Zestaw do izolacji DNA z wymazów oraz nasienia

Nr kat. EM06
Wersja zestawu: 1.2014
Zestaw do izolacji DNA
z wymazów oraz nasienia
EXTRACTME® jest zastrzeżonym
znakiem towarowym firmy BLIRT S.A.
www.dnagdansk.com
Nr kat. EM06
I.
PRZEZNACZENIE ZESTAWU
Zestaw EXTRACTME DNA SWAB & SEMEN przeznaczony jest do szybkiej i wydajnej
izolacji genomowego DNA o wysokiej czystości z ludzkich oraz zwierzęcych
wymazów z błon śluzowych (m.in. z policzka, nosa, gardła, pochwy) oraz nasienia.
Protokół izolacji i składy buforów zostały zoptymalizowane w celu osiągnięcia
zarówno wysokiej wydajności, jak i czystości izolowanego DNA. Produkt
przeznaczony jest wyłącznie do użytku w celach badawczych.
II.
SKŁAD I PRZECHOWYWANIE ZESTAWU
25
IZOLACJI
100
IZOLACJI
250
IZOLACJI
3 IZOLACJE
(DEMO)
EM06-025
EM06-100
EM06-250
EM06-D
8,8 ml
35,2 ml
88 ml
1,1 ml
1 szt.
2 szt.
5 szt.
1 szt.
200 µl
640 µl
1,6 ml
200 µl
1 szt.
1 szt.
1 szt.
1 szt.
SSB Buffer (Binding Buffer)
8,8 ml
35,2 ml
88 ml
1,1 ml
SSW1 Buffer (Wash Buffer 1)
15 ml
60 ml
150 ml
1,8 ml
SSW2 Buffer (Wash Buffer 2)
10 ml
40 ml
100 ml
1,2 ml
5 ml
2 x 10 ml
5 x 10 ml
0,6 ml
DNA Purification Columns
25 szt.
2 x 50 szt.
5 x 50 szt.
3 szt.
Collection Tubes (2 ml)
25 szt.
2 x 50 szt.
5 x 50 szt.
3 szt.
LICZBA IZOLACJI
Nr katalogowy
SSL Buffer (Lysis Buffer)
Proteinase K (lyophilized)
Proteinase Buffer
DTT
Elution Buffer
Proteinaza K dostarczana jest w postaci liofilizowanej. Liofilizat proteinazy K
należy przechowywać w temp. +4°C. Przed pierwszym użyciem liofilizat należy
rozpuścić w odpowiedniej ilości buforu do proteinazy (Proteinase Buffer),
zgodnie z zaleceniami na etykiecie probówki. Roztwór proteinazy K należy
przechowywać w temp. -20°C!
DTT (ditiotreitol) należy przechowywać w temp. -20°C. Przed pierwszym
użyciem DTT należy rozpuścić w jałowej wodzie zgodnie z zaleceniami na
etykiecie probówki. Roztwór DTT należy przechowywać również w temp. -20°C!
3
Pozostałe składniki zestawu należy przechowywać w temp. pokojowej (15–25°C).
Wszystkie roztwory z zestawu należy przechowywać szczelnie zamknięte, aby
uniknąć zmiany stężeń w wyniku parowania. Odpowiednio przechowywany
zestaw zachowuje stabilność przez okres minimum 12 miesięcy.
