Zestaw do izolacji DNA z krwi świeżej i mrożonej

Nr kat. EM05
Wersja zestawu: 1.2014
Zestaw do izolacji DNA
z krwi świeżej i mrożonej
EXTRACTME® jest zastrzeżonym
znakiem towarowym firmy BLIRT S.A.
www.dnagdansk.com
Nr kat. EM05
I.
PRZEZNACZENIE ZESTAWU
Zestaw EXTRACTME DNA BLOOD przeznaczony jest do szybkiej i wydajnej izolacji
genomowego DNA o wysokiej czystości z krwi świeżej lub mrożonej (ludzkiej
lub ssaczej). Protokół izolacji i składy buforów zostały zoptymalizowane w celu
osiągnięcia zarówno wysokiej wydajności, jak i czystości izolowanego DNA.
Produkt przeznaczony jest wyłącznie do użytku w celach badawczych.
II.
SKŁAD I PRZECHOWYWANIE ZESTAWU
50
IZOLACJI
150
IZOLACJI
250
IZOLACJI
3 IZOLACJE
(DEMO)
EM05–050
EM05–150
EM05–250
EM05–D
RBC Lysis Buffer
50 ml
150 ml
250 ml
3 ml
WBC Lysis Buffer
10 ml
30 ml
50 ml
600 µl
1 szt.
3 szt.
5 szt.
1 szt.
Proteinase Buffer
200 µl
600 µl
1 ml
200 µl
BB Buffer (Binding Buffer)
20 ml
60 ml
100 ml
1,2 ml
BW Buffer (Wash Buffer)
50 ml
150 ml
250 ml
3 ml
Elution Buffer
10 ml
3 x 10 ml
5 x 10 ml
600 µl
DNA Purification Columns
50 szt.
3 x 50 szt.
5 x 50 szt.
3 szt.
Collection Tubes (2 ml)
50 szt.
3 x 50 szt.
5 x 50 szt.
3 szt.
LICZBA IZOLACJI
Nr katalogowy
(Red Blood Cell Lysis Buffer)
(White Blood Cell Lysis Buffer)
Proteinase K (lyophilized)
Proteinaza K dostarczana jest w postaci liofilizowanej. Każda probówka
zawiera odpowiednią ilość proteinazy K do przeprowadzenia 50 izolacji. Liofilizat
proteinazy K należy przechowywać w temp. +4°C. Przed pierwszym użyciem
liofilizat należy rozpuścić w 200 µl buforu do proteinazy (Proteinase Buffer).
Roztwór proteinazy K należy przechowywać w temp. -20°C!
Pozostałe składniki zestawu należy przechowywać w temp. pokojowej (15-25°C).
Wszystkie roztwory z zestawu należy przechowywać szczelnie zamknięte, aby
uniknąć zmiany stężeń w wyniku parowania. Odpowiednio przechowywany zestaw
zachowuje stabilność minimum przez okres 12 miesięcy.
3
III. WYMAGANE MATERIAŁY I SPRZĘT
pp
pp
pp
pp
pp
pp
jałowe probówki wirownicze typu Eppendorf (1,5–2 ml)
pipety automatyczne oraz odpowiednie końcówki do pipet
rękawiczki jednorazowe
mikrowirówka z rotorem na 1,5–2 ml probówki (> 11 tys. x g)
termoblok lub łaźnia wodna (do 70°C)
worteks
IV. ZASADA IZOLACJI
Procedura oczyszczania DNA składa się z 5 etapów i przeprowadzana jest
z wykorzystaniem minikolumn wirowniczych, zawierających odpowiednie złoże
krzemionkowe wydajnie i selektywnie wiążące kwasy nukleinowe. Pierwszym
etapem jest liza erytrocytów, mająca na celu oddzielenie białych krwinek
od liczniejszych bezjądrzastych krwinek czerwonych, które nie posiadają
materiału genetycznego, a stanowią potencjalne źródło inhibitorów reakcji
enzymatycznych. Następnie frakcja białych krwinek poddawana jest lizie
enzymatycznej z wykorzystaniem zoptymalizowanego buforu WBC Lysis Buffer
oraz silnej proteazy (proteinazy K). W tym etapie następuje degradacja błon
i białek komórkowych. Po dodaniu soli chaotropowych, lizat przenoszony jest
do minikolumny ze złożem. Dwuetapowe przemywanie DNA związanego do
złoża ma na celu usunięcie pozostałych zanieczyszczeń i/lub inhibitorów reakcji
enzymatycznych. Oczyszczone DNA eluowane jest ze złoża buforem o niskiej sile
jonowej (Elution Buffer) lub wodą (pH 7,0–9,0) i jest gotowe do bezpośredniego
wykorzystania w technikach biologii molekularnej (takich jak PCR, qPCR,
Southern blotting, sekwencjonowanie DNA, trawienie enzymami restrykcyjnymi,
ligacja DNA itp.) lub może być przechowywane do późniejszego użycia.
