Klonowanie i ekspresja ludzkiej podjednostki 6 syntazy ATP w
advertisement
Ewelina Lenarczyk Nr albumu: 206405 Biotechnologia Chemiczna – Leki i Kosmetyki Kierujący dyplomową pracą magisterską: prof. nzw. dr hab. Joanna Cieśla Opiekun naukowy: dr Monika Wysocka-Kapcińska Klonowanie i ekspresja ludzkiej podjednostki 6 syntazy ATP w drożdżach Saccharomyces cerevisiae STRESZCZENIE PRACY Mitochondria to organelle występujące u wszystkich organizmów eukariotycznych. Ich główną funkcją jest wytwarzanie energii w postaci ATP na drodze fosforylacji oksydacyjnej. Ostatni etap syntezy ATP katalizuje enzym, syntaza ATP, zlokalizowany w wewnętrznej błonie mitochondrium. Jest to wielopodjednostkowy kompleks enzymatyczny, złożony z hydrofilowej, skierowanej w stronę macierzy domeny F1 oraz wewnątrzbłonowej hydrofobowej domeny F0. Miejsca katalityczne znajdują się w trzech podjednostkach β należących do części F1, natomiast kanał protonowy stanowią podjednostki 6 i 9 należące do części F0. Gradient protonów w poprzek wewnętrznej błony mitochondrialnej wytworzony podczas transportu elektronów przez kompleksy łańcucha oddechowego jest siłą, która powoduje rotację pierścienia złożonego z podjednostek 9. Rotacja pierścienia wywołuje obrót części centralnej enzymu, podjednostek γ, ε, i δ, co generuje zmiany konformacyjne w części katalitycznej domeny F1 zmieniające jej powinowactwo do substratów – ADP i fosforanu nieorganicznego – lub produktu – ATP, co decyduje o aktywności enzymu – syntezie lub hydrolizie ATP. Mitochondria jako jedyne organelle w komórkach zwierzęcych posiadają własne DNA. Mutacje w ludzkim mtDNA są przyczyną licznych chorób mitochondrialnych. Celem pracy była ekspresja genu kodującego ludzką podjednostkę 6 syntazy ATP w mutancie Saccharomyces cerevisiae niosącym delecję genu ATP6. Otrzymany szczep pozwoliłby na analizę wpływu mutacji, występujących w tym genie, zidentyfikowanych w komórkach nowotworowych u ludzi, na metabolizm i funkcjonowanie mitochondriów drożdży, jako organizmu modelowego. Integracja hATP6 do genomu mitochondrialnego drożdży zaszła prawidłowo, jednakże nie udało się uzyskać szczepu zdolnego do wzrostu. Wprowadzanie do komórek cytoduktantów dodatkowych kopii ludzkich genów hATP9 i hATP3, kodujących podjednostki 9 i γ syntazy ATP, a także ATP9 z Podospora anserina nie umożliwiły przeżycia rekombinantów. Próby otrzymania szczepu niosącego funkcjonalną ludzką podjednostkę 6 syntazy ATP zdolną do odwrócenia defektu oddechowego w mutancie atp6∆ nie powiodły się prawdopodobnie na skutek różnic w kodzie genetycznym, budowie genów, budowie poszczególnych podjednostek syntazy ATP oraz mechanizmie składania całego enzymu u drożdży i ludzi. Słowa kluczowe: mitochondria, syntaza ATP, kanał protonowy, ATP6, ATP9, defekty mitochondrialne, Saccharomyces cerevisiae