III. WYMAGANE MATERIAŁY I SPRZĘT
pp
pp
pp
pp
pp
pp
pp
pp
jałowe pałeczki wymazowe
etanol 96–100% cz.d.a
jałowe probówki wirownicze typu Eppendorf (1,5–2 ml)
pipety automatyczne oraz odpowiednie końcówki do pipet
rękawiczki jednorazowe
mikrowirówka z rotorem na probówki o poj. 1,5–2 ml (> 11 tys. x g)
termoblok lub łaźnia wodna (do 70°C)
worteks
IV. ZASADA IZOLACJI
Procedura oczyszczania DNA składa się z 4 etapów i jest przeprowadzana
z wykorzystaniem minikolumn wirowniczych, zawierających odpowiednie
złoże krzemionkowe wydajnie i selektywnie wiążące kwasy nukleinowe. Próbka
wymazu lub nasienia poddawana jest lizie enzymatycznej z wykorzystaniem
zoptymalizowanego buforu SSL Buffer oraz silnej proteazy (proteinazy K),
a w przypadku izolacji DNA z nasienia dodatkowo DTT. W tym etapie następuje
degradacja błon oraz białek komórkowych. Po dodaniu soli chaotropowych i etanolu,
lizat przenoszony jest do minikolumny ze złożem. Dwuetapowe przemywanie
DNA związanego do złoża ma na celu usunięcie pozostałych zanieczyszczeń
i/lub inhibitorów reakcji enzymatycznych. Oczyszczone DNA eluowane jest
ze złoża buforem o niskiej sile jonowej (Elution Buffer) lub wodą (pH 7,0–9,0)
i jest gotowe do bezpośredniego wykorzystania w technikach biologii molekularnej
(takich jak PCR, qPCR, Southern blotting, sekwencjonowanie DNA, trawienie
enzymami restrykcyjnymi, ligacja DNA itp.) lub może być przechowywane
do późniejszego użycia.
V.
KONTROLA JAKOŚCI
Każda partia produkcyjna (LOT) zestawu EXTRACTME DNA SWAB & SEMEN
testowana jest według opracowanych procedur. Wydajność, czystość oraz
stabilność wyizolowanego DNA analizowane są metodami spektrofotometrycznymi
oraz elektroforetycznymi. Dodatkowo funkcjonalna jakość oczyszczonego
DNA sprawdzana jest w reakcji PCR, QPCR oraz reakcji trawienia enzymami
restrykcyjnymi.
www.dnagdansk.com
4
Nr kat. EM06
VI. SPECYFIKACJA PRODUKTU
MATERIAŁ WYJŚCIOWY
Wymazy (m.in. z policzka, nosa, gardła, pochwy, krwi, śliny) lub nasienie.
WYDAJNOŚĆ IZOLACJI
Zależy od rodzaju i ilości pobranego materiału.
Do 3 µg DNA dla próbki wymazu oraz 2–7 µg DNA dla 150 µl próbki nasienia.
POJEMNOŚĆ ZŁOŻA
ok. 25 µg DNA
CZAS IZOLACJI
45–50 minut (łącznie z lizą)
CZYSTOŚĆ DNA
A 260/A 280 = 1,7–1,9
VII. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
pp
pp
pp
pp
pp
5
Próbki wymazów oraz nasienia są materiałami niebezpiecznymi ze względu
na potencjalną zawartość mikroorganizmów patogennych lub substancji
zagrażających zdrowiu, bądź życiu człowieka. Przy pracy z próbkami
wymazów/nasienia należy stosować się do wymogów dotyczących
biologicznych materiałów niebezpiecznych.
Zaleca się przeprowadzać całą procedurę izolacji w komorze klasy II
bezpieczeństwa biologicznego, używać ochronnej odzieży laboratoryjnej
oraz rękawiczek jednorazowych.
Zalecane jest używanie jałowych końcówek z filtrami do pipet.
Należy unikać dotykania ścianek minikolumn pipetą, aby nie przenosić
śladowych ilości DNA pomiędzy kolejnymi minikolumnami.
Odpady zawierające sole guanidyny mogą tworzyć wysoce reaktywne
związki w połączeniu z substancjami utleniającymi. W przypadku rozlania
buforu, powierzchnię zmyć wodą z detergentem.
VIII. SZCZEGÓLNE ZALECENIA I UWAGI
Elucja DNA ze złoża
Optymalną objętość buforu elucyjnego (Elution Buffer) należy dobrać w zależności
od ilości i rodzaju materiału użytego do izolacji oraz od wymaganego poziomu
stężenia DNA w eluacie. Zaleca się stosowanie 50–100 μl Elution Buffer.
