Monoclonal Mouse

MultiMix™
Triple-Colour Reagent
Anti-Human CD13/FITC
Anti-Human HLA-DR Antigen/RPE
Anti-Human CD117/APC
Nr kat. TC685
Przeznaczenie
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Odczynnik TC685 przeznaczony jest do stosowania w cytometrii przepływowej. Odczynnik jest przeznaczony
do stosowania w identyfikacji komórek wykazujących ekspresję CD13, antygenu HLA-DR i CD117.
Ekspresja CD13 zachodzi na powierzchni zdeterminowanych progenitorów granulocytowo-monocytowych
(CFU-GM) oraz w komórkach z linii granulocytów i monocytów na wszystkich etapach różnicowania, jak
również w nowotworowych odpowiednikach tych komórek (1, 2). Ekspresja antygenu zachodzi także w
niewielkim odsetku dużych limfocytów ziarnistych, nie zachodzi jednak w żadnych innych limfocytach. Ponadto
CD13 występuje w niektórych tkankach niekrwiotwórczych (1-4).
Antygen HLA-DR wykazuje konstytutywną ekspresję w komórkach ujawniających obecność antygenów, takich
jak limfocyty B, monocyty i komórki dendrytyczne, jego ekspresja może jednak również zachodzić w
aktywowanych limfocytach T i aktywowanych granulocytach (5, 6). Niekiedy ekspresja antygenu HLA-DR
zachodzi w naturalnych komórkach cytotoksycznych (NK) (1). Ekspresję antygenu stwierdzano w przypadkach
różnych typów ostrych białaczek limfoblastycznych, ostrych białaczek szpikowych (AML) z wyjątkiem AML-M3,
przewlekłych białaczek z komórek T, przewlekłych białaczek szpikowych (CML) oraz białaczek nieziarniczych
z komórek B i T (1, 7).
Białko CD117 jest przydatne w identyfikacji białaczek AML oraz w klasyfikacji białaczek (8–10). CD117 jest
markerem komórek tucznych tkanek, krwiotwórczych komórek macierzystych i komórek progenitorowych
w prawidłowych ludzkim szpiku kostnym. W większości (50–70%) CD117-dodatnich komórek szpiku równolegle
zachodzi ekspresja CD34. Należą do nich komórki progenitorowe i ich prekursory wszystkich linii
hematopoetycznych (10).
Odczynnik TC685 nie jest przeznaczony do określania typów tkanek. Interpretacji wyniku — z uwzględnieniem
kontekstu klinicznego oraz wyników innych metod diagnostycznych — powinien dokonać wykwalifikowany
patolog.
Dostarczany odczynnik
TC685 składa się z trzech specjalnie dobranych przeciwciał fluorescencyjnych:
Monoclonal Mouse Anti-Human CD13, klon WM-47, sprzężone z izomerem 1 izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC).
Monoclonal Mouse Anti-Human HLA-DR Antigen, klon AB3, sprzężony z R-fikoerytryną (RPE).
Monoclonal Mouse Anti-Human CD117, klon 104D2, sprzężone z allofikocyjaniną (APC).
Trzy koniugaty wchodzące w skład odczynnika TC685 zostały wytworzone z oczyszczonych monoklonalnych
przeciwciał mysich należących do izotypów IgG1, kappa (anty-CD13), IgG2a, kappa (anty-antygen HLA-DR)
i IgG1, kappa (anty-CD117). Odczynnik TC685 dostarczany jest w postaci ciekłej w buforze zawierającym 1%
albuminy surowicy wołowej (BSA) oraz 15 mmol/L NaN3, pH 7,2. Każda fiolka zawiera koniugat na 50 testów
(20 µL koniugatu dla leukocytów, w ilości do 106, z prawidłowej ludzkiej krwi obwodowej).
