Monoclonal Mouse

MultiMix™
Triple-Colour Reagent
Anti-Human CD33/FITC
Anti-Human CD34/RPE
Anti-Human CD117/APC
Nr kat. TC686
Przeznaczenie
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Odczynnik TC686 przeznaczony jest do stosowania w cytometrii przepływowej. Odczynnik przeznaczony jest
do identyfikacji komórek szpikowych, w których zachodzi ekspresja CD33 oraz komórek progenitorowych,
w których zachodzi ekspresja CD34 i CD117.
CD33 wykazuje ekspresję w podzbiorze progenitorowych komórek szpikowych, monocytów, prekursorów
granulocytów oraz, w niewielkim stopniu, w neutrofilach. Ekspresja antygenu nie zachodzi w prawidłowych
komórkach limfoidalnych (1, 2). Obecność antygenu stwierdzano na powierzchni białaczkowych komórek
blastycznych w zdecydowanej większości przypadków ostrej białaczki szpikowej (AML) (1–3).
W prawidłowych tkankach ludzkich ekspresję CD34 wykazują wyłącznie limfohematopoetyczne komórki
progenitorowe, z wyjątkiem komórek śródbłonka włośniczek. Najwyższe poziomy ekspresji CD34 obserwuje się
w najwcześniejszych progenitorach, a ekspresja słabnie stopniowo w miarę dojrzewania komórek (4).
Ekspresja CD34 zachodzi w około 60% ostrych białaczek limfoidalnych limfocytów B, 40% ostrych białaczek
szpikowych (AML) i w 1–5% ostrych białaczek limfoidalnych limfocytów T (4). Stwierdzono, że przewlekłe
białaczki limfoidalne, chłoniaki i szpiczaki mnogie nie wykazują ekspresji CD34 (4).
CD117 jest markerem macierzystych i progenitorowych komórek hematopoetycznych, a także komórek
tucznych tkanek. W większości (50–70%) komórek CD117-dodatnich równolegle zachodzi ekspresja CD34.
Należą do nich komórki progenitorowe i ich prekursory wszystkich linii hematopoetycznych (5). Ekspresję
CD117 często stwierdza się w komórkach blastycznych pacjentów chorych na AML, ale nie w komórkach
blastycznych ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) (6).
Interpretacji wyniku — z uwzględnieniem kontekstu klinicznego oraz wyników innych metod diagnostycznych —
powinien dokonać wykwalifikowany patolog.
Dostarczany odczynnik
TC686 składa się z trzech specjalnie dobranych przeciwciał fluorescencyjnych:
Monoclonal Mouse Anti-Human CD33, klon WM-54, sprzężone z izomerem 1 izotiocyjanianu fluoresceiny
(FITC).
Monoclonal Mouse Anti-Human CD34, klon BIRMA-K3, sprzężone z R-fikoerytryną (RPE).
Monoclonal Mouse Anti-Human CD117, klon 104D2, sprzężone z allofikocyjaniną (APC).
Trzy koniugaty w TC686 wytworzono z oczyszczonych mysich przeciwciał monoklonalnych izotypu IgG1.
Odczynnik TC686 dostarczany jest w postaci ciekłej w buforze zawierającym 1% albuminy surowicy wołowej
(BSA) oraz 15 mmol/L NaN3, pH 7,2. Każda fiolka zawiera koniugat na 50 testów (20 µL koniugatu dla
leukocytów, w ilości do 106, z prawidłowej ludzkiej krwi obwodowej).
Swoistość
Przeciwciała Anti-CD33, WM-54, opisano podczas warsztatów Fourth International Workshop and Conference
on Human Leucocyte Differentiation Antigens (4. międzynarodowe warsztaty i konferencja na temat antygenów
różnicujących ludzkie leukocyty), a ich reaktywność z CD33 została potwierdzona przez wiele laboratoriów (2).