Ilość oczyszczonego DNA zależy od rodzaju próbki oraz ilości komórek w próbce
(jakości wymazu, specyfiki miejsca skąd pobrano materiał oraz zróżnicowania
osobniczego). Zwykle wydajność izolacji z 1 próbki wymazu z policzka wynosi
1–3 µg DNA, natomiast z 150 µl nasienia wynosi 2–7 µg DNA.
Jeśli pożądane jest otrzymanie DNA o wysokim stężeniu, objętość buforu
elucyjnego można zmniejszyć nawet do 20 μl. Należy mieć jednak na uwadze,
że obniży to wydajność odzysku DNA. Istotne w tym przypadku jest dodanie
buforu elucyjnego centralnie na powierzchnię złoża.
W celu uzyskania maksymalnej wydajności elucji DNA, bufor elucyjny należy
podgrzać do temp. 80°C i wydłużyć czas inkubacji złoża z buforem do 10 minut.
Maksymalny odzysk DNA można uzyskać poprzez przeprowadzenie dodatkowej
elucji (200 μl). W tym przypadku należy powtórzyć punkty 20–22 Protokołu
izolacji, umieszczając minikolumnę w nowej probówce 1,5 ml typu Eppendorf.
Elution Buffer zawiera 0,5 mM EDTA, którego obecność może przeszkadzać
w niektórych reakcjach enzymatycznych (np. sekwencjonowanie DNA).
Do elucji DNA można użyć także buforu 5-10 mM Tris-HCl, pH 8,0-9,0 lub innych
buforów do celów specjalnych, o pH i stężeniu soli zbliżonych do tego buforu.
Zanieczyszczenia RNA
Obecność śladowych ilości RNA może niekorzystnie wpływać na niektóre
reakcje enzymatyczne, ale nie wpływa na inhibicję PCR. Jeśli niezbędne jest
otrzymanie oczyszczonego preparatu genomowego DNA wolnego od RNA
należy dodać 4 μl roztworu RNazy A (10 mg/ml; nr kat. RP14, RP145) do próbki
po dodaniu SSL Buffer (pkt. 2 Protokołu izolacji). Wymieszać i inkubować
przez 5 min w 37°C, a następnie dodać odpowiednią ilość Proteinazy K,
a w przypadku izolacji DNA z nasienia dodatkowo 1 M DTT i kontynuować izolację
zgodnie z Protokołem izolacji.
IX. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI
A. NASIENIE
Próbkę nasienia należy pobrać do jałowego pojemnika. Zestaw pozwala na izolację
DNA zarówno z materiału świeżo pobranego, jak i mrożonego. Nasienie można
przechowywać w temp. +4°C przez krótki okres czasu, lub w postaci zamrożonej
www.dnagdansk.com
6
Nr kat. EM06
(preferowana temp. -80°C) przez dłuższy czas. Należy unikać częstego rozmrażania
i zamrażania próbek przed izolacją.
Przed pobraniem odpowiedniej objętości nasienia do izolacji należy dokładnie
wymieszać próbkę, z której materiał ma zostać pobrany.
Gdy objętość próbki nasienia jest mniejsza niż 150 µl, należy dodać Elution Buffer
lub roztworu PBS (brak w zestawie) do całkowitej objętości 150 µl, a następnie
przejść do pkt. 1 Protokołu izolacji z nasienia (sekcja XIA). Należy jednak mieć
na uwadze, że wydajność takiej izolacji DNA będzie niższa.
