Co wiemy o białkach fluorescencyjnych

Co
wiemy
o
fluorescencyjnych
białkach
Najlepiej znanym białkiem fluorescencyjnym jest białko zielonej
fluorescencji (ang. Green Fluorescent Protein, GFP), które w 1962 roku
zostało wyizolowane z meduzy Aequorea victoria przez Osamu Shimomurę.
Przez pierwsze 30 lat od momentu odkrycia tego białka budziło ono
zainteresowanie jedynie niewielkiej garstki naukowców, którzy zajmowali
się badaniami luminescencji organizmów morskich. Jednak największą
uwagę uzyskało w 1992 roku, kiedy poznano jego podstawową strukturę
oraz w 1994 roku kiedy użyto go po raz pierwszy jako znacznik
fluorescencyjny do znakowania in vivo [1].
GFP jest niewielkim białkiem o masie 25,9 kDa. Tworzy ono strukturę beta-baryłki
głównie z dwurzędowych struktur beta-harmonijek. Chromofor znajdujący się w
środku struktury baryłki zbudowany jest z trzech aminokwasów: Ser65-Tyr66Gly67, poddanych posttranslacyjnej cyklizacji i oksydacji [3].
Źródło:
Wikimedia
Commons, autor: Richard
Wheeler, licencja: CC BYSA 3.0
Ryc. 1. Struktura przestrzenna GFP
Coraz częstsze stosowanie GFP spowodowało, że zaczęto poszukiwać jego
ulepszonych wariantów. Wprowadzane modyfikacje polegały głównie na:
zmniejszeniu tendencji do oligomeryzacji i wrażliwości na pH, rozszerzeniu zakresu spektralnego, zwiększeniu intensywności fluorescencji i fotostabilności białka,
a także przyspieszeniu dojrzewania chromoforu [3]. Białka fluorescencyjne oraz
chromoproteiny z rodziny GFP składają się z 220-240 aminokwasów (25kDa). Ich
struktura jest podobna do GFP i różni się jedynie w obrębie chromoforu w pozycji
65. Struktura baryłki jest stabilizowana poprzez wiele interakcji
niekowalencyjnych, które zapewniają bardzo wysoką stabilność termiczną oraz
odporność na proteolizę dzięki denaturacji chemicznej [1]. Przykładami są białka
fluorescencyjne emitujące światło w różnych zakresach spektralnych poprzez
wprowadzenie przypadkowych mutacji w GFP np. BFP (blue fluorescent protein)
w zakresie niebieskim, CFP (cyan fluorecent protein) w niebiesko-zielonym oraz
YFP (yellow fluorescent protein) w żółtym. Natomiast EGFP (enhanced green
fluorescent protein) uzyskano wymieniając dwa aminokwasy w obrębie
chromoforu GFP. Białko to wykazuje znacznie wyższą (ponad 35 razy)
intensywność fluorescencji w porównaniu do GFP oraz obniżoną tendencję do
agregacji w 37°C [3]. Białka fluorescencyjne odkryto również w naturalnych
źródłach, między innymi od koralowcach, ukwiałach, meduzach, skorupiakach, a
nawet najprostszych strunowcach [2].
Aktualnie GFP oraz jego pochodne są wykorzystywane w wielu badaniach
organizacji oraz funkcjonowania systemów życiowych. Interakcja między białkami
w organizmie a białkami fluorescencji pozwala zaobserwować m. in. ich
lokalizację, ruch, obroty a nawet ich „starzenie się”. Kwasy nukleinowe mogą być
również znakowane poprzez RNA lub DNA. Białka fluorescencyjne ukierunkowane
do organelli komórkowych poprzez białka sygnałowe umożliwiają wizualizację
między innymi ich morfologii, syntezy i rozszczepienia oraz segregacji podczas
podziału komórki. Są one również niezbędnymi narzędziami do znakowania
pojedynczych komórek oraz tkanek, dzięki czemu można obserwować ich
morfologię, położenie i ruch (np. podczas rozwoju embrionalnego lub
tumorogenezy) oraz ich etapy mitotyczne. Znakowane mogą być również całe
organizmy, w celu odróżnienia tych transgenicznych od naturalnie występujących,
oraz dla celów całkiem nienaukowych np. akwarium z kolorowymi rybkami lub
zwierzęta domowe w nietypowych kolorach [1].
Źródło:
Wikimedia
Commons, autor Nathan
Shaner, licencja CC BY-SA
3.0
Ryc.2. Plaża w San Diego narysowana żywymi bakteriami z mutacjami
odpowiadającymi ośmiu różnym kolorom białek fluorescencyjnych (
pochodzących z GFP i dsRed)
Główną zaletą białek fluorescencyjnych jest możliwość prowadzenia obserwacji
innych białek, kompleksów oraz określonych fragmentów chromosomów w żywej
komórce w czasie rzeczywistym, oraz brak toksycznego wpływu na bakterie i
organizmy eukariotyczne. Główną natomiast wadą GFP jest tendencja do
tworzenia nierozpuszczalnych agregatów, zwłaszcza w wyższych temperaturach, a
fuzja z GFP może zaburzać natywną strukturę analizowanego białka [3].
Opracowano wiele technik, które wykorzystują znaczniki fluorescencyjne: metody
BiFC i FRET są wykorzystywane do obserwacji oddziaływań białkowych w
komórce w czasie rzeczywistym, a FRAP (fluorescence recovery after
photobleaching) jest techniką pozwalającą na badanie dynamiki białek w
komórkach. Metoda ta polega na wygaszeniu fluorescencji we fragmencie
struktury subkomórkowej, która zawiera znakowane fluorescencyjnie białko [3].
W 2008 roku Osamu Shimomura, Martin Chalfie i Roger Tsien otrzymali
nagrodę Nobla za odkrycie i rozwój białka zielonej fluorescencji. Ich
dokonania umożliwiły udoskonalenie technik fluorescencyjnych, co
wpłynęło na bardziej szczegółowe odkrycia w zakresie badania komórki.
Poznano strukturę wewnętrzną komórki bakteryjnej, dzięki czemu obalono
wcześniejszą teorię, iż nie posiada ona struktur subkomórkowych.
Techniki te wykorzystywane są również w mikrobiologii oraz w medycynie.
Agnieszka Staniczek
Piśmiennictwo:
1. Chudakov DM. et al. Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging
Living Cells and Tissues. Physiol Rev, 2010; 90: 1103-1163.
2. Wiedenmann J. et al. Fluorescent Proteins for Live Cell Imaging: Opportunities,
Limitations, and Challenges. Life, 2009; 61, 11: 1029-1042.
3. Donczew M. i wsp. Odsłona tajemnic komórki bakteryjnej – zastosowanie
nowych technik mikroskopii fluorescencyjnej. Postępy Hig Med Dosw, 2011; 65:
114-123.
Data publikacji: 14.05.2015r.