V.
KONTROLA JAKOŚCI
Każda partia produkcyjna (LOT) zestawu EXTRACTME DNA BLOOD testowana
jest według opracowanych procedur. Wydajność, czystość oraz stabilność
wyizolowanego DNA analizowane są metodami spektrofotometrycznymi
oraz elektroforetycznymi. Dodatkowo funkcjonalna jakość oczyszczonego
DNA sprawdzana jest w reakcji PCR, qPCR oraz reakcji trawienia
enzymami restrykcyjnymi.
www.dnagdansk.com
4
Nr kat. EM05
VI. SPECYFIKACJA PRODUKTU
MATERIAŁ WYJŚCIOWY
krew świeża lub mrożona (do 1 ml)
WYDAJNOŚĆ IZOLACJI
3–10 µg DNA z 200 µl ludzkiej krwi
POJEMNOŚĆ ZŁOŻA
ok. 27 µg DNA
CZAS IZOLACJI
ok. 25 minut
CZYSTOŚĆ DNA
A 260/A 280 = 1,7–1,9
VII. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
pp
pp
pp
pp
pp
pp
5
Krew jest materiałem niebezpiecznym ze względu na potencjalną zawartość
mikroorganizmów patogennych lub substancji zagrażających zdrowiu,
bądź życiu człowieka. Przy pracy z próbkami krwi należy stosować się do
wymogów dotyczących biologicznych materiałów niebezpiecznych.
Zaleca się przeprowadzać całą procedurę izolacji w komorze II klasy
bezpieczeństwa biologicznego lub przy palniku laboratoryjnym, używać
ochronnej odzieży laboratoryjnej oraz rękawiczek jednorazowych.
Zalecane jest używanie jałowych końcówek z filtrami do pipet.
Należy unikać dotykania ścianek minikolumn pipetą, aby nie przenosić
śladowych ilości DNA pomiędzy kolejnymi minikolumnami.
Odpady zawierające sole guanidyny mogą tworzyć wysoce reaktywne
związki w połączeniu z substancjami utleniającymi. W przypadku rozlania
buforu, powierzchnię zmyć wodą z detergentem.
W przypadku rozlania cieczy zawierającej krew, zanieczyszczoną
powierzchnię zmyć wodnym roztworem detergentu.
VIII. SZCZEGÓLNE ZALECENIA I UWAGI
Elucja DNA ze złoża
Optymalną objętość buforu elucyjnego (Elution Buffer) należy dobrać w zależności
od ilości materiału użytego do izolacji oraz od wymaganego poziomu stężenia
DNA w eluacie. Zaleca się stosowanie 50–100 μl Elution Buffer przy izolacji
ze 100–500 μl krwi oraz zwiększenie objętości buforu elucyjnego do 200 μl
w przypadku izolacji z 500–1000 μl krwi.
Ilość oczyszczonego DNA zależy od rodzaju próbki oraz ilości komórek
w próbce (wieku pacjenta, stanu jego zdrowia, warunków transportu
próbek, sposobu i czasu ich przechowywania). Zwykle wydajność izolacji
z 200 µl krwi zdrowej osoby wynosi 3–10 µg DNA. Podczas izolacji DNA z próbek
zawierających podwyższoną ilość białych krwinek (3 x 106 –1 x 107 komórek/ml)
można otrzymać większą ilość DNA.
Jeśli pożądane jest otrzymanie DNA o wysokim stężeniu, objętość buforu
elucyjnego można zmniejszyć nawet do 20 μl. Należy mieć jednak na uwadze,
że obniży to wydajność odzysku DNA. Istotne w tym przypadku jest dodanie
buforu elucyjnego centralnie na powierzchnię złoża.
W celu uzyskania maksymalnej wydajności elucji DNA, bufor elucyjny należy
podgrzać do temp. 80°C i wydłużyć czas inkubacji złoża z buforem do 10 minut.
Jeśli istotne jest odzyskanie całkowitego DNA z minikolumny można
przeprowadzić dodatkową elucję (200 μl). W tym przypadku należy powtórzyć
punkty 19–22 Protokołu izolacji, umieszczając minikolumnę w nowej probówce
1,5 ml typu Eppendorf.
