Specsheet Template CE

Monoclonal Mouse
Anti-Bromodeoxyuridine/FITC
Klon Bu20a
Nr kat. F 7210
Wydanie 01.03.03
Przeznaczenie
Do diagnostyki in vitro.
F 7210 przeznaczone jest do użycia w cytometrii przepływowej. Anti-Bromodeoxyuridine jest użyteczna w
badaniach nad kinetyką cyklu komórkowego guzów litych (1). Interpretacji wyników może dokonywać osoba
wykwalifikowana, w kontekście wywiadu chorobowego i innych badań diagnostycznych.
Wstęp
Bromodeoxyuridine (BrdU) jest analogiem tymidyny, wbudowywanym do DNA w miejsce tymidyny podczas
syntezy DNA. Przez pulsowe znakowanie z użyciem BrdU, synteza komórkowego DNA może zostać wykryta z
użyciem przeciwciała anti-BrdU (3-5).
Znakowanie przez BrdU jest użyteczne w badaniach kinetyki cyklu komórkowego w normalnych komórkach
człowieka, zwierząt, guzów litych oraz linii komórkowych (1-8). W tym guzów CNS, głowy i szyi, raków układu
pokarmowego, sutka, układu moczowo-płciowego, nerki, pęcherza moczowego, prostaty oraz nowotworów
układu krwiotwórczego. (1, 2). Znakowanie przez BrdU może pozwolić na określenie indeksu znakowania
(labelling index -LI), Ts oraz Tpot. LI, a także frakcji komórek syntezujących DNA, jest to definiowane jako liczba
komórek wyznakowanych przez BrdU podzielonych przez liczbę komórek analizowanych. Ts jest czasem
trwania fazy S w cyklu komórkowym (6). Tpot jest wyliczane jako teoretyczna objętość proliferacyjna populacji
komórek guza w nieobecności utraty komórek i jest wyliczana z wartości LI oraz T s (2, 6).
Odczynnik dostarczony
Przeciwciało Anti-Bromodeoxyuridine sprzężone z fluorochromem F 7210,jest produkowane z oczyszczonych
monoklonalnych mysich przeciwciał. Przeciwciała te dostarczane są w postaci ciekłej w buforze zawierającym
1% albuminy surowicy wołowej (BSA) oraz 15 mmol/L NaN3, pH 7.2. Każde opakowanie wystarcza na 100
testów (10 L konjugatu na 106 leukocytów z normalnej krwi obwodowej człowieka).
Izotyp: IgG1, kappa. Stężenie koniugatu mg/L: Patrz etykieta na opakowaniu.
Przeciwciało
Nr kat.
Fluorochrom
Kontrola
Negatywna
Nr kat.
F 7210
FITC (Izomer 1 Izocjanianu Fluoresceiny)
X 0927
Immunogen
BrdU skoniugowane z albuminą surowicy bydlęcej (7).
Swoistość
Analiza metodą cytometrii przepływowej komórek z linii komórkowej ludzkiej białaczki limfatycznej z
wbudowanym BrdU oraz ludzkich keratynocytów z wbudowaną 5-iodourydyną wykazuje specyficzne
zabarwienie z Anti-Bromodeoxyuridine (8). Anti-Bromodeoxyuridine, Bu20a, zostało użyte do obliczenia LI linii
komórkowych z wbudowanym BrdU hodowanych z jajnika chomika Chińskiego (Chinese hamster ovary -CHO),
fibroblastów płuca chomika (V79), oraz ludzkiego adenokarcinoma sutka (MCF-7) (6).
Środki ostrożności
1. Do stosowania przez osoby przygotowane zawodowo.
2. Produkt zawiera azydek sodowy (NaN3), odczynnik chemiczny silnie toksyczny w czystej postaci. W stężeniu
obecnym w produkcie, chociaż nie klasyfikowanym jako niebezpieczne, azydek sodowy może reagować z
elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, tworząc silnie wybuchowe pochodne lub azydki tych
metali. Przy usuwaniu odpadów przepłukać spływ dużą ilością wody, aby uniknąć tworzenia się azydków.
3. Jak w przypadku każdego materiału biologicznego należy stosować odpowiednie procedury.
Przechowywanie
Przechowywać bez dostępu światła w temp. 2-8oC. Nie używać po upływie daty ważności wskazanej na
opakowaniu. Jeśli produkt był przechowywany w warunkach innych niż wskazane, użytkownik musi sprawdzić
jakość produktu. Nie ma wyraźnych oznak wskazujących na niestabilność produktu, dlatego równocześnie z
próbkami badanymi powinno się oznaczać wiarygodną kontrolę. Jeżeli uzyskuje się nieoczekiwane wyniki bez
zmiany procedur laboratoryjnych i można podejrzewać, że dzieje się to z winy przeciwciała, należy
skontaktować się z serwisem technicznym firmy Dako.
