Kryteria podziału metod chromatograficznych

METODY INSTRUMENTALNE
W ANALIZIE CHEMICZNEJ
Zakład Chemii Medycznej PUM
Promieniowanie elektromagnetyczne:
 fala
 strumień fotonów
Fala
to rozchodzące się w przestrzeni i w czasie,
spójne drganie pól elektrycznego
i magnetycznego.
2
Fotony są pozbawione masy spoczynkowej, niosą ze
sobą ściśle określoną energię, którą wyraża zależność
Plancka:
gdzie:



E  energia promieniowania
h  stała Plancka 6,625 • 10-34 Js
  liczba falowa cm-1
Zajmuje się oddziaływaniem promieniowania elektromagnetycznego
z cząsteczkami.
W cząsteczce wieloatomowej można wyróżnić następujące rodzaje
energii:
 translacji - swobodny ruch cząsteczki w przestrzeni
 rotacji - związana z obrotem cząsteczki wokół osi środka
masy
 oscylacji - związana z drganiem atomów wokół położenia
równowagi
 elektronowa - energia kinetyczna (ruch) elektronów i
potencjalna związana z przyciąganiem elektronów przez jądro
i odpychaniem przez sąsiednie elektrony.
4
W wyniku absorpcji promieniowania elektromagnetycznego przez cząsteczki
następuje wzbudzenie odpowiednich poziomów energii , czego mierzalnym
efektem jest widmo.
 pod wpływem promieniowania z zakresu mikrofal i dalekiej podczerwieni
(energia 4x10-2 – 4x10-3 KJ/mol) następuje wzbudzenie rotacyjnych poziomów
energii a efektem jest widmo rotacyjne.
 pod wpływem promieniowania IR (podczerwień 4 – 240 KJ/mol)
wzbudzeniu ulegają oscylacyjne poziomy energii – efekt widmo oscylacyjne.
 wzbudzenie elektronów jest wywołane promieniowaniem
elektromagnetycznym (400 KJ/mol) z zakresu UV – Vis (ultrafiolet i
widzialne) - efektem jest elektronowe widmo absorpcyjne.
5
Elektronowe widmo absorpcyjne jest widmem ciągłym
6
Podstawowe założenia do praw absorpcji:
 monochromatyczność wiązki promieniowania
elektromagnetycznego
 jednorodność ośrodka absorbującego
7
c- stężenie roztworu
α- współczynnik absorpcji 0,4343K
Intensywność początkowa
promieniowania (Io)
Intensywność promieniowania
(I1) po przejściu przez próbkę
o grubości l
8
I prawo absorpcji (prawo Lamberta)
Wiązka promieniowania monochromatycznego po przejściu przez
jednorodny ośrodek absorpcyjny o grubości l ulega osłabieniu
wg równania:
I = Io e –Kl
A= log (I0 / I) = a l
A- absorbancja, gęstość optyczna,
zdolność pochłaniania
promieniowania
Absorbancja jest proporcjonalna do grubości warstwy
absorbującej jeśli wiązka promieniowania elektromagnetycznego
przechodzi przez jednorodny ośrodek absorbujący.
9
II prawo absorpcji (prawo Lamberta - Beera)
Absorbancja wiązki promieniowania
monochromatycznego przechodzącej przez
jednorodny roztwór jest wprost proporcjonalna
do stężenia roztworu c i do grubości warstwy
absorbującej l.
A= alc
10
III Prawo absorpcji (addytywności absorpcji)