B. WYMAZY
W celu pobrania wymazu z błon śluzowych jamy ustnej należy co najmniej 10
razy mocno potrzeć jałową pałeczką wymazową wewnętrzną stronę policzka,
a następnie końcówkę z pobranymi komórkami nabłonka umieścić w probówce
1,5–2 ml typu Eppendorf i odciąć wystający patyczek. Jakakolwiek forma osuszania
wymazu nie jest konieczna. Należy upewnić się, że osoba, od której pobierano
wymaz nie spożywała pokarmów oraz płynów przez co najmniej 30 minut przed
pobraniem próbki. Użycie niskiej jakości materiału wyjściowego znacząco wpływa
na obniżenie wydajności izolacji DNA. Do wykonania wymazu można użyć każdej
komercyjnie dostępnej jałowej pałeczki wymazowej. Próbkę wymazu można
przechowywać w temp. +4°C przez krótki okres czasu lub w postaci zamrożonej
(preferowana temp. -80°C) przez dłuższy czas.
X.
PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO IZOLACJI
1.
2.
Każdy z odczynników zestawu należy wymieszać.
Należy pamiętać o rozpuszczeniu liofilizatu Proteinase K w odpowiedniej
ilości buforu do proteinazy (Proteinase Buffer) oraz DTT w wodzie,
zgodnie z zaleceniami na probówkach.
W przypadku wytrącenia osadu w buforach, butelkę z roztworem należy
ogrzać do temp. 37°C (bufory SSW1 i SSW2) lub 50–60°C (pozostałe
bufory) i inkubować, aż do całkowitego rozpuszczenia osadu, mieszając
co kilka minut, a następnie schłodzić do temp. pokojowej.
3.
4.
5.
6.
7.
7
Nagrzać termoblok lub łaźnię wodną do temp. 56°C.
Można ogrzać odpowiednią ilość buforu elucyjnego do temp. 70°C.
Należy pamiętać, aby wszystkie etapy izolacji przeprowadzać w temp.
pokojowej, jeśli nie zalecono inaczej.
Wszystkie etapy wirowania zostały zoptymalizowane z wykorzystaniem
mikrowirówki Eppendorf 5417C. Prędkości wirowania podane w jednostkach
rpm odnoszą się do tej mikrowirówki.
XI.
PROTOKÓŁ IZOLACJI
A.
NASIENIE
1.
Do 1,5–2 ml probówki typu Eppendorf pobrać 150 µl nasienia.
Sposób pobierania próbki opisano w sekcji IXA. Przygotowanie próbki.
2.
Dodać 350 µl buforu do lizy SSL Buffer, 6 µl Proteinase K oraz
20 µl 1M DTT, worteksować 3 s.
3. Przejść do pkt. 3 Protokołu izolacji DNA z wymazów (sekcja XIB).
B.
WYMAZY
1.
Końcówkę pałeczki wymazowej z pobranym materiałem
biologicznym umieścić w 1,5 ml probówce typu Eppendorf,
a następnie odciąć wystającą część pałeczki tak, aby możliwe
było swobodne zamknięcie probówki. Sposób pobierania wymazu opisano w sekcji IXB. Przygotowanie próbki.
2.
Dodać 350 µl buforu do lizy SSL Buffer oraz 6 µl Proteinase K,
worteksować 3 s.
3. Inkubować przez 30 min w temp. 56°C. Podczas inkubacji kilka razy
mieszać próbkę poprzez odwracanie probówki.
4. Dodać 350 µl buforu wiążącego SSB Buffer i worteksować 3 s.
5. Inkubować przez 6 min w temp. 70°C.
6. Dokładnie wycisnąć o ściankę probówki końcówkę pałeczki
wymazowej tak, aby odzyskać jak największą ilość lizatu.
Odrzucić pałeczkę wymazową.
Można nie usuwać pałeczki wymazowej z probówki, jednakże wpłynie to
na obniżenie wydajności izolacji DNA ze względu na niecałkowite naniesienie
lizatu na minikolumnę.
7.
www.dnagdansk.com
Dodać 200 µl 96–100% etanolu (brak w zestawie), wymieszać
poprzez kilkukrotne odwracanie probówki.