Przeciwciała anty-CD33, WM-54, reagują z komórkami linii monocytowej-makrofagowej oraz progenitorami
granulocytów (2). Stwierdzono także znikomą i słabą reaktywność przeciwciał z dojrzałymi granulocytami.
Przeciwciała nie reagują z erytrocytami, płytkami ani komórkami limfoidalnymi. Komórki progenitorowe szpiku
kostnego CFU-GM, CFU-Mix i BFU-E dają odczyn dodatni z przeciwciałami anty-CD33, WM-54 (7).
Stwierdzono, że przeciwciała anty-CD33, WM-54, znakowały antygeny w 14/21 przypadków białaczki AML.
W przewlekłej białaczce szpikowej z przełomem blastycznym przeciwciała anty-CD33, WM-54, znakowały 3/3
przypadki. W ostrej białaczce limfoblastycznej typu cALL przeciwciała anty-CD33, WM-54 znakowały 1/8
przypadków (7).
Przeciwciała anty-CD34, BIRMA-K3, opisano podczas warsztatów Sixth International Workshop and
Conference on Human Leucocyte Differentiation Antigens (6. międzynarodowe warsztaty i konferencja na temat
antygenów różnicujących ludzkie leukocyty), a ich reaktywność z CD34 i epitopem klasy III została
potwierdzona przez różne laboratoria (8). W cytometrii przepływowej przeciwciało znakuje komórki KG-1a
(podklon linii komórkowej białaczki AML wykazujący ekspresję CD34) (9).
Przeciwciała anty-CD117, 104D2 opisano podczas warsztatów Sixth International Workshop and Conference
on Human Leucocyte Differentiation Antigens (6. międzynarodowe warsztaty i konferencja na temat antygenów
różnicujących ludzkie leukocyty), a ich reaktywność z CD117 została potwierdzona przez wiele laboratoriów (5).
Środki ostrożności
1. Odczynniki są przeznaczone dla przeszkolonych Użytkowników.
2. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek — azydek sodu (NaN3), w czystej postaci. Stężenie
NaN3 występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w wyniku reakcji NaN3
z ołowiem lub miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe
azydki metali. Przy usuwaniu resztek odczynnika używać dużych ilości wody do przepłukiwania, aby uniknąć
gromadzenia się azydków w instalacji kanalizacyjnej.
3. Podobnie jak w przypadku każdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, należy stosować
odpowiednie procedury postępowania.
(113748-002)
TC686/PL/SSA/18.08.05 str. 1/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
Przechowywanie
Przechowywać w ciemności w temperaturze 2–8 °C. Nie stosować po upływie terminu ważności podanego na
opakowaniu. Jeżeli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niż podane na ulotce dołączanej do
opakowania, Użytkownik powinien je zweryfikować. Nie ma jednoznacznych oznak świadczących
o niestabilności tego produktu. Dlatego równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów
należy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne. W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego
nie można wyjaśnić różnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z odczynnikiem,
należy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
Wykonanie odczynu
1.
Przenieść 100 µL krwi z dodatkiem środka przeciwzakrzepowego (EDTA) do probówki polistyrenowej
o wymiarach 12 mm x 75 mm.
2.
Dodać 20 µL TC686 i ostrożnie wymieszać mieszadłem wibracyjnym.
3.
Inkubować probówkę w ciemności przez 30 minut w temperaturze 2–8 °C lub przez 15–30 minut
w temperaturze pokojowej (20–25 °C).
4.
Dodać do probówki 100 µL odczynnika Uti-Lyse™ Reagent A (nr kat. Dako S3325) i delikatnie mieszać
mieszadłem wibracyjnym. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej,
w ciemnym pomieszczeniu.
5.
Dodać do probówki 1 mL odczynnika Uti-Lyse™ Reagent B (nr kat. Dako S3325) i delikatnie mieszać
mieszadłem wibracyjnym. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej,
w ciemnym pomieszczeniu.
6.