Absorbancja roztworu wieloskładnikowego równa się
sumie absorbancji poszczególnych składników.
A = A1 + A2 + A3 + ...... + An
11
Odchylenia od praw adsorpcji są wywołane przez:
1. Podstawowe ograniczenia praw
 prawa absorpcji są spełniane dla roztworów rozcieńczonych
c  10 -2 mol/l
 zakłada się, że jedynym oddziaływaniem promieniowania
elektromagnetycznego z substancją rozpuszczoną jest
absorpcja promieniowania (a nie np. fluorescencja)
12
2. Czynniki chemiczne
 zmianie pH roztworu, także zmianie stężenia mogą towarzyszyć
reakcje takie jak: polimeryzacja, dysocjacja, asocjacja,
solwatacja, kompleksowanie - tym reakcjom towarzyszą zmiany
właściwości optycznych analizowanych roztworów.
3. Czynniki aparaturowe
 brak monochromatyczności wiązki (główna przyczyna
odchylenia od praw)
 promieniowanie rozproszone
Spektrometria w zakresie nadfioletu (ultrafiolet UV) i promieniowania
widzialnego (visible – Vis).
Absorpcja promieniowania w zakresie UV – Vis jest związana z
przejściami elektronów walencyjnych ( i π) oraz elektronów
wolnych par elektronowych (elektrony n).
14
Ilościowe oznaczanie metodą spektrofotometryczną UV – Vis należy
do metod porównawczych (porównanie z wzorcami, stosowanie
krzywych kalibracyjnych)
1. Metoda porównania z pojedynczym wzorcem
Ax – absorbancja roztworu badanego cx
Aw – absorbancja roztworu wzorcowego cw (pomiar w kuwetach o tej
samej grubości l i przy tej samej długości fali )
Ax = a cx l
Aw = a cwl
15
2. Metoda porównania z kilkoma wzorcami czyli metoda
krzywej wzorcowej – metoda uniwersalna
A
Ax
Cx
C
16
Analiza jakościowa
Elektronowe widmo absorpcyjne jest cechą charakterystyczną
związku chemicznego i określa jednoznacznie związek jednorodny.
 W przypadku związku organicznego widma UV – Vis w zakresie
180 –800 nm są użyteczne do ustalania pewnych zależności
strukturalnych i identyfikacji grup funkcyjnych.
 Użytecznym pojęciem jest wprowadzone przed wieloma laty
określenia:
chromofor i auksochrom
17
Chromofory są to grupy absorbujące promieniowanie
elektromagnetyczne w zakresie 180 – 800 nm
grupy: karboksylowa, nitrozowa, alkenowa, azowa, tiolowa,
benzenowa
Auksochromy są to grupy przesuwające absorpcję (max i Emax) w
kierunku fal dłuższych (przesunięcie batochromowe)
grupy: aminowa, hydroksylowa, sulfhydrylowa
18
Cząstki w stanie wzbudzonym mogą emitować promieniowanie
przechodząc do stanu podstawowego - zjawisko to nazywamy
luminescencją - emisja światła przez ciała zimne.
W zależności od czynników które wywołały luminescencję rozróżniamy:
 fotoluminescencja – substancja jest wzbudzona promieniowaniem
elektromagnetycznym UV – Vis
 chemiluminescencja – wzbudzenie jest wynikiem reakcji chemicznej
 bioluminescencja - wzbudzenie jest wynikiem procesów
biochemicznych

