FLEX Polyclonal Rabbit Anti-Human IgA Ready-to-Use (Dako Autostainer/Autostainer Plus) Nr kat. IS510 Przeznaczenie Do stosowania w diagnostyce in vitro. Przeciwciała FLEX Polyclonal Rabbit Anti-Human IgA, Ready-to-Use, (Dako Autostainer/Autostainer Plus), są przeznaczone do stosowania w immunohistochemii w aparatach Dako Autostainer/Autostainer Plus. Przeciwciała te są przydatne w identyfikacji komórek plazmatycznych i pokrewnych komórek limfoidalnych zawierających IgA. Są uŜytecznym narzędziem do klasyfikacji pacjentów z powstającymi nowotworami z komórek B (1–3). Ponadto przeciwciało moŜna wykorzystać do róŜnicowania nowotworowej, monoklonalnej poliferacji z reaktywnego rozrostu komórek plazmatycznych (1, 4). Interpretacja kliniczna dodatniego lub ujemnego odczynu musi być uzupełniona przez ocenę morfologiczną, wykonanie odpowiednich prób kontrolnych i interpretowana przez doświadczonego patologa w kontekście historii choroby pacjenta i innych badań diagnostycznych. Streszczenie i informacje ogólne Ludzkie immunoglobuliny składają się głównie z dwóch identycznych łańcuchów cięŜkich (Mr ok. 50 000) i dwóch identycznych łańcuchów lekkich (Mr ok. 20 000). Cztery łańcuchy są związane wiązaniami kowalencyjnymi za pomocą wiązań dwusiarczkowych. Łańcuchy lekkie są typu kappa lub lambda. Pięć immunoglobulin, IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, róŜni się w zaleŜności od łańcuchów cięŜkich. Immunoglobuliny IgA i IgM występują takŜe w formach polimerycznych. Łańcuch cięŜki immunoglobuliny IgA jest łańcuchem typu alfa. W surowicy ok. 80 % immonoglobulin IgA jest monomeryczna, natomiast w wydzielinach, takich jak ślina, śluz jelitowy i oskrzeli, wydzielina nosowa, pot, mleko i siara, główną formą jest wydzielnicza dimeryczna immunoglobulina IgA (sIgA). Ponadto 4 łańcuchy lekkie i 4 łańcuchy alfa dimerycznej sIgA takŜe zawierają łańcuchy J i składnik wydzielniczy. Ten drugi chroni sIgA przed proteazą wydzielniczą. Masa cząsteczkowa dimetrycznej sIgA wynosi 390 000 (5). Prawidłowa populacja komórek B jest poliklonalna i wykazuje ekspresję zakresu róŜnych cząsteczek immunoglobulin. Większość powstających nowotworów z komórek B jest charakteryzowana przez proliferację komórek monoklonalnych wykazujących ekspresję tylko jednego typu łańcucha lekkiego, natomiast ta sama komórka moŜe wykazywać ekspresję więcej niŜ jednego typu łańcucha cięŜkiego. Ograniczona ekspresja immunoglobulin przez poliferacje linii komórkowej monoklonalnych komórek B powoduje, Ŝe przeciwciała stają się swoiste dla łańcuchów lekkich i cięŜkich immunoglobulin przydatnych do identyfikacji i oznaczania izotypowego tych powstających nowotworów (6). Zobacz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub następujące części instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasada przeprowadzenia odczynu, 2) Niezbędne materiały niedostarczone z zestawem, 3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie barwienia, 6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie problemów, 8) Interpretacja wyniku barwienia, 9) Ograniczenia metody. Dostarczany odczynnik Gotowe do uŜycia królicze przeciwciała poliklonalne są dostarczane w postaci ciekłej w buforze zawierającym białko stabilizujące i roztwór NaN3 o stęŜeniu 0,015 mol/L. Immunogen IgA wyizolowane z puli prawidłowych surowic ludzkich. Swoistość Przeciwciało reaguje z łańcuchami alfa ludzkiej immunoglobuliny IgA. Ślady zanieczyszczeń przeciwciałami usunięto przez absorpcję w fazie stałej z innymi białkami ludzkiego osocza. Swoistość tych przeciwciał określono następująco: Immunoelektroforeza krzyŜowa: Przy uŜyciu 12,5 µL roztworu stęŜonego przeciwciała na cm2 Ŝelu i 2 µL ludzkiego osocza pojawia się wyłącznie osad IgA. Barwnik: Coomassie Brilliant Blue. ELISA: W testach prowadzonych pośrednią metodą ELISA, z ludzkimi immunoglobulinami IgG lub IgM uŜywanymi w charakterze antygenów powlekających, nie obserwuje się istotnej reaktywności. W testach ELISA z antygenem uwięzionym między przeciwciałami (sandwich) nie obserwuje się istotnych reakcji z ludzkim osoczem pozbawionym IgA. Środki ostroŜności 1. Odczynniki przeznaczone dla przeszkolonych UŜytkowników. 2. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek — azydek sodu (NaN3), w czystej postaci. StęŜenie NaN3 występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w wyniku reakcji NaN3 z ołowiem lub miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe azydki metali. Przy usuwaniu resztek odczynnika uŜywać duŜych ilości wody do przepłukiwania, aby uniknąć gromadzenia się azydków w instalacji kanalizacyjnej. 3. Podobnie jak w przypadku kaŜdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, naleŜy stosować odpowiednie procedury postępowania. 4. NaleŜy stosować właściwe wyposaŜenie ochronne, zabezpieczające przed kontaktem odczynnika ze skórą bądź oczami. 5. Niewykorzystany odczynnik naleŜy usuwać zgodnie ze stosownymi przepisami lokalnymi i krajowymi. Przechowywanie Przechowywać w temperaturze 2–8 °C. Nie stosowa ć po upływie terminu waŜności podanego na opakowaniu. JeŜeli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane na ulotce dołączanej do opakowania, uŜytkownik powinien je zweryfikować. Nie ma jednoznacznych oznak świadczących o niestabilności produktu. Z tego względu jednocześnie z badaniem próbek pochodzących od pacjentów, naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne. W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z przeciwciałem, naleŜy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako. (116682-002) Dako Denmark A/S IS510/PL/MNI/2009.12.04 s. 1/3 | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17 Przygotowanie próbek oraz materiały wymagane, ale niedostarczane Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie. Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o wymiarach około 4 µm. Wymagane jest poddanie cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER) z uŜyciem Dako PT Link (nr kat. PT100/PT101). Szczegółowe instrukcje zawiera Instrukcja uŜytkownika aparatu PT Link. Optymalne wyniki uzyskuje się w wyniku wstępnej obróbki tkanek przy uŜyciu roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (nr kat. K8000/K8004). Skrawki zatapiane w parafinie: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków tkankowych, zalecana jest procedura 3 w 1 z uŜyciem odczynnika Dako PT Link. Postępować według procedury wstępnej obróbki tkanek, zamieszczonej w ulotce roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (nr kat. K8000/K8004). Uwaga: Po przeprowadzeniu barwienia skrawki muszą być odwodnione, oczyszczone zakryte za pomocą środka do trwałego zatapiania. Odparafinowane skrawki: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków tkankowych, zalecane jest uŜycie odczynnika Dako PT Link i przeprowadzenie procedury opisane dla skrawków parafinowych. Po zakończeniu barwienia szkiełka naleŜy zatopić w wodnym lub trwałym środku do zatapiania. W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych, zaleca się stosowanie szkiełek FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020). Wykonanie odczynu oraz materiały wymagane, ale niedostarczane Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX, High pH (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8010). Oprogramowanie aparatów Dako Autostainer/Autostainer Plus zawiera wstępnie zaprogramowane etapy odczynu i czas barwienia, które są aktywne podczas korzystania z następujących protokołów: Protokół wzorcowy: FLEXRTU2 (dawka odczynnika 200 µL) lub FLEXRTU3 (dawka odczynnika 300 µL) Autoprogram: IgA (bez barwienia kontrastowego) lub IgAH (z barwieniem kontrastowym) Dla etapu „Auxiliary” naleŜy ustawić opcję „rinse buffer” w programach barwienia ≤10 szkiełek. Przy programach z więcej niŜ 10 szkiełkami, etap „auxiliary” naleŜy ustawić na „none”. Zapewnia to porównywalne czasy płukania. Wszystkie procedury inkubacji naleŜy równieŜ przeprowadzać w temperaturze pokojowej. Szczegółowe informacje zawiera instrukcja obsługi odpowiedniego aparatu. Jeśli protokoły nie są dostępne w uŜywanym aparacie Autostainer, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Optymalne warunki mogą się zmieniać w zaleŜności od rodzaju materiału i sposobu jego przygotowania i powinny być określone indywidualnie w kaŜdym laboratorium. Aby moŜliwe było wykonanie oceny przez patologów z róŜnym nasileniem odczynu preparatów, naleŜy skontaktować się z działem obsługi/obsługą techniczną firmy Dako w celu uzyskania informacji dotyczącej zmiany programowania protokołu. NaleŜy upewnić się, Ŝe działanie zmodyfikowanego protokołu jest prawidłowe — w tym celu naleŜy ocenić, czy odczyn jest taki jak opisany w części „Charakterystyka wydajnościowa”. Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną za EnVision FLEX Hematoxylin (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8018). Zaleca się stosowanie bezwodnego, trwałego środka do zatapiania. Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne z uŜyciem identycznego protokołu. Dodatnia kontrola tkankowa powinna obejmować migdałki, natomiast we wszystkich dodatnich preparatach komórki/struktury powinny wskazywać odczyn reakcji taki jak opisany dla tej tkanki w części „Charakterystyka wydajnościowa”. Zalecana kontrola ujemna to FLEX Negative Control, Rabbit (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. IS600). Interpretacja odczynu Odczyn komórkowy ma charakter cytoplazmatyczny i/lub błonowy. Charakterystyka wydajnościowa Tkanki prawidłowe: Przeciwciała przeciwko IgA wykrywają IgA w komórkach plazmatycznych węzłów chłonnych i migdałków, w zewnętrznych wydzielinach gruczołów surowiczo-śluzowych (ślinie, łzach, wydzielinie nosowej, siarze i wydzielinach płuc) oraz wydzielinach wewnętrznych (maziówce, płynie owodniowym, płynie mózgowo-rdzeniowym, wydzielinach Ŝołądka i jelit) (7,8). Tkanki nieprawidłowe: W dwóch badaniach przebadano 33 (2) i 29 (3) tkanek utrwalonych w formalinie powstających nowotworów z komórek plazmatycznych róŜnych typów. Odczyn dodatni z przeciwciałami wykazał dobrą korelację z monoklonalnymi immunoglobulinami w surowicy lub moczu. Wystąpiło wyraźne rozróŜnienie między reaktywnym rozrostem komórek i powstawaniem nowotworu z monoklonalnych komórek B, gdy uŜywane było przeciwciało wraz z panelem innych przeciwciał do immunoglobulin (2), a zwłaszcza z przeciwciałami do łańcuchów lekkich (5). Piśmiennictwo 1. Taylor CR, Burns J. The demonstration of plasma cells and other immunoglobulin-containing cells in formalinfixed, paraffin-embedded tissues using peroxidase-labeled antibody. J Clin Pathol 1974;27:14-20. 2. Taylor CR, Mason DY. The immunohistological detection of intracellular immunoglobulin in formalin-paraffin sections from multiple myeloma and related conditions using the immunoperoxidase technique. Clin exp Immunol 1974;18:417-29. 3. Taylor CR, Russell R, Chandor S. An immunohistologic study of multiple myeloma and related conditions, using an immunoperoxidase method. Am J Clin Pathol 1978;70:612-22. 4. Beschorner R, Horny H-P, Petrusch UR, Kaiserling E. Frequent expression of haemopoietic and non-haemopoietic antigens by reactive plasma cells: an immunohistochemical study using formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Histol Histopathol 1999;14:805-12. 5. Klein J, Hořejši V. Immunology. 2nd ed. Abingdon (UK): Blackwell Science Ltd; 1999. p. 226–7, 238–46. 6. Leong ASY, Cooper K, Leong FJWA. Manual of diagnostic antibodies for immunohistology. London: Oxford University Press; 1999. p. 217–9. 7. Curran RC, Gregory J. Demonstration of immunoglobulin in cryostat and paraffin sections of human tonsil by immunofluorescence and immunoperoxidase techniques. Effects of processing on immunohistochemical performance of tissues and on the use of proteolytic enzymes to unmask antigens in sections. J Clin Pathol 1978; 31:974. 8. Brandtzaeg P, Baklien K. Immunoglobulin-producing cells in the intestine in health and disease. Clin Gastroenterol 1976; 5(2):251. (116682-002) Dako Denmark A/S IS510/PL/MNI/2009.12.04 s. 2/3 | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17 Objaśnienie symboli Numer katalogowy Temperatura przechowywania ZuŜyć przed Wyrób medyczny do diagnostyki in vitro Zawartość wystarcza na <n> testów Producent Sprawdzić w instrukcji stosowania Numer serii (116682-002) Dako Denmark A/S IS510/PL/MNI/2009.12.04 s. 3/3 | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17