Odwirować probówkę przy 300 x g przez 5 minut. Delikatnie odciągnąć supernatant i odrzucić go,
pozostawiając w probówce około 50 µL cieczy.
7.
Dodać do probówki 2 mL odczynnika PBS (nr kat. Dako S3024) i odtworzyć zawiesinę za pomocą mieszadła
wibracyjnego.
8.
Powtórzyć etap 6.
9.
Odtworzyć zawiesinę komórek w odpowiednim płynie do cytometrii przepływowej, np. 0,3 mL PBS.
10.
Poddać próbkę analizie w cytometrze przepływowym lub przechowywać do analizy w ciemności
i temperaturze 2–8 °C. Próbki powinny zostać poddane analizie przed upływem 24 godzin od barwienia.
Należy pamiętać, że koniugaty fluorochromowe są wrażliwe na światło, w związku z czym w trakcie wykonywania
odczynu i do wykonania analizy próbki powinny być chronione przed światłem.
Uwagi dotyczące procedury
Etap 1: Opcjonalnie do każdego pomiaru można dołączyć odpowiednie dodatnie i ujemne próbki kontrolne
w celu weryfikacji odczynnika i przygotowania próbek.
Etap 2: Zalecana objętość koniugatu jest jedynie wartością orientacyjną. Optymalne warunki barwienia mogą
się zmieniać w zależności od rodzaju materiału i sposobu jego przygotowania i powinny być określone
indywidualnie w każdym laboratorium.
Uwzględnienie probówki z odczynnikiem kontrolnym jest opcjonalne. Odczynnik kontrolny powinien być
dopasowany do izotypów i fluorochromów sprzężonego przeciwciała. Zalecanym trójbarwnym odczynnikiem
kontrolnym dla TC686 jest odczynnik Dako o numerze kat. X0978.
Etapy 4 i 5: Jeśli używany jest inny odczynnik do lizy komórek, należy przy jego doborze kierować się
poniższymi zaleceniami. Należy zauważyć, że jeśli alternatywny odczynnik do lizy nie zawiera utrwalacza (np.
Dako EasyLyse™, nr kat. S2364), PBS w etapie 9 powinien zawierać 1% paraformaldehydu, chyba że próbka
zostanie przeanalizowana w czasie zalecanym dla odczynnika do lizy.
Etap 10: W przypadku niektórych chorób można oczekiwać nieprawidłowej liczby komórek, w których zachodzi
ekspresja antygenu docelowego, lub nieprawidłowego poziomu ekspresji antygenu. Może to wywołać zmianę
wzorca odczynu. Do przeprowadzenia właściwej analizy konieczna jest znajomość prawidłowego wzorca ekspresji
antygenu oraz jego związków z ekspresją innych istotnych antygenów.
Odczynniki wielobarwne lepiej niż jednobarwne nadają się do kompleksowej analizy próbek w cytometrii
przepływowej. W analizach wielobarwnych szczególne znaczenie ma odpowiedni dobór kompensacji koloru. Dzięki
minimalnemu nakładaniu się pasm emisyjnych fluorochromów FITC, RPE i APC, ich połączenie umożliwia
wyjątkowo łatwą analizę.
Piśmiennictwo
(113748-002)
1.
Peiper SC, Guo HH. MC6. CD33 workshop panel report. In: Kishimoto T, Kikutani H, von dem Borne
AEG, Goyert SM, Mason DY, Miyasaka M, et al., editors. Leucocyte typing VI. White cell differentiation
antigens. Proceedings of the 6th International Workshop and Conference; 1996 Nov 10-14; Kobe, Japan.
New York, London: Garland Publishing Inc.; 1997. p. 972-4
2.
Peiper SC, Leboeuf RD, Hughes CB, Prasthofer EF, Borowitz MJ, Dewutter-Dambuyant C, et al. M6.1.
