Zestaw do izolacji DNA z żeli agarozowych
advertisement
Nr kat. EM08 Wersja zestawu: 1.2014 Zestaw do izolacji DNA z żeli agarozowych www.dnagdansk.com 2 Nr kat. EM08 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME DNA GEL–OUT przeznaczony jest do szybkiej i wydajnej izolacji fragmentów DNA bezpośrednio z żeli agarozowych (ze standardowej lub niskotopliwej agarozy w buforze TAE lub TBE). Podczas procesu ekstrakcji usunięte zostają agaroza, bromek etydyny oraz inne zanieczyszczenia obecne w próbce. Zestaw umożliwia oczyszczanie fragmentów DNA o wielkościach od 50 pz do 30 kpz, a także genomowego i plazmidowego DNA. Izolacja cząsteczek DNA mniejszych od 100 pz oraz większych od 10 kpz zachodzi jednak z obniżoną wydajnością. Protokół izolacji i składy buforów zostały zoptymalizowane w celu osiągnięcia zarówno wysokiego odzysku, jak i czystości izolowanego DNA. Produkt przeznaczony jest wyłącznie do użytku w celach badawczych. II. SKŁAD I PRZECHOWYWANIE ZESTAWU 50 IZOLACJI 150 IZOLACJI 250 IZOLACJI 3 IZOLACJE (DEMO) EM08–050 EM08–150 EM08–250 EM08–D GB Buffer (Binding Buffer) 25 ml 75 ml 125 ml 1,5 ml GW Buffer (conc.) (Wash Buffer) 15 ml 45 ml 75 ml 4,2 ml** Elution Buffer 10 ml 3 x 10 ml 5 x 10 ml 0,6 ml DNA Purification Columns 50 szt. 3 x 50 szt. 5 x 50 szt. 3 szt. Collection Tubes (2 ml) 50 szt. 3 x 50 szt. 5 x 50 szt. 3 szt. LICZBA IZOLACJI Nr katalogowy * Przed pierwszym użyciem do roztworu GW Buffer należy dodać odpowiednią ilość 96–100% etanolu (informacja na etykietach oraz w poniższej tabeli). Po dodaniu etanolu zalecane jest oznaczenie butelki. * LICZBA IZOLACJI 50 IZOLACJI 150 IZOLACJI 250 IZOLACJI Nr katalogowy EM08–050 EM08–150 EM08–250 GW Buffer 15 ml 45 ml 75 ml Etanol 96–100% 60 ml 180 ml 300 ml Całkowita objętość 75 ml 225 ml 375 ml Wszystkie składniki zestawu należy przechowywać w temp. pokojowej (15–25°C). GB Buffer należy chronić przed dostępem światła. Wszystkie roztwory z zestawu należy przechowywać szczelnie zamknięte, aby uniknąć zmiany stężeń w wyniku parowania. Odpowiednio przechowywany zestaw zachowuje stabilność przez okres minimum 12 miesięcy. 3 ** Uwaga: w zestawie DEMO (EM08–D) GW Buffer zawiera już etanol. III. WYMAGANE MATERIAŁY I SPRZĘT pp pp pp pp pp pp pp pp pp etanol 96–100% cz.d.a. czysty skalpel lub żyletka jałowe probówki wirownicze typu Eppendorf (1,5–2 ml) pipety automatyczne oraz odpowiednie końcówki do pipet rękawiczki jednorazowe transiluminator mikrowirówka z rotorem na 1,5–2 ml probówki (> 11 tys. x g) termoblok lub łaźnia wodna (do 70°C) 3 M octan sodu, pH 5,2 (w nielicznych przypadkach) IV. ZASADA IZOLACJI Procedura oczyszczania DNA przeprowadzana jest z wykorzystaniem minikolumn wirowniczych, zawierających odpowiednie złoże wydajnie i selektywnie wiążące kwasy nukleinowe. W pierwszym etapie wycięty z żelu agarozowego bloczek, zawierający fragment DNA, inkubowany jest w buforze GB, który ułatwia rozpuszczanie agarozy oraz powoduje denaturację białek. Dodatkowo bufor ten zawiera barwnik, który umożliwia kontrolowanie pH roztworu odpowiedniego dla efektywnego wiązania DNA do złoża w minikolumnie. Dwuetapowe przemywanie DNA związanego do złoża ma na celu usunięcie pozostałych zanieczyszczeń i/lub inhibitorów reakcji enzymatycznych. Oczyszczone DNA eluowane jest ze złoża buforem o niskiej sile jonowej (Elution Buffer) lub wodą (pH 7,0–9,0) i gotowe jest do bezpośredniego wykorzystania w technikach biologii molekularnej (takich jak PCR, qPCR, Southern blotting, sekwencjonowanie, ligacja DNA, trawienie enzymami restrykcyjnymi itp.) lub może być przechowywane do późniejszego użycia. V. KONTROLA JAKOŚCI Każda partia produkcyjna (LOT) zestawu EXTRACTME DNA GEL–OUT testowana jest według opracowanych procedur. Wydajność, czystość oraz stabilność wyizolowanego DNA analizowane są metodami spektrofotometrycznymi oraz elektroforetycznymi. Dodatkowo