elektroluminescencja – wzbudzenie następuje w polu elektrycznym.
19
Proces fotoluminescencji cząstki można przedstawić
schematycznie:
X + h
X*
X + ciepło + h´
h´- energia oddana na sposób
promienisty
W zależności od mechanizmu
przejść elektronowych:


fluorescencja
fosforescencja
20
Zastosowanie analityczne fluorescencyjnej analizy
tiamina
ilościowej:







witaminy (tiamina)
hormony (adrenalina)
aminokwasy (tryptofan)
alkaloidy (chinina)
leki (antybiotyki, barbiturany)
środki spożywcze
substancje toksyczne w środowisku
tiochrom
Absorpcja promieniowania IR wpływa na zmianę
energii oscylacyjnej cząsteczki
Zakresy długości fal odpowiadające podczerwieni:
 0,8 – 2,5 m NIR bliska podczerwień
 2,5 – 25 m
MIR podstawowa
 25 – 500 m FIR daleka podczerwień
22
Widmo IR jest właściwością charakterystyczną dla
danego związku chemicznego.
Wykorzystuje się je do:
 identyfikacji związków (ustala się grupy funkcyjne i
strukturę badanego związku).
 w analizie ilościowej (obowiązuje tu także prawo
Lamberta-Beera).
 w biologii, biochemii, medycynie do badania tkanekmięśni, włókien i krwi.
23
Jądra atomowe niektórych izotopów umieszczone w jednorodnym polu
magnetycznym mogą absorbować promieniowanie elektromagnetyczne
o częstotliwości radiowej.
Z warunku rezonansu wynika, że można:
 przy ustalonej częstotliwości radiowej zmieniać natężenie pola
magnetycznego tak długo aż wystąpi rezonans
 przy stałym natężeniu pola można zmieniać częstotliwość
promieniowania radiowego aż do wystąpienia rezonansu
Promieniowanie o częstotliwości radiowej uzyskuje się z krystalicznego
oscylatora o dużej stabilności
Najczęściej bada się izotopy: 1H, 13C, 19F, 31P, 14N, 11Bi, 29Si
24
Tomografia MRI (magnetic resonance imaging)
 Pierwszy raz
wykorzystany w 1973r przez
Lauterbur’a,
 Obecnie to istotna metoda stosowana w
diagnostyce klinicznej.
 Magnes horyzontalny, do którego wsuwany
jest na leżąco pacjent utrzymuje stałe i
jednorodne pole magnetyczne.
 Za pomocą dodatkowych cewek uzyskuje się
warunki rezonansowe jąder tylko w wybranej
warstwie, w przekroju.
 Impuls pola zmiennego wzbudzającego rezonans trwa ułamek sekundy
 Obraz żywego organizmu przedstawia mapę gęstości protonów wody w
tkankach danej części ciała.
 Najczęściej obrazuje się nieruchome części ciała tj. mózg, rdzeń kręgowy,
kończyny.
25

Obraz mózgu otrzymany metodą
tomografii zmienia się w zależności od
tego ile świeżej utlenowanej krwi jest
dostarczone do niego w trakcie myślenia,
zapamiętywania czy reakcji na bodźce.

Uzyskuje się mapę funkcji mózgu

Do obrazowania narządów wewnętrznych
konieczne jest dodatkowe sterowanie
gradientem pola w rytm oddechów tzw.
nawigator oddechowy

W badaniu serca sekwencje obrazujące są
sterowane sygnałem EKG
26
PROTEin complement of the genOME
(składnik białkowy kodowany przez genom)
Proteomika zmierza do poznania wszystkich
białek pojawiających się w danym organizmie
w ciągu całego życia.
 Wykorzystuje kilka technik służących do jednoczesnej analizy setek lub tysięcy
białek.
 Białka są trudnym obiektem badań ze względu na ich przestrzenną strukturę
i występowanie w wielkocząsteczkowych kompleksach.
 Dynamiczny obraz proteomu zawiera:
 zmiany w pojedynczej komórce związane z jej cyklem życiowym
 rozmieszczenie białek w obrębie struktur komórki
 wzajemne oddziaływanie komórek tworzących tkanki
Liczba białek proteomu jest znacznie
większa niż liczba kodujących ją genów.
 Ludzki genom ma w przybliżeniu
30-50 tysięcy genów kodujących białka.
 Do tej pory rozpoznano około 500 tysięcy
białek, co oznacza, że na 1 gen przypada prawie 10 różnych wariantów białek
 Na taki stan mają wpływ:
 procesy molekularnego składania w trakcie translacji i powstawania
informacyjnego kwasu rybonukleinowego
 procesy potranslacyjne: fosforylacja czy glikozylacja, które mają wpływ
na ostateczną strukturę białka
 Pełna analiza białek- markerów białkowych zawartych w materiale
biologicznym może być źródłem wielu informacji o zdrowiu pacjenta oraz
wspomóc kliniczną diagnozę w monitorowaniu choroby czy prowadzeniu
terapii.