Procedura barwienia
1.
Dodać BrdU do zawiesiny komórek w medium hodowlanym do końcowego stężenia 10 mol/L,
inkubować 30 minut w inkubatorze z CO2 w 37oC.
2.
Przemyć komórki dwukrotnie PBS-em zawierającym 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA-bovine serum
albumin). Odwirować 15 minut przy 500g. Ponownie zawiesić w PBS-e na lodzie.
3.
Dodawać kroplami zawiesinę komórkową do 5 mL 70% etanol ochłodzonego do – 20oC podczas ciągłego
mieszania (vortex). Inkubować na lodzie 30 minut.
4.
Odwirować przy 500g przez 10 minut, odpipetować supernatant i wytrącić płytki przez mieszanie (vortex).
5.
Dodać powoli 1 mL 2 mol/L HCl, 0.5% Triton X-100 do komórek podczas mieszania (vortex). Inkubować
w temperaturze pokojowej 30 minut.
6.
Odwirować przy 500g przez 10 minut, odpipetować supernatant i ponownie zwiesić komórki w 3 mL 0.1
mol/L Na2B4O7, pH 8.5.
(110716-002)
F 7210/PL/SSA/01.03.03 str.1/2
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
7.
Odwirować przy 500g przez 10 minut, odpipetować supernatant (na tym etapie można komórki zawiesić
w 70% etanolu i przechowywać w -20 °C).
8.
Zawiesić komórki w PBS-ie zawierającym 1% BSA i 0.5% Tween 20. Ustalić stężenie komórek na 1 x 106
w 100 L.
9.
Zmieszać 100 L zawiesiny komórkowej z 10 L F 7210.
10.
Jako kontrolę negatywną użyj nie reaktywne monoklonalne przeciwciało o tym samym izotypie
skoniugowane z tym samym fluorochromem ( patrz tabela).
11.
Inkubować w ciemności w temperaturze 4 C przez 30 minut.
12.
Przemyć jeden raz PBS-em zawierającym 1% BSA i 0.5% Tween 20 oraz odwirować przy 500g przez 5
minut.
13.
Zawiesić komórki w PBS-ie zawierającym 5 g/mL propidium iodide.
14.
Wykonać analizę na cytometrze przepływowym.
Zaleca się wykonanie kontroli negatywnej i pozytywnej równolegle z przygotowaniem badanych próbek. Należy
także zwrócić uwagę na fakt że, próbki zawierające fluorochromy są nieodporne na światło w czasie całej
procedury przygotowania i analizy.
Literatura
1.
Dolbeare F. Bromodeoxyuridine: a diagnostic tool in biology and medicine, Part II: oncology,
chemotherapy and carcinogenesis. Histochem J 1995;27:923-64.
2.
Zackrisson B, Flygare P, Gustafsson H, Sjöström B, Wilson GD. Cell kinetic changes in human
squamous cell carcinomas during radiotherapy studied using the in vivo administration of two
halogenated pyrimidines. Eur J Cancer 2002;38:1100-6.
3.
Gratzner HG. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: a new reagent for detection of
DNA replication. Science 1982;218:474-5.
4.
Dolbeare F, Gratzner H, Pallavicini MG, Gray JW. Flow cytometric measurement of total DNA content and
incorporated bromodeoxyuridine. Proc Natl Acad Sci (USA) 1983;80:5573-7.
5.
Khochbin S, Chabanas A, Albert P, Albert J, Lawrence JJ. Application of bromodeoxyuridine incorporation
measurements to the determination of cell distribution within the S phase of the cell cycle. Cytometry
1988;9:499-503.
6.
Johansson Mc, Johansson R, Baldetorp B, Oredsson SM. Comparison of different labelling index formulae
used on bromodeoxyuridine-flow cytometry data. Cytometry 1998;32:233-40.
7.
Magaud JP, Sargent I, Clarke PJ, Ffrench M, Rimokh R, Mason DY. Double immunocytochemical labeling of
cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine. J Histochem Cytochem 1989;37:1517-27.
8.
Jensen PØ, Larsen JK, Christensen IJ, van Erp PEJ. Discrimination of bromodeoxyuridine labelled and
unlabelled mitotic cells in flow cytometric bromodeoxyuridine/DNA analysis. Cytometry 1994;15:154-61.
Objaśnienia symboli
(110716-002)
Numer katalogowy
Temperatura przechowywania
Zużyć przed
Wyrób medyczny do
diagnostyki in vitro
Chronić przed silnym światłem
(sprawdź w zasadach
przechowywania)
Producent
Sprawdź w instrukcji
stosowania
Numer serii
F 7210/PL/SSA/01.03.03 str.2/2
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17