Swoistość
Przeciwciała anty-CD13, WM-47, opisano podczas warsztatów Fourth and Fifth International Workshops and
Conferences on Leucocyte Differentiation Antigens (4. i 5. międzynarodowe warsztaty i konferencje na temat
antygenów różnicujących leukocyty), a ich reaktywność z CD13 została potwierdzona przez wiele laboratoriów
(4, 11). Przeciwciała anty-CD13, WM-47, reagują z komórkami CFU-GM, prawidłowymi granulocytami
i monocytami we wszystkich etapach różnicowania (1, 4, 11). Nie reagują z limfocytami i płytkami (3). W wyniku
analizy metodą cytometrii przepływowej wykazano, że przeciwciała anty-CD13, WM-47, znakują komórki
białaczek AML (9/9 przypadków) i CML w przełomie blastycznym (7/7 przypadków). Nie reagują z białaczką
cALL (0/8 przypadków) ani z ostrą białaczką limfoblastyczną z komórek T (0/1 przypadek) (3).
Przeciwciała przeciwko ludzkiemu antygenowi HLA-DR, AB3, reagują z determinantą DRw52 cząsteczki HLADR. Swoistość badano przy użyciu komórek transfekowanych wykazujących ekspresję HLA-DRw52.
Przeciwciała przeciwko ludzkiemu antygenowi HLA-DR, AB3, nie reagują z komórkami transfekowanymi
wykazującymi ekspresję antygenu HLA-DP lub HLA-DQ. Przeciwciała zgłoszono na warsztaty Eighth
International Workshop and Conference on Human Leucocyte Differentiation Antigens (8. międzynarodowe
warsztaty i konferencja na temat antygenów różnicujących ludzkie leukocyty).
Przeciwciała anty-CD117, 104D2 opisano podczas warsztatów Sixth International Workshop and Conference
on Human Leucocyte Differentiation Antigens (6. międzynarodowe warsztaty i konferencja na temat antygenów
różnicujących ludzkie leukocyty), a ich reaktywność z CD117 została potwierdzona przez wiele laboratoriów (10).
Środki ostrożności
1. Odczynniki są przeznaczone dla przeszkolonych Użytkowników.
2. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek — azydek sodu (NaN3), w czystej postaci. Stężenie
NaN3 występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w wyniku reakcji NaN 3
z ołowiem lub miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe
azydki metali. Przy usuwaniu resztek odczynnika używać dużych ilości wody do przepłukiwania, aby uniknąć
gromadzenia się azydków w instalacji kanalizacyjnej.
3. Podobnie jak w przypadku każdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, należy stosować
odpowiednie procedury postępowania.
(113850-002)
TC685/PL/SSA/06.09.05 s.1/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
Przechowywanie
Przechowywać w ciemności, w temperaturze 2–8°C. Nie stosować po upływie terminu ważności podanego na
opakowaniu. Jeżeli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niż podane na ulotce dołączanej do
opakowania, Użytkownik powinien je zweryfikować. Nie ma jednoznacznych oznak świadczących
o niestabilności tego produktu. Dlatego równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów
należy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne. W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego
nie można wyjaśnić różnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z odczynnikiem,
należy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
Wykonanie odczynu
1.
Przenieść 100 µL krwi z dodatkiem środka przeciwzakrzepowego (EDTA) do probówki polistyrenowej
o wymiarach 12 mm x 75 mm.
2.
Dodać 20 µL TC685 i ostrożnie wymieszać mieszadłem wibracyjnym.
3.
Inkubować probówkę w ciemności przez 30 minut w temperaturze 2–8°C lub przez 15–30 minut
w temperaturze pokojowej (20–25°C).
4.
Dodać do probówki 100 µL odczynnika Uti-Lyse™ Reagent A (nr kat. Dako S3325) i delikatnie mieszać
mieszadłem wibracyjnym. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej,
w ciemnym pomieszczeniu.
5.