Report on the CD33 cluster workshop: biochemical and genetic characterization of gp67. In: Knapp W,
Dörken B, Gilks WR, Rieber EP, Schmidt RE, Stein H, et al., editors. Leucocyte typing IV. White cell
differentiation antigens. Proceedings of the 4th International Workshop and Conference on Human
Leucocyte Differentiation Antigens; 1989 Feb 21-25; Vienna, Austria. Oxford, New York, Tokyo: Oxford
University Press; 1989. p. 814-6.
3.
Baer MR, Stewart CC, Dodge RK, Leget G, Sulé N, Mrózek K, et al. High frequency of immunophenotype
changes in acute myeloid leukemia at relapse: implications for residual disease detection (Cancer and
Leukemia Group B Study 8361). Blood 2001;97:3574-80.
4.
Civin CI, Trischmann TM, Fackler MJ, Bernstein ID, Bühring HJ, Campos L, et al. M7.1. Report on the
CD34 cluster workshop. In: Knapp W, Dörken B, Gilks WR, Rieber EP, Schmidt RE, Stein H, et al.,
editors. Leukocyte typing IV. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 4th International
Workshop and Conference; 1989 Feb 21-25; Vienna, Austria. Oxford, New York, Tokyo: Oxford
University Press; 1989. p. 818-25.
TC686/PL/SSA/18.08.05 str. 2/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17
5.
Ashman LK, Cambareri AC, Nguyen L, Bühring H-J. CR5. CD117 workshop panel report. In: Kishimoto T,
Kikutani H, von dem Borne AEG, Goyert SM, Mason DY, Miyasaka M, et al., editors. Leucocyte typing VI.
White cell differentiation antigens. Proceedings of the 6th International Workshop and Conference; 1996
Nov 10-14; Kobe, Japan. New York, London: Garland Publishing Inc.; 1997. p. 816-8.
6.
Bühring H-J, Ullrich A, Schaudt K, Müller CA, Busch FW. The product of the proto-oncogene c-kit (P145c-kit)
is a human bone marrow surface antigen of hemopoietic precursor cells which is expressed on a subset
of acute nonlymphoblastic leukemic cells. Leukemia 1991;5:854-60.
7.
Favaloro EJ, Bradstock KF, Kabral A, Grimsley P, Berndt MC. Characterization of monoclonal antibodies
to the human myeloid-differentiation antigen "gp67" (CD-33). Disease Markers 1987;5:215-25.
8.
Nishio H, Tada J, Hashiyama M, Hirn J, Ingles-Esteve J, Suda T. MC7. CD34 workshop panel report. In:
Kishimoto T, Kikutani H, von dem Borne AEG, Goyert SM, Mason DY, Miyasaka M, et al., editors.
Leucocyte typing VI. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 6th International Workshop
and Conference; 1996 Nov 10-14; Kobe, Japan. New York, London: Garland Publishing Inc.; 1997. p.
974-84.
9.
Höffkes H-G, Lowe JA, Pedersen RO, Schmidkte G, McDonald DF. BIRMA-K3, a new monoclonal
antibody for CD34 immunophenotyping and stem and progenitor cell assay. J Hematother 1996;5:261-70.
Objaśnienie symboli
Numer katalogowy
W
y
d
i
a
r
g
ó
b
n
m
o
s
e
t
d
y
k
y
i
c
i
n
z
n
v
y
i
t
d
r
Temperatura przechowywania
o
o
Chronić przed słońcem (patrz
s
e
k
c
j
a
n
t
.
p
r
z
e
c
h
o
w
y
w
a
n
i
a
Zużyć przed
Producent
)
Sprawdzić w instrukcji
N
s
(113748-002)
t
o
s
o
w
a
n
i
u
m
e
r
s
e
r
i
i
a
TC686/PL/SSA/18.08.05 str. 3/3
Dako Denmark A/S · Produktionsvej 42 · DK-2600 Glostrup · Denmark · Tel. +45 44 85 95 00 · Fax +45 44 85 95 95 · CVR No. 33 21 13 17