FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Mast Cell Tryptase

FLEX
Monoclonal Mouse
Anti-Human
Mast Cell Tryptase
Klon AA1
Ready-to-Use
(Link)
Nr kat. IR640
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
Przeciwciało FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human Mast Cell Tryptase, Klon AA1, Ready-to-Use (Link), jest
przeznaczone do stosowania w immunohistochemii w aparatach Autostainer Link. Przeciwciało to znakuje ludzkie
komórki tuczne (mastocyty) i jest przydatne w identyfikacji bardzo nietypowych lub niedojrzałych komórek tucznych
(KT) w białaczce komórek tucznych oraz wykrywaniu małych, nawet drobnych, gęstych skupionych nacieków KT w
procedurach klasyfikacji stopnia zaawansowania u pacjentów o stwierdzonej mastocytozie skórnej (1). Interpretacja
kliniczna wystąpienia lub braku barwienia musi być uzupełniona przez badania morfologiczne z wykorzystaniem
odpowiednich prób kontrolnych i powinna być przeprowadzana przez doświadczonego patologa z uwzględnieniem
historii choroby pacjenta i innych badań diagnostycznych.
Podsumowanie
i wyjaśnienie
Ludzkie tryptazy komórek tucznych (EC 3.4.21.59) tworzą rodzinę trypsynopodobnych obojętnych proteaz serynowych,
których ekspresja zachodzi głównie w komórkach tucznych (2). W formie aktywnej enzymatycznie tryptaza komórek
tucznych tworzy niepołączony wiązaniami kowalencyjnymi tetramer o masie 132 kDa (2, 3). Tryptaza komórek tucznych
jest zdolna do degradacji wazoaktywnego peptydu jelitowego i aktywacji prekalikreiny oraz generowania kinin, waŜnych
mediatorów biorących udział w zwęŜaniu oskrzeli oraz nadreaktywnością dróg oddechowych, stanowiących istotne
elementy alergicznych chorób dróg oddechowych (2). Komórki tuczne aktywowane są przez róŜnorakie bodźce, w tym
antygeny, nadtlenki, białko dopełniacza, neuropeptydy i lipoproteiny, czego efektem jest aktywacja i degranulacja.
Komórki tuczne odgrywają aktywną rolę w tak zróŜnicowanych chorobach jak miaŜdŜyca, astma, zapalenie stawów,
zwłóknienie przewodów Ŝółciowych, złośliwy rak i zwłóknienie płucne (4, 5).
Identyfikacja komórek tucznych za pomocą wybarwiania tkanek przeciwciałami swoistymi dla tryptazy ludzkich
komórek tucznych jest przydatna w identyfikacji skupionych i rozproszonych nacieków komórek tucznych w
pierwotnej chorobie komórek tucznych i mastocytozie. Wykazanie obecności tryptazy komórek tucznych jest
kluczowe dla identyfikacji wysoce nietypowych, z niedoborem granulacji lub nawet niemetachromatycznych komórek
tucznych, w szczególności w białaczce komórek tucznych, oraz w celu wykrywania małych lub drobnych nacieków
komórek tucznych (1).
Patrz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub następujące
części instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasady procedury, 2) Niezbędne materiały niedostarczone z zestawem,
3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie odczynu, 6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie
problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody.
Odczynnik
dostarczony
Gotowe do uŜycia mysie przeciwciała monoklonalne są dostarczane w postaci ciekłej w buforze zawierającym białko
stabilizujące i azydek sodu o stęŜeniu 0,015 mol/L.
Klon: AA1 (3). Izotyp: IgG1, kappa.
Immunogen
Tryptaza komórek tucznych wyizolowana z ludzkich płuc (3).
Swoistość
W badaniu techniką Western blot bogatego w tryptazę ekstraktu ludzkich płuc w warunkach redukujących
przeciwciało znakuje pasmo o masie około 32,5 kDa, odpowiadające tryptazie ludzkich komórek tucznych (3).