Dodać do probówki 1 mL odczynnika Uti-Lyse™ Reagent B (nr kat. Dako S3325) i delikatnie mieszać
mieszadłem wibracyjnym. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej,
w ciemnym pomieszczeniu.
6.
Odwirować probówkę przy 300 x g przez 5 minut. Delikatnie odciągnąć supernatant i odrzucić go,
pozostawiając w probówce około 50 µL cieczy.
7.
Dodać do probówki 2 mL odczynnika PBS (nr kat. Dako S3024) i odtworzyć zawiesinę za pomocą
mieszadła wibracyjnego.
8.
Powtórzyć etap 6.
9.
Odtworzyć zawiesinę komórek w odpowiednim płynie do cytometrii przepływowej, np. 0,3 mL PBS.
10.
Poddać próbkę analizie w cytometrze przepływowym lub przechowywać do analizy w ciemności
i temperaturze 2–8°C. Próbki powinny zostać poddane analizie przed upływem 24 godzin od barwienia.
Należy pamiętać, że koniugaty fluorochromowe są wrażliwe na światło, w związku z czym w trakcie
wykonywania odczynu i do wykonania analizy próbki powinny być chronione przed światłem.
Uwagi dotyczące procedury
Etap 1: Opcjonalnie do każdego pomiaru można dołączyć odpowiednie dodatnie i ujemne próbki kontrolne
w celu weryfikacji odczynnika i przygotowania próbek.
Etap 2: Zalecana objętość koniugatu jest jedynie wartością orientacyjną. Optymalne warunki barwienia mogą
się zmieniać w zależności od rodzaju materiału i sposobu jego przygotowania i powinny być określone
indywidualnie w każdym laboratorium.
Uwzględnienie probówki z odczynnikiem kontrolnym jest opcjonalne. Odczynnik kontrolny powinien być
dopasowany do izotypów i fluorochromów sprzężonego przeciwciała. Zalecanym trójbarwnym odczynnikiem
kontrolnym dla TC685 jest odczynnik Dako o numerze kat. X7904.
Etapy 4 i 5: Jeśli używany jest inny odczynnik do lizy komórek, należy przy jego doborze kierować się
poniższymi zaleceniami. Należy zauważyć, że jeśli alternatywny odczynnik do lizy nie zawiera utrwalacza (np.
Dako EasyLyse™, nr kat. S2364), PBS w etapie 9 powinien zawierać 1% paraformaldehydu, chyba że próbka
zostanie przeanalizowana w czasie zalecanym dla odczynnika do lizy.
Etap 10: W przypadku niektórych chorób można oczekiwać nieprawidłowej liczby komórek, w których zachodzi
ekspresja antygenu docelowego, lub nieprawidłowego poziomu ekspresji antygenu. Może to wywołać zmianę
wzorca odczynu. Do przeprowadzenia właściwej analizy konieczna jest znajomość prawidłowego wzorca
ekspresji antygenu oraz jego związków z ekspresją innych istotnych antygenów.
Odczynniki wielobarwne lepiej niż jednobarwne nadają się do kompleksowej analizy próbek w cytometrii
przepływowej. W analizach wielobarwnych szczególne znaczenie ma odpowiedni dobór kompensacji koloru.
Dzięki minimalnemu nakładaniu się pasm emisyjnych fluorochromów FITC, RPE i APC ich połączenie
umożliwia wyjątkowo łatwą analizę.
Piśmiennictwo
(113850-002)
1.
van Dongen JJM, Adriaansen HJ. Immunobiology of leukemia. In: Henderson ES, Lister TA, Greaves
MF, editors. Leukemia. Philadelphia, London, Toronto, Montreal, Sydney, Tokyo: WB Saunders
Company; 1996. p. 83-130.
2.
Turni L, Shaw S, Watson B, Mason D. CD guide. In: Mason D, André P, Bensussan A, Buckley C, Civin
C, Clark E, et al., editors. Leucocyte typing VII. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 7th
International Workshop and Conference; 2000 June 19-23; Harrogate, United Kingdom. New York:
Oxford University Press Inc.; 2002. p. 761.