Ludzka surowica zawiera wiele tysięcy białek/peptydów o stężeniu w zakresie 35-50 ∙ 10⁹
pg/ml do 0-5 pg/ml
Poznano 22 białka stanowiące 99% surowiczego proteomu, pozostały 1%
białek/peptydów nazwano peptydomem, zawierającym białka o masie cząsteczkowej
mniejszej niż 10 000 Da.
Małe białka są trudne do identyfikacji i wykonania analizy ilościowej z powodu ich małej
ilości w surowicy oraz tendencji przyłączania się do białek transportujących, takich jak
albumina.
W wykrywaniu markerów biologicznych stosuje się techniki pozwalające na
porównywanie złożonych mieszanin białkowych i ilościową ocenę ich
poszczególnych składników.
Analiza proteomiczna wykorzystuje głównie elektroforezę dwukierunkową 2D i
spektrometrię mas.
ETAP 1

Białka są rozdzielane w gradiencie pH w
zależności od punktu izoelektrycznego pI,
czyli wartości pH, przy której ładunek
wypadkowy białka jest równy zero

Stosuje się kapilary z żelem
poliakrylamidowym lub paski żeli z
immobilizowanym gradientem pH,
dającym wysoką rozdzielczość i
powtarzalność wyników
Ogniskowanie izoelektryczne IEF


ETAP 2
Białka są rozdzielane zgodnie z ich masą
cząsteczkową metodą SDS-PAGE
Uzyskuje się rozdziały białek o
podobnych masach cząsteczkowych
Barwniki fluorescencyjne

Technika analityczna, której
podstawą jest pomiar stosunku
masy do ładunku elektrycznego
danego jonu.

Metoda oparta na jonizacji
cząsteczek lub atomów, a
następnie detekcji liczby jonów w
funkcji ich stosunku masy do
ładunku (m/z).

Wyniki działania spektrometru
mas są przedstawiane w postaci
tzw. widma masowego.
GC-MS - chromatografia gazowa w połączeniu ze spektrometrią mas;
metoda skojarzona, łącząca technikę separacji z detekcją MS; służy do ilościowego
oznaczania składników złożonych próbek.
Zastosowanie:
 identyfikacja cukrów, amin, alkoholi, narkotyków, substancji dopingujących, pestycydów i
dioksyn.
 identyfikacja metabolizmu leków (farmakokinetyka)
 badanie wpływu leków na funkcjonowanie organizmu (farmakologia)
 odkrywanie nowych, bioaktywnych metabolitów
LC-MS - chromatografia cieczowa w połączeniu ze spektrometrią mas;
stosuje się chromatografię wysokosprawną (HPLC) i ultra wysokosprawną (UPLC).
Zalety:
 jednoznaczna identyfikacja składników próbki
 bardzo wysoka czułość układu analitycznego
 możliwość identyfikacji wszystkich składników próbki
 wysoka powtarzalność pomiarów
 analiza ilościowa
Chromatografia (gr. chromatos = barwa + graphos = pisze)
technika służąca do rozdziału lub badania składu mieszanin
związków chemicznych.
Chromatografię stosuje się do :
 wyodrębniania związków z mieszanin
 oczyszczania
 identyfikacji ilościowej i jakościowej
 preparacji związków
Wybór metody zależy od :
 ilości mieszaniny identyfikacyjnej
 rodzaju związków
 stopnia skomplikowania podziału
36

Rozdział chromatograficzny polega na
umieszczeniu badanej mieszaniny na
ciekłej lub stałej fazie nieruchomej
(stacjonarnej), a następnie na
przepuszczeniu ciekłej bądź gazowej fazy
ruchomej (mobilnej) przez nią lub też nad
nią, czyli elucji mieszaniny z fazy
nieruchomej.