Elution Buffer zawiera 0,5 mM EDTA, którego obecność może przeszkadzać
w niektórych reakcjach enzymatycznych (np. sekwencjonowanie DNA).
Do elucji DNA można użyć także buforu 5-10 mM Tris-HCl, pH 8,0-9,0, innych
buforów do specyficznych aplikacji, o pH i stężeniu soli zbliżonych do tego
buforu lub wody (pH 7,0-9,0).
Zanieczyszczenia RNA
Obecność śladowych ilości RNA może niekorzystnie wpływać na niektóre reakcje
enzymatyczne, ale nie wpływa na inhibicję PCR. Jeśli niezbędne jest otrzymanie
oczyszczonego preparatu genomowego DNA wolnego od RNA należy dodać
4 μl roztworu RNazy A (10 mg/ml; nr kat. RP14, RP145) do próbki po zawieszeniu
w WBC Lysis Buffer (pkt. 5 Protokołu izolacji). Wymieszać i inkubować przez
5 min w temp. 37°C, a następnie przejść do pkt. 6 Protokołu izolacji.
www.dnagdansk.com
6
Nr kat. EM05
IX. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI
W przypadku krwi świeżej, przed przystąpieniem do izolacji próbkę należy
zmieszać z odpowiednią ilością antykoagulantu (EDTA, cytrynian). Jeśli do próbki
był już uprzednio dodany antykoagulant, ten etap należy pominąć.
Próbkę krwi można przechowywać w obecności antykoagulantów (EDTA, cytrynian)
w temp. +4°C (do 24 h) lub w postaci zamrożonej (preferowana temp.  -80°C).
Należy unikać częstego rozmrażania i zamrażania próbek przed izolacją DNA.
Przed pobraniem odpowiedniej objętości krwi do izolacji należy dokładnie
wymieszać krew przez odwracanie probówki, z której materiał ma zostać pobrany.
W przypadku krwi mrożonej należy odczekać kilka minut do całkowitego
rozmrożenia próbki.
W niektórych przypadkach możliwe jest powstanie trwałego skrzepu czerwonych
komórek krwi. Skrzep należy dokładnie rozbić poprzez intensywne worteksowanie
lub/i pipetowanie krwi zmieszanej z buforem RBC Lysis Buffer. Następnie należy
prowadzić izolację zgodnie z protokołem, a przed naniesieniem lizatu na złoże
minikolumny (pkt. 11 Protokołu izolacji) dodać dodatkowy etap wirowania 1 min
przy 10–14 tys. rpm, a na złoże nanieść supernatant znad powstałego osadu.
Gdy objętość próbki krwi jest mniejsza niż 200 μl, należy dodać Elution Buffer lub
roztworu PBS (brak w zestawie) do całkowitej objętości 200 μl, a następnie przejść do
pkt. 1 Protokołu izolacji.
X.
PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO IZOLACJI
1.
2.
Każdy z odczynników zestawu należy wymieszać.
Należy pamiętać o rozpuszczeniu liofilizatu Proteinase K w odpowiedniej
ilości buforu do proteinazy (200 µl Proteinase Buffer na jedną probówkę
liofilizatu).
W przypadku wytrącenia osadu w buforach, butelkę z roztworem należy ogrzać
do temp. 37°C (BW Buffer) lub 50–60°C (pozostałe bufory) i inkubować, aż
do całkowitego rozpuszczenia osadu, mieszając co kilka minut, a następnie
schłodzić do temp. pokojowej.
Nagrzać termoblok lub łaźnię wodną do temp. 65°C.
3.
4.
5.
6.
7.
7
Ogrzać odpowiednią ilość buforu elucyjnego do temp. 70°C.
Należy pamiętać, aby wszystkie etapy izolacji przeprowadzać w temp.
pokojowej, jeśli nie zalecono inaczej.
Wszystkie etapy wirowania zostały zoptymalizowane z wykorzystaniem
mikrowirówki Eppendorf 5417C. Prędkości wirowania podane w jednostkach
rpm odnoszą się do tej mikrowirówki.
XI. PROTOKÓŁ IZOLACJI
1. Pobrać 200–1000 μl krwi i przenieść do probówki typu
Eppendorf (1,5–2 ml), a następnie dodać 1 objętość buforu
do lizy erytrocytów RBC Lysis Buffer (np. pobierając 200 μl
krwi do izolacji należy dodać 200 μl buforu RBC Lysis Buffer).