8
Nr kat. EM06
8. Przenieść 700 µl lizatu na złoże minikolumny umieszczonej
w probówce odbierającej.
9. Wirować 1 min przy 10–12 tys. rpm (11–15 tys. x g).
10. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej
z powrotem minikolumnę.
11. Nanieść całą pozostałą objętość lizatu na złoże minikolumny.
12. Wirować 1 min przy 10–12 tys. rpm (11–15 tys. x g).
13. Przenieść minikolumnę do nowej probówki odbierającej (2 ml).
14. Dodać do minikolumny 600 μl buforu płuczącego SSW1 Buffer
i wirować 30 s przy 10–12 tys. rpm (11–15 tys. x g).
15. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej
z powrotem minikolumnę.
16. Dodać do minikolumny 400 μl buforu płuczącego SSW2 Buffer
i wirować 30 s przy 10–12 tys. rpm (11–15 tys. x g).
17. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej
z powrotem minikolumnę.
18. Wirować 1-2 min przy 12–14 tys. rpm (15–21 tys. x g).
Bufor płuczący zawiera alkohol, który może powodować inhibicję niektórych
reakcji enzymatycznych, a także obniżenie wydajności elucji, dlatego istotne
jest jego całkowite usunięcie przed etapem elucji.
19. Ostrożnie wyjąć suchą minikolumnę z probówki odbierającej
i umieścić ją w jałowej probówce 1,5 ml typu Eppendorf.
20. Nanieść 50 –100 μl Elution Buffer uprzednio odgrzanego
do temp. 70°C centralnie na złoże w minikolumnie. Inkubować
minikolumnę z buforem przez 2 min.
21. Wirować 1 min przy 10–12 tys. rpm (11–15 tys. x g).
22. Minikolumnę usunąć, a wyizolowane DNA przechowywać
w temp. +4°C lub -20°C do czasu dalszych analiz.
9
XII. MOŻLIWE PROBLEMY I ICH ROZWIĄZYWANIE
Problem
Prawdopodobna przyczyna
Rozwiązanie
Złoże
minikolumny
zapycha się.
W próbce wymazu znajdują
się resztki pokarmów.
Należy powtórzyć izolację, zwracając szczególną uwagę,
aby osoba, od której zostanie pobrany wymaz z jamy ustnej
nie spożywała pokarmów przez co najmniej 30 min (patrz
sekcja IXB. Przygotowanie próbki).
Niska wydajność
izolacji DNA.
Nieprawidłowo wykonany
wymaz; wymaz pobrany
z miejsca o małej liczbie
złuszczających się komórek.
Podczas pobierania materiału upewnić się, że pałeczka
wymazowa mocno trze o nabłonek (patrz sekcja IXB.
Przygotowanie próbki).
Próbka nasienia pobrana
od oligospermicznego
mężczyzny.
Do izolacji DNA z nasienia użyć większą objętość ejakulatu,
zwiększając proporcjonalnie objętości poszczególnych
roztworów (SSL Buffer, Proteinase K, DTT, SSB Buffer)
oraz etanolu. Lizat nanosić na to samo złoże minikolumny
partiami po 700 µl. Po każdorazowym naniesniu lizatu,
kolumnę należy wirować 1 min przy 10–12 tys. rpm
(11–15 tys. x g) i odrzucić supernatant.
Niecałkowita liza komórek.
Wydłużyć czas inkubacji w temp. 56 °C,
mieszając próbkę poprzez odwracanie probówki.
Niecałkowite wysuszenie
kolumny z resztek buforu
płuczącego.
Izolację należy powtórzyć, zwracając szczególną uwagę,
aby po etapie wirowania (pkt.18) nie pozostało żadnych
resztek buforu płuczącego w minikolumnie.
Niecałkowita elucja DNA.