Składniki mieszaniny o różnych
stosunkach podziału są eluowane (migrują)
z różnymi szybkościami. Te różnice w
szybkości migracji prowadzą do rozdziału
składników w czasie i przestrzeni.
37
Kryteria podziału metod chromatograficznych
I. Zastosowanie eluentu
1. chromatografia cieczowa
2. chromatografia gazowa
3. chromatografia fluidalna
III. Geometria układu
1. chromatografia kolumnowa
2. chromatografia planarna
a. bibułowa
b. cienkowarstwowa (TLC)
II. Natura sił fizyko-chemicznych procesu
1. chromatografia adsorpcyjna
2. chromatografia jonowymienna
3. chromatografia podziałowa
a. klasyczna
b. z odwróconymi fazami
c. par jonowych
4. chromatografia sitowo-żelowa (sączenie
molekularne)
5. chromatografia powinowactwa
6. elektroforeza kapilarna (CE)/ wysokosprawna
elektroforeza kapilarna (HPCE)
IV. Stan skupienia faz
1. chromatografia gazowo-cieczowa (GLC)
2. chromatografia cieczowo-cieczowa (LLC)
3. chromatografia gazowo-stała (GSC)
4. chromatografia cieczowo-stała (LSC)
V. Parametry procesu
1. wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)
2. szybka, białkowa chromatografia cieczowa (FPLC)
38
Klasyfikacja adsorbentów:
1. pod względem aktywności adsorpcyjnej
- słabe (skrobia, sacharoza)
- średnie (węglan wapnia)
- silne (aktywowany kwas krzemowy, tlenek glinu)
2. ze względu na polarność
- silnie polarne (tlenek glinu, tlenek krzemu)
- słabo polarne (węglan wapnia)
- niepolarne (węgiel aktywowany)
3. ze względu na właściwości chemiczne:
- kwaśne ( SiO2)
- zasadowe ( CaO)
- obojętne ( węgiel aktywowany)
- amfoteryczne ( Al2O3)
4. ze względu na naturę chemiczną:
- organiczne
- nieorganiczne
- mieszane
- specyficzne
39
Rozpuszczalniki (solwenty) - ułożone są w szereg eluotropowy, w zależności
od zdolności adsorpcyjnych w stosunku do substancji w nich rozpuszczonych
oraz elucyjnych.
Stosowane są do rozwinięcia chromatogramu jak i do elucji (wymywania
rozdzielonych substancji).
W chromatografii rozpuszczalniki uszeregowane są wraz ze wzrostem zdolności
wymywania zaadsorbowanych związków polarnych:
 heksan ( najmniej polarny)
 tetrachlorek węgla
 benzen
 eter dietylowy
 aceton
 chloroform
 octan etylu
 etanol
 metanol
 woda
Zdolności adsorpcyjne cząsteczek zależą od :
 wielkości i budowy przestrzennej
 liczby i położenia wiązań podwójnych
 liczby podstawników polarnych i niepolarnych
 liczby i rodzaju grup funkcyjnych
Stopień adsorpcji cząsteczek adsorbatu wzrasta wraz z:
 ilością wiązań podwójnych
 grup funkcyjnych
 liczbą podstawników tego samego rodzaju
42
Rozpuszczone w fazie ruchomej składniki mieszaniny ulegają podziałowi między