3.
Favaloro EJ, Bradstock KF, Kabral A, Grimsley P, Zowtyj H, Zola H. Further characterization of human
myeloid antigens (gp160,95; gp150; gp67): investigation of epitopic heterogeneity and non-haemopoietic
distribution using panels of monoclonal antibodies belonging to CD-11b, CD-13 and CD-33. Br J
Haematol 1988;69:163-71.
4.
Look AT, Ashmun RA, Shapiro LH, O´Connell PJ, Gerkis V, D’Apice AJ, et al. M2.1. Report on the CD13
(aminopeptidase N) cluster workshop. In: Knapp W, Dörken B, Gilks WR, Rieber EP, Schmidt RE, Stein
H, et al., editors. Leucocyte typing IV. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 4th
International Workshop and Conference; 1989 Feb 21-25; Vienna, Austria. Oxford, New York, Tokyo:
Oxford University Press; 1989. p. 784-7.
5.
Naverrete CV. The HLA system in blood transfusion. Bailliere’s Clin Haematol 2000;13:511-32.
6.
Erber WN, Pinching AJ, Mason DY. Immunocytochemical detection of T and B cell populations in routine
blood smears. Lancet 1984;i:1042-5.
TC685/PL/SSA/06.09.05 s.2/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
7.
Smith MEF, Holgate CS, Williamson JMS, Grigor I, Quirke P, Bird CC. Major histocompatibility complex
class II antigen expression in B and T cell non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Pathol 1987;40:34-41.
8.
Bahia DMM, Yamamoto M, de Lourdes M, Chauffaille LF, Kimura EYS, Bordin JO, et al. Aberrant
phenotypes in acute myeloid leukaemia: a high frequency and clinical significance. Haematologica
2001;86:801-6.
9.
Bühring H-J, Ullrich A, Schaudt K, Müller CA, Busch FW. The product of the proto-oncogene c-kit (P145ckit
) is a human bone marrow surface antigen of hemopoietic precursor cells which is expressed on a
subset of acute nonlymphoblastic leukemic cells. Leukemia 1991;5:854-60.
10.
Ashman LK, Cambareri AC, Nguyen L, Bühring H-J. CR5. CD117 workshop panel report. In: Kishimoto T,
Kikutani H, von dem Borne AEG, Goyert SM, Mason DY, Miyasaka M, et al., editors. Leucocyte typing VI.
White cell differentiation antigens. Proceedings of the 6th International Workshop and Conference; 1996
Nov 10-14; Kobe, Japan. New York, London: Garland Publishing Inc.; 1997. p. 816-8.
11.
Ashmun RA, Holmes KV, Shapiro LH, Favaloro EJ, Razak K, de Crom RPG, et al. M3. CD13
(aminopeptidase N) cluster workshop report. In: Schlossman SF, Boumsell L, Gilks W, Harlan JM,
Kishimoto T, Morimoto C, et al., editors. Leucocyte typing V. White cell differentiation antigens.
Proceedings of the 5th International Workshop and Conference; 1993 Nov 3-7; Boston, USA. Oxford,
New York, Tokyo: Oxford University Press; 1995. Volume 1. p. 771-5.
Objaśnienie symboli
Numer katalogowy
W
y
d
i
a
r
g
ó
b
n
m
o
s
e
t
d
y
k
y
i
c
i
n
z
n
v
y
i
t
d
r
Temperatura przechowywania
o
o
Chronić przed słońcem (patrz
s
e
k
c
j
a
n
t
.
p
r
z
e
c
h
o
w
y
w
a
n
i
a
Zużyć przed
Producent
)
Sprawdzić w instrukcji
N
s
(113850-002)
t
o
s
o
w
a
n
i
u
m
e
r
s
e
r
i
i
a
TC685/PL/SSA/06.09.05 s.3/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17