Monoclonal Mouse Anti-Human Ki-67 Antigen, Clone Ki-67

Monoclonal Mouse Anti-Human Ki-67 Antigen, Clone Ki-67
Nr katalogowy F 0788
Nr katalogowy R 0840
znakowane z FITC
znakowane z RPE
Przeznaczenie
Do diagnostyki in vitro.
F 0788 i R 0840 są przeznaczone do użycia w cytometrii przepływowej. Anti-Ki-67 antigen jest przydatne do oceny proliferacji komórek w
ostrych białaczkach, zespołach limfoproliferacyjnych i raku sutka (1-3). Interpretacji wyników może dokonywać wykwalifikowany patolog w
oparciu o wywiad kliniczny i inne testy diagnostyczne.
Wprowadzenie
Antygen Ki-67 jest białkiem jądrowym określanym przez reaktywność z przeciwciałem monoklonalnym klonu Ki-67 (4, 5). Podczas interfazy,
antygen można wykryć tylko w jądrze, a podczas mitozy większość białka jest przemieszczana na powierzchnię chromosomów (4). Zbadano
już całkowicie sekwencję locus Ki-67. Rozmiar genu wynosi około 30.000 par zasad, zorganizowanych w 15 eksonów o rozmiarach od 67 do
6845 par zasad i w 14 intronów o rozmiarach od 87 do 3569 par zasad. Gen jest ulokowany na chromosomie 10 (6).
Białko Ki-67 ulega ekspresji na komórkach proliferujących podczas późnej fazy G1, S, M i G2 cyklu komórkowego, podczas gdy komórki w fazie G0
(nieproliferujące) trwale nie wykazują jego ekspresji. Niestymulowane ludzkie komórki nie wykazują ekspresji antygenu Ki-67 (4, 5).
Liczne badania wykazały przydatność przeciwciała anti-Ki-67 antigen do oceny stopnia barwienia Ki-67 lub frakcji proliferującej w różnych guzach
litych, przy użyciu metod immunohistochemicznych (4).
Analiza cytometryczna okazała się przydatna do wykrywania antygenu Ki-67 i oceny proliferacji komórek nowotworowych, alternatywnie do oceny
fazy S cyklu komórkowego, ciągłego wbudowywania 3H-tymidyny, barwienia oranżem akrydyny lub bromodeoksyurydyną (7, 8).
Odczynnik dostarczony
Znakowane przeciwciała Anti-Ki-67 Antigen, F 0788 i R 0840, zostały wyprodukowane z oczyszczonych monoklonalnych przeciwciał mysich.
Są one dostarczane w postaci płynnej w buforze zawierającym 1% albuminy z surowicy wołu (BSA) i 15 mmol/L NaN3, o pH 7,2. Każda fiolka
zawiera ilość przeciwciała na 100 oznaczeń (10 L przeciwciała na maksymalnie 106 komórek RAJI).
Izotyp: IgG1, kappa. Stężenie koniugatu mg/L: Zobacz etykietka na fiolce.
Przeciwciało,
nr katalogowy
Fluorochrom
Kontrola negatywna,
nr katalogowy
F 0788
FITC (Fluorescein Isothiocyanate Isomer 1)
X 0927
R 0840
RPE (R-Phycoerythrin)
X 0928
Immunogen
Wstępny ekstrakt jądrowy komórek L428 (4).
Swoistość
Analiza immunohistochemiczna i cytometryczna wykazała, że Anti-Ki-67 Antigen nie reaguje albo reaguje słabo z niestymulowanymi
komórkami od zdrowych dawców (1-3, 5).
Analiza cytometryczna próbek raka sutka wykazała, że Anti-Ki-67 Antigen barwi proliferujące komórki guza (2, 3). Jedne badania, obejmujące
438 przypadków raka sutka wykazały różny poziom ekspresji Ki-67 (1 – 60% ponad poziom normalny) (2). Naciekające raki płacikowe
wykazywały niższą ekspresję antygenu Ki-67 w porównaniu z rakami przewodowymi. Raki rdzeniaste miały najwyższą ekspresję antygenu Ki67. Inne badania na 154 przypadkach raka sutka wykazały poziom ekspresji antygenu Ki-67 ogólny (we wszystkich fazach cyklu życiowego,
G0+G1, S+G2M) i w fazie G1 odpowiednio od 5 – 100% i 2 - 95% (3). W obu badaniach istniała dodatnia korelacja pomiędzy ilością komórek w
fazach S lub S+G2M i barwieniem Ki-67 (2, 3).
Przeciwciało Anti-Ki-67 Antigen reaguje także z proliferującymi komórkami nowotworowymiostrej białaczki limfatycznej (ALL), ostrej białaczki
szpikowej (AML), przewlekłej białaczki szpikowej (CML), przewlekłej białaczki szpikowej w fazie przełomu blastycznego (CML-BC), przewlekłej
białaczki limfocytarnej wywodzącej się z komórek B (B-CLL), białaczki włochatokomórkowej (HCL), białaczki prolimfocytowej (PLL) i
immunocytoma (IC). Wyniki wskazują na wysokie poziomy komórkowe antygenu Ki-67 w ALL (10 - 65%), IC (10 - 44%), B-CLL (do 20%) i
CML-BC (10 – 35%). Białaczka prolimfocytowa i włochatokomórkowa mają niższe poziomy komórkowe antygenu Ki-67 (1).