dwie fazy. O rozdziale decyduje:
Prawo podziału solutu- prawo Nernsta
K - współczynnik w stanie równowagi zależy jedynie od temperatury i właściwości
substancji tworzących roztwory, a nie zależy od ilości substancji rozpuszczonej
C1 - stężenie solutu (substancji rozpuszczonej) w fazie stacjonarnej
C2 - stężenie solutu w fazie ruchomej
Ekstrakcja- metoda rozdziału składników mieszaniny lub oczyszczania
określonego składnika z towarzyszących zanieczyszczeń wykorzystująca
prawo podziału solutu.
43
Szybka metoda wstępnej orientacji w ilości i względnym
udziale składników mieszaniny związków organicznych.
Rozdział mieszaniny jest oparty na różnicy we współczynnikach podziału
składników mieszaniny (odmienną rozpuszczalnością) między dwie nie
mieszające się ze sobą fazy, z których jedna jest cieczą osadzoną na nośniku
(faza stacjonarna), a druga fazą ruchomą (ciecz, gaz).
44
 Podstawę podziału stanowią reakcje wymiany jonowej między jonami z roztworu, a
jonami związanymi z fazą stacjonarną, którą stanowią jonity (kationity i anionity).
Rozdział składników mieszaniny wynika z różnic w ładunku elektrycznym jonów.
 Jonity (wymieniacze jonowe) są to substancje, które mają właściwości pobierania
jonów z roztworów w zamian za oddawanie do roztworów równoważnych ilości innych
jonów tego samego znaku.
 Żywica jonowymienna składa się ze szkieletu (matrycy) polimeru łańcuchów
węglowodorowych w postaci sieci przestrzennej. Z matrycą są trwale powiązane jony
(grupy) aktywne, które noszą nazwę jonów utrwalonych. Jony te mogą być wymieniane
na inne znajdujące się w roztworze.
Zastosowanie chromatografii jonowymiennej:
 rozdział związków jonowych, kwasów karboksylowych, zasad (aminy),
aminokwasów, peptydów, białek, pochodnych kwasów nukleinowych,
cukrów
 zmiękczanie wody – usuwanie jonów wapnia i magnezu
 demineralizacja wody
Podstawę podziału stanowią różnice w rozmiarach cząsteczek – rozdział
zachodzi na skutek różnicy mas cząsteczkowych rozdzielanych związków.
 Wypełnienie kolumn - żele o zdefiniowanych rozmiarach porów, zbliżonych
do rozmiarów cząsteczek analizowanych substancji;
sita molekularne
 Faza nieruchoma - rozpuszczalnik zalegający wnętrze ziaren żelu.
 Faza ruchoma - rozpuszczalnik przemieszczający się pomiędzy ziarnami żelu.
 Substancje o dużych rozmiarach cząsteczek (większych od średnicy porów)
przesuwają się wzdłuż kolumny szybciej i przechodzą do wycieku. Cząsteczki
o określonych rozmiarach dyfundują w głąb ziaren żelu tylko na określoną
głębokość - im mniejsze rozmiary tym głębiej penetrują ziarna żelu – wolniej
migrują wzdłuż kolumny.

