Transformacja E

Transformacja E. Coli metodą rubidowo-wapniową v 2.3
1. Założyć hodowlę nocną w podłożu płynnym LB
2. Rozcieńczyć hodowlę nocną do OD=0,05 (przepis: hodowla bakterii) i wytrząsać
około godziny przy 120 rpm do OD600 nie większego niż 0,4 (np. 0,35)
3. 1 ml hodowli odwirować przez 5 min, 8 tys rpm w 4C a osad zawiesić w 1 ml
roztworu I (T1) i odwirować
4.
Osad zawiesić w 0,2 ml roztworu II (T2)
Kompetentne komórki użyć do transformacji lub zamrozić (-70C) z DMSO
(Appendix)
5. Bakterie inkubować w lodzie przez 15 min.
6. Dodać DNA (100 ng) i inkubować w lodzie przez kolejne 15 min.
7. Próbki przenieść do 44oC na 50-60 sek.
8. Przenieść szybko mieszaninę transformacyjną do 1-5 ml podłoża płynnego LB i
inkubować w 37oC przez 30-60 min.(jeśli transformanty będą wysiane na szalki z
amp) lub 1-2 godz. (kan) (bez wytrząsania!!!)
9. Hodowlę wysiać na płytki LB z dodatkiem antybiotyku.
Appendix
Roztwory stosowane do transformacji metodą rubidowo-wapniową
a) roztwór I (T1) (100 ml)

10 mM MOPS pH 7,0
(1 ml 1 M Mops’a )

10 mM RbCl
(10 ml 100 mM RbCl)
b) roztwór II (T2) (20 ml)

0,1 M MOPS pH 6,5
(2 ml 1 M Mops)

50 mM CaCl2
(2 ml 0,5 M CaCl2)

10 mM RbCl
(2ml 100 mM RbCl)
Dodać wody mq do zadanej objętości i sterylizować przez filtrację.
Przygotowanie zamrożonych komórek kompetentnych
1. 35 ul DMSO dodać na każdy 1 ml zawiesiny bakterii w RII
2. wymieszać delikatnie i włożyć do lodu na 15min
3. powtórzyć krok 1 (dodać kolejną porcję DMSO) i włożyć z powrotem do lodu
4. rozdzielić po 200 ul (lub 100) do zimnych, sterylnych eppi i zamrozić (-70C)
w dokładnie opisanym pudełku lub woreczku
użycie zamrożonych komórek kompetentnych
1. rozmrozić potrzebną ilość porcji komórek
2. natychmiast po rozmrożeniu umieścić próbki w lodzie na 10 min
3. przejść do pkt 6 podstawowego protokołu (dodać DNA)
Wersja 2.0 – dodano informacje do jakiego OD hodować (wg Molecular Cloning 3) i
możliwość zamrożenia z DMSO
2.1 – dodano inf o czasie wyrażania i możliwośc zmniejszenia objętości (wg protokołów
konowania Qiagen i stratagene).
2.2 – sprecyzowane rozcieńczenie hodowli nocnej i ilość DNA oraz DMSO)
R.S. I 2012