Gdy objętość próbki jest mniejsza niż 200 µl, uzupełnić roztworem PBS lub
Elution Buffer do 200 µl, a następnie dodać 200 µl RBC Lysis Buffer.
2. Dokładnie wymieszać przez odwracanie probówki, aż powstanie
klarowny czerwony roztwór.
3. Wirować 4 min przy 9 tys. rpm (8,6 tys. x g).
Nie zaleca się zwiększania prędkości wirowania, gdyż może to utrudnić
późniejsze zawieszanie powstałego osadu białych krwinek w buforze lizującym.
4. Ostrożnie usunąć pipetą supernatant znad osadu
białych krwinek.
5. Dokładnie zawiesić osad komórek w 200 μl buforu do lizy
leukocytów WBC Lysis Buffer poprzez pipetowanie.
6. Dodać 3 μl Proteinase K i wymieszać przez worteksowanie.
7. Inkubować 5 min w temp. 65°C.
Jeśli osad białych krwinek nie został całkowicie zawieszony w buforze
lizującym, należy przedłużyć czas inkubacji do momentu całkowitej lizy
komórek, intensywnie worteksując co 1–2 min.
8. Dodać 400 μl buforu wiążącego BB Buffer i dokładnie wymieszać.
9. Inkubować kolejne 5 min w temp. 70°C.
10. Po inkubacji próbkę intensywnie worteksować przez 15–20 s.
11. Całość lizatu przenieść do minikolumny ze złożem, umieszczonej
w probówce odbierającej i wirować 1 min przy 10–12 tys. rpm
(11–15 tys. x g).
www.dnagdansk.com
8
Nr kat. EM05
12. Przenieść minikolumnę do nowej probówki odbierającej (2 ml).
13. Dodać do minikolumny 600 μl buforu płuczącego BW Buffer
i wirować 30 s przy 10–12 tys. rpm (11–15 tys. x g).
14. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej
z powrotem minikolumnę.
15. Dodać do minikolumny 400 μl BW Buffer i wirować 30 s przy
10–12 tys. rpm (11–15 tys. x g).
16. Wyjąć minikolumnę, wylać przesącz i umieścić ponownie
minikolumnę w probówce odbierającej.
17. Wirować 1-2 min przy 12-14 tys. rpm (15-21 tys. × g).
Bufor płuczący zawiera alkohol, który może powodować inhibicję niektórych
reakcji enzymatycznych, a także obniżenie wydajności elucji, dlatego istotne
jest jego całkowite usunięcie przed etapem elucji.
18. Ostrożnie wyjąć suchą minikolumnę z probówki odbierającej
i umieścić ją w jałowej probówce 1,5 ml typu Eppendorf.
19. Nanieść 50-100 μl Elution Buffer uprzednio ogrzanego do
temp. 70°C centralnie na złoże w minikolumnie.
Możliwa jest zmiana objętości buforu elucyjnego w zakresie 20-200μl.
Więcej wskazówek dotyczących tego etapu znajduje się w sekcji VIII.
Szczególne zalecenia i uwagi.
20. Inkubować minikolumnę z buforem przez 2 min.
21. Wirować 1 min przy 10–12 tys. rpm (11–15 tys. x g).
22. Minikolumnę usunąć, a wyizolowane DNA przechowywać
w temp. +4°C lub -20°C do czasu dalszych analiz.
9
XII. MOŻLIWE PROBLEMY I ICH ROZWIĄZYWANIE
Problem
Prawdopodobna przyczyna
Rozwiązanie
Niecałkowita
liza czerwonych
komórek krwi.
Czerwone komórki krwi
w materiale użytym do
izolacji ulegają lizie
w ograniczonym stopniu.
Należy powtórzyć etap lizy erytrocytów po osuszeniu
zanieczyszczonego osadu białych krwinek. Jednakże
niewielka ilość czerwonych krwinek obecna w osadzie nie
przeszkadza w dalszych etapach oczyszczania DNA.
Powstał skrzep
krwi, który nie
jest lizowany przez
RBC Lysis Buffer.
Stary, niewłaściwie
przechowywany materiał
lub jego pochodzenie
(np. krew szczura).
Należy postępować według procedury opisanej
w sekcji IX. Przygotowanie próbki (część dotycząca
powstawania skrzepu).
Została dodana
niewystarczająca
ilość antykoagulantu.