47
Przykładowe wypełnienia
1. Sephadex - na bazie dekstranu (wielkocząsteczkowy glikan)
2. Sepharose - granulowana forma agaru (glikan obojętny (D-galaktoza +
3,6-anhydro-L-galaktoza)
3. Sephacryl – całkowicie syntetyczne sito molekularne-kopolimer
allilodekstranu i N,N’- metylenobisakrylamidu
Zastosowanie chromatografii sitowej:
 określanie rozkładu mas cząsteczkowych polimerów
 rozdział substancji wielkocząsteczkowych takich jak: białka, kwasy
nukleinowe, peptydy, cukry, glikole, silikony.
Wada – nie nadaje się do rozdziału związków o zbliżonych masach
48
49
Szczególny typ chromatografii adsorpcyjnej, w której wykorzystuje się
wzajemne powinowactwo dwóch substancji:
 chemicznie związany z nierozpuszczalnym nośnikiem – ligand (efektor)
 substancja w fazie ruchomej specyficznie adsorbowana przez ligand
Substancja rozpuszczona w fazie ruchomej może oddziaływać z
unieruchomionym ligandem jak:






hormon z receptorem,
enzym z substratem,
enzym z inhibitorem,
przeciwciało z antygenem,
kwasy nukleinowe z białkami,
dopełniacz z przeciwciałami
50
Etapy chromatografii powinowactwa
1. Chemiczne związanie ligandu ze złożem (immobilizacja ligandu) –
złoża stosowane w filtracji żelowej
2. Specyficzne wiązanie substratu do unieruchomionego ligandu i
„odmycie” niespecyficznie zaadsorbowanych cząsteczek
białkowych
3. Elucja specyficznie związanego substratu – za pomocą eluentów:
 specyficznych – np. inhibitorów enzymów
 niespecyficznych – np. buforów o niskim/wysokim pH,
roztworów o dużej sile jonowej, związków rozrywających
wiązania wodorowe
51
52
 Podstawą rozdziałów elektroforetycznych jest różnica w
prędkościach migracji cząstek obdarzonych ładunkiem w stałym
polu elektrycznym.
 Kationy przyciągane są przez katodę (-), a aniony przez anodę (+).
 Prędkość migracji w kierunku elektrod jest różna dla różnych
cząsteczek i zależy od:
 natężenia pola elektrycznego
 ładunku cząsteczki
 rozmiaru cząsteczki
 lepkości środowiska
 Rozdział przeprowadza się w kapilarach ze stopionej krzemionki
(kwarcu) SiO2 wypełnionych roztworem elektrolitu nośnego;
kapilary o Фwewn. 25–75 µm i l ok. 50 cm.
53
Zastosowanie elektroforezy kapilarnej:
 analiza biopolimerów (białka, polipeptydy, kwasy nukleinowe)
 analiza związków biologicznie czynnych (aminokwasy, nukleozydy, nukleotydy)
 analiza leków – kontrola jakości leków
 analiza mieszanin racemicznych i ich rozdział na optycznie czynne enancjomery
54
Obejmuje metody chromatograficzne, w których fazą nośną jest gaz.
 Analizowana próbka (analit) jest przenoszona za pomocą gazu nośnego poprzez
kolumnę wypełnioną fazą nieruchomą, gdzie następuje rozdział mieszaniny na
poszczególne związki chemiczne.
 Rozdzielone substancje mierzy się i rejestruje u wylotu kolumny za pomocą
odpowiedniego układu detektorowego.
 W zależności od rodzaju fazy nieruchomej rozróżnia się:
chromatografię gazową podziałową (faza nieruchoma - ciecz naniesiona na stałym
nośniku)
 chromatografię gazową adsorpcyjną (faza nieruchoma - adsorbent)
 chromatografię gazową kapilarną - średnica kolumny 0,2-0,6 mm, (faza nieruchoma –
ciecz naniesiona bezpośrednio na ścianki kolumny)

 Szybka i skuteczna metoda rozdzielania mieszanin związków lotnych.
Zastosowanie
Analiza jakościowa:
 identyfikacja związków na podstawie parametrów retencji - w tych samych
warunkach rozdziału takie same charakterystyki retencyjne
 identyfikacja substancji poprzez porównanie ze wzorcem
Analiza ilościowa:
wysokość h i powierzchnia A piku są proporcjonalne do ilości oznaczanego
składnika: h = f(c) i A = f(c)
 metoda krzywej kalibracyjnej
 metoda wzorca wewnętrznego
 metoda dodawania wzorca
56
Schemat chromatografu gazowego
58
Wysokociśnieniowa/wysokosprawna chromatografia cieczowa HPLC – High Pressure/Performance Liquid Chromatography
Faza ruchoma - ciecz wtłaczana pod wysokim ciśnieniem (20MPa-40MPa)
Faza stacjonarna - gęsto i jednorodnie upakowane złoże w kolumnie z metalu,
dobrze odpowietrzone
Wariant analityczny - węższe kolumny (4-8 mm); długość 5 – 25 cm
Wariant preparatywny - szersze kolumny (20 – 500 mm); długość 25 –100 cm
 Zalety: szybki, zautomatyzowany i precyzyjny rozdział związków; łatwe
stosowanie gradientów; powtarzalność czasów retencji; ilościowe oznaczanie
związków (pole powierzchni pod pikiem)
 Detekcja: spektroskopowa (UV-vis), elektrochemiczna, spektrofluorymetryczna
 Wada: rozdział małych ilości związków
Schemat chromatografu cieczowego
Zastosowanie HPLC
Analiza związków:
 biologicznie czynnych (białka, aminokwasy, witaminy,
kwasy nukleinowe, sterydy, polipeptydy, polisacharydy)
 preparatów farmaceutycznych
 środków ochrony roślin, pestycydów
 węglowodorów policyklicznych (benzopiren w środowisku)
 związków metaloorganicznych i kompleksowych
 skomplikowanych mieszanin kationów np. rozdzielanie
pierwiastków ziem rzadkich
61
VWD1 A, Wavelength=254 nm (US\16PUR051.D)
mAU
NAD
10
GTP
GDP
GMP
8
ADP
ATP
Guo
Ino
NADP
AMP
6
Hyp
Urd
IMP
4
Xan
ADPR
UA
2
0
-2
0
2
4
6
8
10
min
62