Środki ostrożności
1. Do stosowania przez osoby przygotowane zawodowo.
2. Produkt zawiera azydek sodowy (NaN3), odczynnik chemiczny silnie toksyczny w czystej postaci. W stężeniu obecnym w produkcie, chociaż nie
klasyfikowanym jako niebezpieczne, azydek sodowy może reagować z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, tworząc silnie
wybuchowe pochodne lub azydki tych metali. Przy usuwaniu odpadów przepłukać spływ dużą ilością wody, aby uniknąć tworzenia się azydków.
3. Jak w przypadku każdego materiału biologicznego należy stosować odpowiednie procedury.
(108346-003)
F 0788/R 0840/PL/SSA/01.03.03 str. 1/2
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
Przechowywanie
Przechowywać w temp. 2-8oC. Nie używać po upływie daty ważności wskazanej na opakowaniu. Jeśli produkt był przechowywany w warunkach
innych niż wskazane, użytkownik musi sprawdzić jakość produktu. Ponieważ nie ma wyraźnych oznak wskazujących na zmianę trwałości
produktu, zawsze należy badać dodatnią i ujemną kontrolę równolegle z próbką badaną. Jeżeli pojawia się nieswoiste barwienie bez zmiany
procedur laboratoryjnych i można podejrzewać, że dzieje się to z winy przeciwciała, należy skontaktować się z serwisem technicznym firmy
Dako.
Procedura barwienia
1.
Zebrać komórki I określić ich całkowitą liczbę. Przemyć dwukrotnie buforem. (W razie potrzeby można stosować tę procedurę z próbkami
pełnej krwi)
2.
Jeżeli jest to przewidziane, wykonać najpierw barwienie antygenów powierzchniowych, używając odpowiednich przeciwciał znakowanych
fluorochromami. Po barwieniu przepłukać komórki jeden raz PBS, odrzucając supernatant. Uwaga: koniugaty znakowane Phycoerythrin
nie nadają się do użycia w tej metodzie.
3.
Dodać Dako IntraStain Reagent A (Fixation), numer katalogowy K 2311, używając 50l na 1x106 komórek. Zmieszać delikatnie,
zawieszając komórki w płynie.
4.
Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
5.
Dodać 500l zimnego (-20C) metanolu absolutnego. Zmieszać delikatnie i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
6.
Dodać 2 mL PBS i zmieszać delikatnie na mieszadle.
7.
Odwirować przy 300 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant zostawiając około 50 L of fluid.
8.
Zmieszać dokładnie na mieszadle aby zawiesić komórki I dodać Dako IntraStain Reagent B (Permeabilization), numer katalowgowy K
2311, używając 50l na 1 x 106 komórek.
9.
Dodać 10 l koniugatu anti-Ki-67 Antigen. Zmieszać delikatnie na mieszadle aby zawiesić komórki.
10.
Użyć niereagującego przeciwciała o tym samym izotypie i znakowanego tym samym fluorochromem jako kontroli ujemnej (patrz tabela).
11. Inkubować w ciemnościach przy 4 C przez 30 minut.
12.
Powtórzyć krok 6 i 7.
13.
Zawiesić komórki w 0,25 mL 0.5% paraformaldehydu (jako utrwalacza) w 0,01 mol/L PBS, o pH 7,4.
14.
Zanalizować na cytometrze przepływowym.
Zaleca się użyć odpowiedniej kontroli dodatniej i ujemnej przy każdym pomiarze dla sprawdzenia odczynnika i przygotowania próbki. Proszę
zwrócić uwagę, że odczynniki znakowane fluorochromami są wrażliwe na światło i próbki powinny być przed nim chronione podczas barwienia
aż do czasu analizy.
Literatura
1.
Drach J, Gattringer C, Glassl H, Schwarting R, Stein H, Huber H. Simultaneous flow cytometric analysis of surface markers and nuclear
Ki-67 antigen in leukemia and lymphoma. Cytometry 1989;10:743-9.
2.
Gorisse M-C, Venteo L, Pluot M. A method for simultaneous quantification of monoclonal antibody Ki-67 and DNA content by flow
cytometry. Application to breast carcinomas. Anal Quant Cytol Histol 1999;21:8-16.
3.
Steck K, Hunt K, Tucker S, Singletary S, El-Naggar AK. Flow cytometric analysis of Ki-67 in invasive ductal carcinoma of the breast:
correlation with tumor and patient characteristics. Oncology Reports 1999;6:835-8.
4.
Scholzen T, Gerdes J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol 2000;182:311-22.
5.
Gerdes J, Schwab U, Lemke H, Stein H. Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated
with cell proliferation. Int J Cancer 1983;31:13-20.
6.
Duchrow M, Schlüter C, Wohlenberg C, Flad H-D, Gerdes J. Molecular characterization of the gene locus of the human cell proliferationassociated nuclear protein defined by monoclonal antibody Ki-67. Cell Prolif 1996;29:1-12.
7.
Keng PC, Siemann DW. Measurement of proliferation activities in human tumor models: a comparison of flow cytometric methods, Radiat
Oncol Invest 1998;6:120-7.
8.
Endl E, Hollmann C, Gerdes J. Chapter 18. Antibodies against the Ki-67 Protein: Assesment of the Growth Fraction and Tools for Cell
Cycle Analysis. In: Darzynkiewicz Z, Crissman HA, Robinson JP, editors. Methods in Cell Biology; Academic Press; 2001 Vol 63 p. 399415.
Objaśnienia symboli
(108346-003)
Numer katalogowy
Temperatura przechowywania
Zużyć przed
Wyrób medyczny do
diagnostyki in vitro
Chronić przed światłem
(sprawdź w rozdz.
przechowywanie)
Producent
Sprawdź w instrukcji
stosowania
Numer serii
F 0788/R 0840/PL/SSA/01.03.03 str. 2/2
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17