Należy pobrać materiał ponownie, zwiększając dwukrotnie
ilość dodawanego antykoagulantu lub postępować według
procedury opisanej w sekcji IX. Przygotowanie próbki
(część dotycząca powstawania skrzepu).
Niewłaściwie
przechowywany materiał.
Zalecane jest przechowywanie próbek krwi w temp. -80°C.
Należy unikać częstego rozmrażania i zamrażania próbek.
Należy unikać przechowywania próbek krwi w temp. +4°C
dłużej niż 24 h.
Niecałkowita liza białych
komórek krwi.
Całkowicie zawiesić osad białych krwinek i/lub wydłużyć
czas inkubacji w temp. 70°C, worteksując lizat co kilka minut.
Materiał o niskiej
zawartości białych
komórek krwi.
Zwiększyć objętość materiału do izolacji i/lub zmniejszyć
objętość buforu elucyjnego do 20 μl.
Niecałkowita liza białych
komórek krwi.
Całkowicie zawiesić osad białych krwinek i/lub wydłużyć
czas inkubacji w temp. 65°C, worteksując lizat co kilka minut.
Niecałkowite wysuszenie
kolumny z resztek
buforu płuczącego.
Izolację należy powtórzyć, zwracając szczególną uwagę, aby
po etapie wirowania (pkt.18) nie pozostało żadnych resztek
buforu płuczącego w minikolumnie.
Niecałkowita elucja DNA.
Przed naniesieniem na złoże podgrzać Elution Buffer
do temp. 80°C. Nanieść Elution Buffer centralnie na
powierzchnię złoża. Wydłużyć czas inkubacji z Elution Buffer
do 10 minut. Przeprowadzić powtórną elucję. Zwiększyć
objętość Elution Buffer do 200 μl.
Niewłaściwe pH buforu
elucyjnego lub wody
(pH <7,0).
Do elucji użyć Elution Buffer.
Niewłaściwe
przechowywanie materiału.
Zalecane jest przechowywanie próbek krwi w temp. -80°C.
Należy unikać częstego rozmrażania i zamrażania próbek.
Złoże minikolumny
zapycha się.
Niska wydajność
izolacji DNA.
Wyizolowane
DNA jest
podegradowane.
Obecność RNA w
Kolumna związała zarówno
wyizolowanym DNA. DNA, jak i RNA.
www.dnagdansk.com
Jeśli obecność RNA przeszkadza w dalszych aplikacjach
przeprowadzić trawienie RNA przy użyciu RNazy A
(patrz sekcja VIII. Szczególne zalecenia i uwagi).
10
Nr kat. EM05
Wyizolowane
DNA jest
niskiej czystości.
Niecałkowita degradacja
białek w związku z obniżoną
aktywnością proteinazy K.
Sporządzić świeży roztwór proteinazy K.
Upewnić się, że roztwór proteinazy K jest
przechowywany w temp. -20°C.
Pominięcie jednego z dwóch
etapów płukania.
Izolację należy powtórzyć, pamiętając
o obu etapach płukania.
Niecałkowite wysuszenie
kolumny z resztek
buforu płuczącego.
Izolację należy powtórzyć, zwracając szczególną
uwagę, aby po etapie wirowania (pkt.18) nie pozostało
żadnych resztek buforu płuczącego w minikolumnie.
XIII. BEZPIECZEŃSTWO I POSTĘPOWANIE Z PRODUKTEM
RBC BUFFER, BB BUFFER
Niebezpieczeństwo
H302, H315, H318, H319, P280, P305+P351+P338
PROTEINASE K
Niebezpieczeństwo
H315, H319, H334, H335, P261, P305+P351+P338, P342+P311
BW BUFFER
Niebezpieczeństwo
H225, H319, H336, P210, P261, P305+P351+P338
H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. H318
Powoduje poważne uszkodzenie oczu. H319 Działa drażniąco na oczy. H334 Może powodować objawy alergii lub
astmy lub trudności w oddychaniu w następstwie wdychania. H335 Może powodować podrażnienie dróg oddechowych.
H336 Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła/ iskrzenia/
otwartego ognia/ gorących powierzchni. Palenie wzbronione. P261 Unikać wdychania pyłu/ dymu/ gazu/ mgły/ par/
rozpylonej cieczy. P280 Stosować rękawice ochronne/ odzież ochronną/ ochronę oczu /ochronę twarzy. P305 + P351
+ P338 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe,
jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. P342 + P311 W przypadku wystąpienia objawów ze strony układu
oddechowego: Skontaktować się z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub z lekarzem.
11
www.dnagdansk.com