear antigen that is defined by monoclonal
antibody Ki-67. Am J Pathol 1991; 138:867-73.
6.
Scholzen T, Gerdes J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown [review]. J Cell Physiol 2000;
182:311-22.
7.
Key G, Kubbutat MH, Gerdes J. Assessment of cell proliferation by means of an enzyme-linked immunosorbent
assay based on the detection of the Ki-67 protein. J Immunol Methods 1994; 177:113-7.
8.
Key G, Becker MHG, Baron B, Duchrow M, Schlüter C, Flad H-D, et al. New Ki-67-equivalent murine
monoclonal antibodies (MIB 1-3) generated against bacterially expressed parts of the Ki-67 cDNA containing
three 62 base pair repetitive elements encoding for the Ki-67 epitope. Lab Invest 1993; 68:629-36.
9.
Cattoretti G, Becker MHG, Key G, Duchrow M, Schlüter C, Galle J, et al. Monoclonal antibodies against
recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwave-processed
formalin-fixed paraffin sections. J Pathol 1992; 168:357-63.
10. Faratian D, Munro A, Twelves C,Bartlett JMS. Membranous and cytoplasmic staining of Ki67 is associated with
HER2 and ER status in invasive breast carcinoma. Histopathology 2009:54:254-257.
Objaśnienie symboli
Numer katalogowy
Temperatura przechowywania
ZuŜyć przed
Wyrób medyczny do
diagnostyki in vitro
Zawartość wystarcza na <n>
testów
Producent
Sprawdzić w instrukcji
stosowania
Numer serii
(116571-004)
Dako Denmark A/S
IS626/PL/KIA/2011.09.20 str. 3/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
Download