Polyclonal Rabbit Anti-Human IgA/FITC Rabbit F(ab`)2 Nr

Polyclonal Rabbit
Anti-Human IgA/FITC
Rabbit F(ab’)2
Nr kat. F0188
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
F0188 jest przeznaczony do stosowania w cytometrii przepływowej. W cytometrii przepływowej, przeciwciała
przeciwko IgA są przydatne do wykazania obecności IgA na powierzchni komórki, a zatem do podtypowania w
chorobach limfoproliferacyjnych limfocytów B – z panelem innych przeciwciał (1-5). Interpretację wyników
powinien przeprowadzić pracownik uprawniony do wykonywania takich badań w oparciu o historię choroby
pacjenta oraz inne testy diagnostyczne.
Wstęp
Większość limfocytów B, z wyjątkiem komórek progenitorów pre-B i komórek pre-B, jak równieŜ dojrzałych
komórek plazmatycznych, wykazuje ekspresję immunoglobuliny na swojej powierzchni. Komórki pre-B
wykazują ekspresję cytoplazmatyczną łańcuchów-µ natomiast nie wykazują ekspresji lekkich łańcuchów,
podczas gdy wczesne postacie limfocytów B wykazują jedynie ekspresję błony IgM. Dojrzewające limfocyty B
dodatkowo produkują IgD, która zostaje wprowadzona do błony komórkowej łącząc się z IgM i tworząc
populację IgM+IgD+ limfocytów B, największą populację limfocytów B krąŜących w organizmie człowieka.
Kolejne przegrupowanie stałego regionu genów cięŜkiego łańcucha immunoglobuliny powoduje ekspresję IgG
lub IgA na błonie początkowo zgodną z IgM lub IgD. Kontakt z antygenem aktywuje produkcję takich komórek.
Mogą one ewoluować z mniej dojrzałych prekursorów B podczas początkowej reakcji lub z komórek pamięci
podczas wtórnej reakcji (6). Komórki przewlekłej białaczki limfatycznej B-komórkowej (B-CLL) są powszechnie
dodatnie zarówno dla powierzchniowej IgM i IgD, natomiast komórki dodatnie dla powierzchniowej IgA
obserwowano w 0-8% przypadków (2-5).
Odczynnik dostarczony
Koniugat Anti-IgA o numerze kat. F0188 został wyprodukowany z fragmentu F(ab')2 króliczego przeciwciała
poliklonalnego wyizolowanego na drodze chromatografii powinowactwa. Koniugat jest dostarczany w postaci
płynnej w buforze zawierającym 1% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) oraz 15 mmol/L NaN3 o pH 7,2.
Jedna fiolka F0188 zawiera 100 testów (10 µL F0188 przeznaczone jest dla maksymalnie 106 leukocytów z
normalnej ludzkiej krwi obwodowej).
StęŜenie koniugatu g/L: Patrz: informacja podana na etykiecie fiolki.
Przygotowanie
Przeciwciało
nr kat.
Fluorochrom
Kontrola ujemna
nr kat.
F0188
FITC (Fluorescein Isothiocyanate Isomer 1)
X0929
1.
Przeciwciało uŜyte do skoniugowania z FITC zostało poddane absorpcji w fazie stałej, z białkami osocza
ludzkiego, w celu usunięcia niepoŜądanych przeciwciał.
2.
Zaabsorbowane przeciwciało zostało następnie oczyszczone na drodze chromatografii powinowactwa na
kolumnie z immobilizowaną ludzką IgA.
3.
Przeciwciało wyizolowane na kolumnie zostało następnie poddane degradacji z uŜyciem pepsyny i
fragmentu F(ab')2 wyizolowanego przez filtrację na Ŝelu.
4.
Na koniec, fragment F(ab')2 został skoniugowany z izomerem 1 izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC).
Immunogen
IgA wyizolowana z puli ludzkiej surowicy.
Swoistość
Przeciwciało Anty-IgA reaguje z łańcuchami-α ludzkiego IgA. Swoistość stwierdzono poniŜszymi metodami. W
celu uzyskania maksymalnej czułości, przed oczyszczaniem na kolumnie i degradacją pepsyną wykonano testy
swoistości metodą immunoelektroforezy krzyŜowej i testem ELISA.
Immunoelektroforeza krzyŜowa: W testach prowadzonych dla przeciwciał w obecności osocza ludzkiego
pojawia się tylko łuk precypitacyjny związany z IgA. Barwienie: Barwnik Coomassie Briliant Blue.
ELISA: Stosując test ELISA pośredni, nie obserwowano znaczącej reakcji z ludzkimi IgG i IgM. Stosując test
ELISA typu „sandwich” z dwoma przeciwciałami, nie obserwowano istotnych reakcji z ludzkim osoczem
pozbawionym IgA.
Cytometria przepływowa: Podczas testów na komórkach ludzkich migdałków przeciwciało Anti-IgA znakowało
subpopulację komórek CD 19-dodatnich.
Analiza cytometryczna limfocytów krwi obwodowej wykazała, Ŝe przeciwciało Anti-IgA znakuje część B-CLL. W
jednym badaniu, na 165 przypadków (4), 13 było dodatnich w zakresie IgA.
Środki ostroŜności
1. Do stosowania przez wyszkolony personel.
2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek
sodu, zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe reagować
z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych
azydków metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w
kanalizacji.
3. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych naleŜy stosować
właściwe procedury postępowania.
4. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne.
5. Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi rozporządzeniami.