funkcjonalna jakość oczyszczonego DNA sprawdzana jest w reakcji PCR, qPCR oraz reakcji trawienia enzymami restrykcyjnymi. www.dnagdansk.com 4 Nr kat. EM08 VI. SPECYFIKACJA PRODUKTU MATERIAŁ WYJŚCIOWY Bloczek agarozowy o masie do 300 mg ODZYSK 70–95% w zależności od wielkości fragmentu DNA (w zakresie 100–10.000 pz) WIELKOŚĆ IZOLOWANYCH FRAGMENTÓW DNA 100–10.000 pz Możliwa jest również izolacja fragmentów DNA w zakresach 50–100 pz i 10–30 kpz, a także genomowego i plazmidowego DNA, lecz z obniżoną wydajnością. POJEMNOŚĆ ZŁOŻA ok. 25 µg DNA CZAS IZOLACJI 16–20 minut CZYSTOŚĆ DNA A 260/A 280 = 1,7–1,9 VII. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI pp pp pp pp 5 W przypadku, gdy do wizualizacji wyników elektroforezy używany jest bromek etydyny lub inne związki chemiczne interkalujące w DNA, należy używać ochronnej odzieży laboratoryjnej oraz jednorazowych rękawiczek nitrylowych. Podczas operacji wycinania DNA z żelu należy zachować środki ostrożności w postępowaniu z promieniowaniem UV (odzież ochronna, okulary, rękawiczki nitrylowe). Należy unikać dotykania ścianek minikolumn pipetą, aby nie przenosić śladowych ilości DNA pomiędzy kolejnymi minikolumnami. Odpady zawierające sole guanidyny mogą tworzyć wysoce reaktywne związki w połączeniu z substancjami utleniającymi. W przypadku rozlania buforu, powierzchnię zmyć wodą z detergentem. VIII. SZCZEGÓLNE ZALECENIA I UWAGI Elucja DNA ze złoża Optymalną objętość buforu elucyjnego (Elution Buffer) należy dobrać w zależności od ilości materiału użytego do izolacji oraz od wymaganego poziomu stężenia DNA w eluacie. Zaleca się stosowanie 30–100 μl Elution Buffer. Jeśli pożądane jest otrzymanie DNA o wysokim stężeniu, objętość buforu elucyjnego można zmniejszyć do 20 μl. Należy mieć jednak na uwadze, że może to obniżyć wydajność odzysku DNA. Istotne w tym przypadku jest dodanie buforu elucyjnego centralnie na powierzchnię złoża. W celu uzyskania maksymalnej wydajności elucji DNA, bufor elucyjny należy podgrzać do temp. 80°C i wydłużyć czas inkubacji złoża z buforem do 10 minut. Jeśli istotne jest odzyskanie całkowitego DNA z minikolumny można przeprowadzić dodatkową elucję (200 μl). W tym przypadku należy powtórzyć pkt. 11-14 Protokołu izolacji DNA (sekcja XI), umieszczając minikolumnę w nowej probówce 1,5 ml typu Eppendorf. Elution Buffer nie zawiera EDTA, którego obecność może niekorzystnie wpływać na niektóre reakcje enzymatyczne. Kontrolowanie poziomu pH GB Buffer zawiera wskaźnik pH, pozwalający na sprawdzenie czy pH mieszaniny jest mniejsze niż 7,5 (kolor żółty), co gwarantuje wydajną adsorpcję DNA do złoża minikolumny. Gdy pH jest wyższe niż 7,5, roztwór zmieni barwę na różową. Może się tak zdarzyć w nielicznych przypadkach, np. gdy stosowany bufor elektroforetyczny był wielokrotnie używany lub błędnie przygotowany. Konieczne jest wtedy dodanie 10 µl 3 M octanu sodu (pH 5,2), który obniżając pH próbki zapewni wydajne wiązanie DNA do złoża. Wzrost pH powyżej wartości 7,5 powoduje diametralny spadek adsorpcji DNA do złoża w minikolumnie. IX. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI 1. 2. www.dnagdansk.com Prowadzić elektroforezę w żelu przygotowanym z agarozy niskotopliwej lub o standardowej temperaturze topnienia, w buforze TAE lub TBE, do momentu wystarczającego rozdzielenia fragmentów DNA. Nie zaleca się stosować zbyt wysokiego napięcia podczas rozdziału elektroforetycznego, gdyż może to spowodować wzrost temperatury buforu elektroforetycznego i doprowadzić do degradacji DNA. Należy używać świeżo przygotowanego buforu, zarówno do przeprowadzenia elektroforezy, jak i przygotowania żelu. Zważyć probówkę 1,5–2 ml typu Eppendorf. 6 Nr kat. EM08 3. 4. 