Przed naniesieniem na złoże podgrzać Elution Buffer
do temp. 80°C. Nanieść Elution Buffer centralnie na
powierzchnię złoża. Wydłużyć czas inkubacji z Elution
Buffer (powyżej 10 minut). Przeprowadzić powtórną elucję.
Zwiększyć objętość Elution Buffer do 200 μl.
Niewłaściwe pH buforu
elucyjnego lub wody (pH <7,0).
Do elucji użyć Elution Buffer.
Pobrany wymaz jest bardzo
niskiej czystości.
Podczas drugiego etapu płukania (pkt. 16 Protokołu
izolacji) nanieść 600 µl SSW2 Buffer, wirować 1 min przy
10–12 tys. rpm (11–15 tys. x g), a następnie przeprowadzić
etap wirowania suchej kolumny. Upewnić się, że osoba,
od której zostanie pobrany wymaz z jamy ustnej nie
spożywała pokarmów i płynów przez co najmniej 30 min.
Niecałkowita degradacja
białek w związku z obniżoną
aktywnością proteinazy K.
Sporządzić świeży roztwór proteinazy K.
Należy upewnić się, że roztwór proteinazy K jest
przechowywany w temp. -20°C.
Pominięto jeden z dwóch
etapów płukania.
Izolację należy powtórzyć, pamiętając o obu
etapach płukania.
Niecałkowite wysuszenie
minikolumny z resztek buforu
płuczącego.
Izolację należy powtórzyć, zwracając szczególną uwagę,
aby po etapie wirowania (pkt.18) nie pozostało żadnych
resztek buforu płuczącego w minikolumnie.
Wyizolowane
DNA jest
niskiej czystości.
www.dnagdansk.com
10
Nr kat. EM06
Wyizolowane
DNA jest
podegradowane.
Niewłaściwe
przechowywanie materiału.
Zalecane jest przechowywanie wymazów
i próbek nasienia w temp. -80°C. Należy unikać
częstego rozmrażania i zamrażania próbek.
Obecność RNA
w wyizolowanym
DNA.
Kolumna związała zarówno
DNA, jak i RNA.
Jeśli obecność RNA przeszkadza w dalszych aplikacjach
przeprowadzić trawienie RNA przy użyciu RNazy A
(patrz sekcja VIII. Szczególne zalecenia i uwagi).
XIII. BEZPIECZEŃSTWO I POSTĘPOWANIE Z PRODUKTEM
SSL, SSB BUFFER
Niebezpieczeństwo
H302, H315, H318, H319,
P280, P313, P302+P352, P305+P351+P338
PROTEINASE K
Niebezpieczeństwo
H315, H319, H334, H335,
P261, P305+P351+P338, P342+P311, P302+P352
DTT
Uwaga
H302, H315, H319, H335,
P261, P280, P305+P351+P338, P302+P352
SSW1, SSW2 BUFFER
Niebezpieczeństwo
H225, H319, H336, P210, P233, P305+P351+P338
H225 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H315 Działa drażniąco na skórę. H318 Powoduje poważne
uszkodzenie oczu. H319 Działa drażniąco na oczy. H334 Może powodować objawy alergii lub astmy lub trudności w oddychaniu
w następstwie wdychania. H335 Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. H336 Może wywoływać uczucie senności lub
zawroty głowy. P210 Przechowywać z dala od źródeł ciepła/ iskrzenia/ otwartego ognia/ gorących powierzchni. Palenie wzbronione.
P261 Unikać wdychania pyłu/ dymu/ gazu/ mgły/ par/ rozpylonej cieczy. P280 Stosować rękawice ochronne/ odzież ochronną/ ochronę
oczu /ochronę twarzy. P305 + P351 + P338 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć
soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. P342 + P311 W przypadku wystąpienia objawów ze strony układu
oddechowego: Skontaktować się z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub z lekarzem. P302 + P352 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ NA SKÓRĘ: Umyć
dużą ilością wody z mydłem.
11
www.dnagdansk.com