Białka z Arabidopsis thaliana zaangażowane w transdukcję sygnału

Białka z Arabidopsis thaliana zaangażowane w transdukcję sygnału: badania strukturalne i
funkcjonalne
Marta Grzechowiak
Streszczenie
Badania strukturalne czynników transkrypcyjnych WRKY
Białka WRKY stanowią dużą rodzinę czynników transkrypcyjnych występujących wyłącznie u
roślin. Białka WRKY regulują transkrypcję genów indukowanych podczas infekcji patogenami
oraz genów związanych z niektórymi etapami rozwoju roślin. Ich cechą charakterystyczną jest
obecność niezmiennej sekwencji WRKYGQK w obrębie domeny wiążącej DNA oraz unikatowy
motyw palca cynkowego. Białka te wykazują duzą różnorodność sekwencji poza regionem
domeny wiażącej DNA.
Celem niniejszej pracy były badania krystalograficzne czynników transkrypcyjnych WRKY
pełnej długości, gdyż do tej pory w bazie danych PDB dostępne były tylko struktury domeny
wiążącej DNA uzyskane metodą NMR oraz krystalografii rentgenowskiej.
W prezentowanych badaniach został opracowany skuteczny sposób ekspresji i oczyszczania
rekombinowanych białek AtWRKY50 i AtWRKY18DBD. Otrzymane białka zachowują aktywność
biologiczną w testach wiązania DNA. Metody przedstawione w niniejszym opracowaniu
umożliwiają otrzymanie znacznych ilości AtWRKY50 i AtWRKY18DBD w bakteryjnym systemie
ekspresyjnym do dalszych badań funkcjonalnych i strukturalnych. Otrzymane rekombinowane
białka spełniały oczekiwane właściwości fizyko-chemiczne niezbędne do przeprowadzania
krystalizacji. Niestety wszystkie próby uzyskania dyfrakcji kryształów AtWRKY18 DBD oraz
białka AtWRKY50 były nieudane.
Widmo CD oraz analizy bioinformatyczne sekwencji wykonane dla białka AtWRKY50 pozwoliły
wywnioskować, że nie posiada ono dobrze zdefiniowanej struktury trzeciorzędowej i jest
częściowo nieuporządkowane. Może to wyjaśniać trudności w krystalizacji i nieudane próby
realizacji głównego celu pracy - rozwiązanie struktury krystalicznej.
Wykonane analizy ITC i EMSA potwierdziły biologiczną aktywność rekombinowanych białek
AtWRKY50 i AtWRKY18DBD do wiązania DNA.
Badania strukturalne enzymów zaangażowanych w metabolizm fosforanów
Pirofosfataza jest enzymem hydrolizującym nieorganiczny pirofosforan PPi do fosforanu Pi w
obecności dwuwartościowych jonów metali. W reakcji z udziałem PPazy w komórce odzyskiwany
jest fosforan z pirofosforanu, powstający w wyniku degradacji ATP. Enzym ten jest obecny u
wszystkich organizmów, a reakcja hydrolizy pirofosforanu pełni istotną rolę w obiegu fosforu w
komórce.
W genomie Arabidopsis thaliana zidentyfikowano 5 genów kodujących homologi pirofosfataz
cytoplazmatycznych. Do tej pory nie było żadnych danych strukturalnych dotyczących
pirofosfataz roślinnych. Głównym celem mojej pracy były badania strukturalne pirofosfatazy
AtPPA1. Gen Atppa1 kodujący ten enzym został wklonowany do bakteryjnego wektora
ekspresyjnego i poddany ekspresji w komórkach E. coli w celu produkcji białka rekombinowanego
ze znacznikiem histydynowym (His-tag). Rekombinowane białko zostało oczyszczone z
bakteryjnego lizatu w dwóch kolejnych etapach: chromatografii powinowactwa na oraz filtracji
żelowej a następnie poddane krystalizacji. Struktura krystaliczna pirofosfatazy AtPPA1 została
rozwiązana z wysoką rozdzielczością (1.9 Å) metodą podstawienia cząsteczkowego i
udokładniona (wskaźnik rozbieżności R poniżej 15,6%). Współrzędne struktury AtPPA1 zostały
zdeponowane w bazie danych PDB (kod: 4lug).
Ogólna struktura białka AtPPA1 wykazuje duże podobieństwo do znanych wcześniej pirofosfataz
z bakterii i drożdzy mimo tego, że pirofosfataza z A. thaliana wykazuje ok. 40% identyczności (na
poziomie sekwencji aminokwasowej) z enzymami bakteryjnymi i tylko ok. 20% identyczności z
pirofosfatazami z innych organizmów eukariotycznych nie uwzględniając roślin. Ponadto,
pirofosfatazy z różnych grup organizmów wykazują odmienną oligomeryczną organizację:
bakteryjne tworzą heksamery, drożdżowe tworzą dimery, natomiast roślinna pirofosfataza
AtPPA1 jest trimerem o masie 75 kDa.
Test aktywności enzymatycznej wykazał, ze otrzymane przeze mnie rekombinowane białko
AtPPA1 jest biologicznie aktywne. Przygotowane 2 warianty tego białka z mutacjami w obrębie
centrum aktywnego (D98N i D103N) nie wykazywały aktywności aktywności enzymatycznej.
Dodatkowo zaobserwowałam, że podczas krystalizacji dochodzi do odcięcia 30 N-terminalnych
reszt aminokwasowych. W celu zidentyfikowania miejsca cięcia zostało wykonane oznaczenie
sekwencji N-końca pirofosfatazy AtPPA1. Interesujące jest to, że w przypadku mutantów,
odcinanie N-terminalnego fragmentu białka zachodzi wolniej. Analiza bioinformatyczna
sekwencji AtPPA1 przewidziała, że to białko posiada N-końcowy peptyd sygnalny, z miejscem
cięcia po Val31, kierujący to białko do mitochondrium.