Przechowywanie
(107770-002)
Przechowywać w ciemnym miejscu w temp. 2-8 °C. Nie uŜywać po upłynięciu daty waŜności podanej na
etykiecie fiolki. Jeśli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane powyŜej, uŜytkownik musi
F0188/PL/LHP/2009.11.30 s. 1/2
Dako Denmark A/S | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
zweryfikować takie warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na utratę stabilności produktu. Dlatego
jednocześnie z badaniem próbek pacjenta naleŜy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne. W trakcie
przechowywania moŜe wytrącić się niewielki osad powodując nieswoiste barwienie z utworzeniem drobnych
granulek. Początkową, wysoką jakość koniugatu moŜna odzyskać przez odfiltrowanie (filtr z octanu celulozy
0,22 µm). Nie przechowywać rozcieńczonych koniugatów. W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu,
którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z
przeciwciałem, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
Uwagi dotyczące procedury Przed rozpoczęciem barwienia próbek krwi obwodowej, komórki jednojądrzaste naleŜy wyizolować przez
odwirowanie na podłoŜu rozdzielającym bądź przepłukanie próbki w celu usunięcia rozpuszczalnych białek
surowicy. PoniewaŜ ludzkie monocyty wiąŜą immunoglobuliny surowicy przez receptory powierzchniowe Fc,
komórki te naleŜy usunąć lub zidentyfikować.
Procedura barwienia
1.
Pobrać krew Ŝylną do probówki z antykoagulantem.
2.
Przenieść do probówki 100 µL krwi z antykoagulantem.
3.
Dodać 2 mL 0,01 mol/L PBS o pH 7,4. Delikatnie wymieszać przy pomocy wytrząsarki.
4.
Wirować 300 x g przez 5 minut następnie zassać supernatant pozostawiając około 50 µL płynu.
5.
Powtórzyć jeszcze dwa razy etapy 3 i 4.
6.
Dodać 10 µL frakcji immunoglobulin króliczych, nr kat. X0903, w celu zablokowania reakcji. Delikatnie
wymieszać przy pomocy mieszadła; inkubować w ciemności w temp. 37°C, przez 30 minut.
7.
Dodać 10 µL fluorochromu skoniugowanego z przeciwciałem dla IgA. Delikatnie wymieszać.
8.
Jako kontrolę ujemną zastosować niereaktywny fragment
skoniugowany z tym samym fluorochromem (zob. tabela).
9.
Inkubować w ciemności w temp. 4 °C przez 30 minut.
10.
Do kaŜdej probówki dodać 1-2 mL czynnika hemolizującego erytrocyty; delikatnie wymieszać. W
odniesieniu do czasu i temperatury inkubacji postępować według zaleceń producenta.
11.
Wirować przy 300 x g przez 5 minut.
12.
Zassać supernatant, pozostawiając około 50 µL płynu.
13.
Dodać 2 mL 0,01 mol/L PBS o pH 7,4. Delikatnie wymieszać przy pomocy wytrząsarki.
14.
Powtórzyć etapy 11 i 12.
15.
Ponownie przygotować granulkę w zawiesinie, w płynie odpowiednim dla analizy cytometrycznej, np. w
0,3 mL 1% paraformaldehydu (utrwalacz) w 0,01 mol/L PBS o pH 7,4.
16.
Analizować na cytometrze przepływowym.
F(ab’)2
króliczych
immunoglobulin,
Dla zapewnienia kontroli odczynników i przygotowania próbek zalecane jest stosowanie podczas kaŜdego testu
odpowiednich próbek kontroli dodatniej i ujemnej. NaleŜy pamiętać, Ŝe koniugaty fluorochromu są wraŜliwe na
działanie światła, dlatego podczas procedury barwienia i do chwili wykonania analizy naleŜy chronić próbki
przed działaniem światła.
Piśmiennictwo
1.
van Dongen JJM, Adriaansen HJ. Immunobiology of leukaemia. In: Henderson ES, Lister TA, Greaves
MF, editors. Leukemia. Philadelphia, London, Toronto, Montreal, Sydney, Tokyo: WB Saunders
Company; 1996. p. 83-130.
2.
Geisler CH, Larsen JK, Hansen NE, Hansen MM, Christensen BE, Lund B, et al. Prognostic importance
of flow cytometric immunophenotyping of 540 consecutive patients with B-cell chronic lymphocytic
leukemia. Blood 1991;78:1795-1802.
3.
Gandini D, Lanza F, Latorraca A, Levato F, Del Senno L, Castoldi G. Immunophenotypic and genotypic
characterization of B-cell chronic lymphocytic leukemia patients from Northern Italy. Haematologica
1993;78:18-24.
4.
Batata A, Shen B. Immunophenotyping of subtypes of B-chronic (mature) lymphoid leukemia. A study of
242 cases. Cancer 1992;70:2436-43.
5.
Shen PUF, Fuller SG, Rezuke WN, Sherburne BJ, DiGiuseppe JA. Laboratory, morphologic, and
immunophenotypic correlates of surface immunoglobulin heavy chain isotype expression in B-cell chronic
lymphocytic leukemia. Am J Clin Pathol 2001;116:905-12.
6.
Deegan MJ. B lymphocytes and plasma cells: their development and identification. In: Keren DF, editor.
Flow cytometry in clinical diagnosis. Chicago: ASCP Press; 1989. p. 139-6.
Objaśnienie sym boli
(107770-002)
Numer katalogo wy
Temperatura przechowywania
Zu Ŝyć przed
Wyrób medyczny do
diagnostyki in vi tro
Chronić przed światłem
Producent
Sprawdzić w instrukcji
stosowania
Numer serii
F0188/PL/LHP/2009.11.30 s. 2/2
Dako Denmark A/S | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17