W pośrednim badaniu ELISA przeciwciało reaguje z oczyszczoną tryptazą ludzkich komórek tucznych (3).
Wiązanie przeciwciała do tryptazy komórek tucznych nie wpływa na aktywność enzymu (3).
Poddanie tryptazy komórek tucznych działaniu nadjodanu nie ma wpływu na znakowanie przeciwciałem co
wskazuje, Ŝe w rozpoznawaniu przeciwciała nie biorą udziału epitopy wodorowęglanowe. Na rozpoznawanie
przeciwciała nie ma teŜ wpływu obecność heparyny (3).
Środki ostroŜności
1. Do stosowania przez wyszkolony personel.
2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek sodu,
zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe reagować z
elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków
metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji.
3. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych, naleŜy stosować
właściwe procedury postępowania.
4. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne.
5. Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi rozporządzeniami.
Przechowywanie
Przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie stosowa ć po upływie terminu waŜności podanego na fiolce. Jeśli
odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane powyŜej, uŜytkownik musi zweryfikować takie
warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem
próbek pochodzących od pacjenta naleŜy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne. W wypadku nieoczekiwanego
wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem
z przeciwciałem, naleŜy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
(117837-002)
Dako Denmark A/S
IR640/PL/MNI/2009.12.04 str. 1/2
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
Przygotowanie
próbek
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie.
Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o wymiarach około 4 µm.
Wymagane jest poddanie cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER) z uŜyciem Dako PT Link (nr kat.
PT100/PT101). Szczegółowe instrukcje zawiera Instrukcja uŜytkownika aparatu PT Link. Optymalne wyniki uzyskuje
się w wyniku wstępnej obróbki tkanek przy uŜyciu roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH
(50x) (nr kat. K8000/K8004).
Skrawki zatapiane w parafinie: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych, zalecana jest procedura 3 w 1 z uŜyciem odczynnika Dako PT Link. Postępować według procedury
wstępnej obróbki tkanek, zamieszczonej w ulotce roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x)
(nr kat. K8000/K8004). Uwaga: Po przeprowadzeniu barwienia skrawki muszą być odwodnione, oczyszczone
zakryte za pomocą środka do trwałego zatapiania.
Odparafinowane skrawki: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych, zalecane jest uŜycie odczynnika Dako PT Link i przeprowadzenie procedury opisane dla skrawków
parafinowych. Po zakończeniu barwienia szkiełka naleŜy zatopić w wodnym lub trwałym środku do zatapiania.
W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny
wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych, zaleca się stosowanie
szkiełek FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020).
Procedura barwienia
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX, High pH (Link) (nr kat. K8000). W systemie Autostainer Link
wstępnie zaprogramowano etapy odczynu i czasy inkubacji. Zalecana objętość uŜytego odczynika to 1 x 200 µL lub
2 x 150 µL na preparat. Szczegółowe informacje dotyczące wkładania szkiełek mikroskopowych i odczynników
przedstawiono w Instrukcji uŜytkownika aparatu Autostainer Link. Jeśli protokoły nie są dostępne w uŜywanym
systemie Autostainer, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Wszystkie procedury
inkubacji naleŜy równieŜ przeprowadzać w temperaturze pokojowej.
Optymalne warunki mogą zmieniać w zaleŜności od rodzaju materiału i sposobów jego przygotowania i powinny być
określone indywidualnie w kaŜdym laboratorium. JeŜeli patolog oceniający preparat Ŝyczy sobie wybarwienia innym
natęŜeniu, czasy inkubacji oraz uŜycie szablonów wizualizacji EnVision FLEX/EnVision FLEX+ mogą zostać
zmienione. W celu uzyskania informacji dotyczącej zmiany programowania protokołu, naleŜy skontaktować się z
działem obsługi/obsługą techniczną firmy Dako. NaleŜy upewnić się, Ŝe działanie zmodyfikowanego protokołu jest
prawidłowe – w tym celu naleŜy ocenić, czy odczyn jest taki jak opisany w części „Charakterystyka wydajnościowa”.
Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną przy uŜyciu EnVision FLEX Hematoxylin, (Link) (nr kat. K8008).
Zaleca się stosowanie niewodnego, trwałego środka do zatapiania.
Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby
kontrolne z uŜyciem identycznego protokołu. Dodatnia kontrola tkankowa powinna obejmować migdałki, natomiast
we wszystkich dodatnich preparatach komórki/struktury powinny wskazywać odczyn reakcji taki jak opisany dla tej
tkanki w części „Charakterystyka wydajnościowa”. Zalecana kontrola ujemna to FLEX Negative Control, Mouse
(Link) (nr kat. IR750).
Interpretacja
wybarwienia
Komórki znakowane przez przeciwciało wykazują ziarnisty odczyn cytoplazmatyczny (6).
Charakterystyka
działania
Tkanki normalne: Przeciwciało znakuje swoiście komórki tuczne (KT) w licznych tkankach ludzkich, w tym w płucach,
migdałkach, okręŜnicy, śluzówce przewodu pokarmowego i skórze, natomiast bardzo nieliczne komórki tuczne
wykryto w przysadce mózgowej. Przeciwciało nie znakuje bazofili ani Ŝadnych innych leukocytów prawidłowej krwi,
nie zaobserwowano teŜ znakowania w keratynocytach (6). Komórki tuczne w migdałkach wykazują odczyn z zakresu
od umiarkowanego do silnego.
Tkanki patologiczne: W badaniu ponad 150 przypadków róŜnych zaburzeń KT wykazano, Ŝe <4 KT/mm2 oznaczono
w szpiku kostnym w większości stanów prawidłowych i reaktywnych, natomiast >5 ale <100 oznaczono w zespołach
mielodysplazji. Ponad 100 KT/mm2 wykryto w nowotworach KT, często obserwowano takŜe przypadki ze znacznie
większą liczbą (maksymalnie 2655 KT/mm2) (1).
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Horny H-P, Valent P. Diagnosis of mastocytosis: general histopathological aspects, morphological criteria, and
immunohistochemical findings. Leuk Res 2001:25;543-51.
Abraham WM. Tryptase: potential role in airway inflammation and remodelling. Am J Physiol Lung Cell Mol
Physiol 2002;282:L193-L196.
Walls AF, Bennett AR, McBride HM, Glennie MJ, Holgate ST, Church MK. Production and characterization of
monoclonal antibodies specific for human mast cell tryptase. Clin Exp Allergy 1990;20:581-9.
Krishnaswamy G, Kelley J, Johnson D, Youngberg D, Stone W, Huang S-K, et al. The human mast cell:
functions in physiology and disease. Front Biosci 2001;6:D1109-27.
Koda W, Harada K, Tsuneyama K, Kono N, Sasaki M, Matsui O, et al. Evidence of the participation of
peribiliary mast cells in regulation of the peribiliary vascular plexus along the intrahepatic biliary tree. Lab Invest
2000;80:1007-17.
Walls AF, Jones DB, Williams JH, Church MK, Holgate ST. Immunohistochemical identification of mast cells in
formaldehyde-fixed tissue using monoclonal antibodies specific for tryptase. J Pathol 1990:162:119-26.
Obja śnienie s ym boli
Nume r kata lo go wy
Temp era tu ra p rzec ho wywa ni a
Zu Ŝyć p rzed
Wyr ób me dycz ny d o
d ia gn ostyki i n vi tro
Zawa rtość wystarcz a na <n >
te stów
Prod uce nt
Sp ra wdz ić w i nstru kcji
sto sow an ia
Nu mer se rii
(117837-002)
Dako Denmark A/S
IR640/PL/MNI/2009.12.04 str. 2/2
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Faks +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17