5. Przy pomocy czystego i ostrego skalpela lub żyletki wyciąć prążek DNA w taki sposób, aby pozbyć się nadmiaru agarozy (całkowita masa wyciętego bloczka agarozy nie powinna przekraczać 300 mg). Skalpel oraz powierzchnia transiluminatora powinny być uprzednio oczyszczone np. przy pomocy 5% roztworu H2O2. Operację wycinania prążka DNA należy wykonać możliwie szybko, aby zminimalizować oddziaływanie promieniowania UV na izolowane DNA. Jest to szczególnie istotne, gdy wyizolowane DNA będzie bezpośrednio wykorzystywane w reakcjach sekwencjonowania i/lub klonowania. Przenieść wycięty bloczek agarozowy do probówki 1,5–2 ml, a następnie zważyć. Jeśli masa bloczka agarozowego przekracza 300 mg należy podzielić bloczek na mniejsze fragmenty i przenieść do kolejnych probówek 1,5–2 ml. Przed oczyszczaniem fragment agarozy zawierający DNA może być przechowywany w temp. +4°C lub -20°C nie dłużej niż tydzień, w szczelnie zamkniętej probówce, w warunkach wolnych od deoksyrybonukleaz (DNaz). X. PRZED PRZYSTĄPIENIEM DO IZOLACJI 1. 2. Każdy z odczynników zestawu należy wymieszać. Należy upewnić się czy do GW Buffer został dodany etanol. Jeśli nie, należy dodać odpowiednią ilość 96–100% etanolu (ilości podane są na etykietach oraz w tabeli w sekcji II). W przypadku wytrącenia osadu w buforach GB lub GW, butelkę z roztworem należy ogrzać do temp. 37°C (GW Buffer) lub 50–60°C (pozostałe bufory) i inkubować, aż do całkowitego rozpuszczenia osadu, mieszając co kilka minut, a następnie schłodzić do temp. pokojowej. Nagrzać termoblok lub łaźnię wodną do temp. 50°C. Ogrzać odpowiednią ilość buforu elucyjnego do temp. 70°C. Należy pamiętać, aby wszystkie etapy izolacji przeprowadzać w temp. pokojowej, jeśli nie zalecono inaczej. Wszystkie etapy wirowania zostały zoptymalizowane z wykorzystaniem 3. 4. 5. 6. 7. mikrowirówki Eppendorf 5417C. Prędkości wirowania podane w jednostkach rpm odnoszą się do tej mikrowirówki. 7 XI. PROTOKÓŁ IZOLACJI 1. Wyciąć z żelu bloczek agarozowy zawierający DNA, a następnie umieścić w probówce 1,5–2 ml typu Eppendorf. Masa bloczka agarozowego nie powinna przekraczać 300 mg. Więcej wskazówek znajduje się w sekcji IX. Przygotowanie próbki. 2. Dodać 500 µl GB Buffer i wymieszać poprzez kilkukrotne odwracanie probówki. 3. Inkubować mieszaninę w temp. 50°C przez 5–10 min lub do momentu całkowitego rozpuszczenia agarozy. Podczas inkubacji kilka razy mieszać próbkę poprzez kilkukrotne odwracanie probówki. Przed przystąpieniem do dalszych czynności należy upewnić się, że agaroza została całkowicie rozpuszczona. Kolor mieszaniny powinien być żółty. Jeżeli po rozpuszczeniu agarozy roztwór zmienił barwę na różową, należy dodać 10 µl 3 M roztworu octanu sodu o pH 5,2 i wymieszać (patrz sekcja VIII. Szczególne zalecenia i uwagi). 4. Krótko odwirować próbkę w celu odzyskania resztek roztworu z wieczka probówki, a następnie przenieść maksymalnie 800 µl mieszaniny na złoże minikolumny umieszczonej w probówce odbierającej i wirować 1 min przy 10–12 tys. rpm (11–15 tys. x g). Jeżeli mieszanina ma większą objętość niż 800 µl, po odwirowaniu wylać przesącz z probówki odbierającej, umieścić w niej z powrotem minikolumnę i nanieść pozostałą część mieszaniny na złoże. 5. Przenieść minikolumnę do nowej probówki odbierającej (2 ml). www.dnagdansk.com 8 Nr kat. EM08 6. Dodać do minikolumny 700 μl GW Buffer i wirować 30 s przy 10–12 tys. rpm (11–15 tys. x g). 7. Wylać przesącz z probówki odbierającej i umieścić w niej z powrotem minikolumnę. 8. Powtórzyć etapy 6–7. 9. Wirować 1-2 min przy 12–14 tys. rpm (15–21 tys. x g). Bufor płuczący zawiera alkohol, który może powodować inhibicję niektórych reakcji enzymatycznych, a także obniżenie wydajności elucji, dlatego istotne jest jego całkowite usunięcie przed etapem elucji. 10. Ostrożnie wyjąć suchą minikolumnę z probówki odbierającej i umieścić ją w jałowej probówce 1,5 ml typu Eppendorf. 11. Nanieść 50-100 μl Elution Buffer uprzednio ogrzanego do temp. 70°C centralnie na złoże w minikolumnie. Możliwa jest zmiana objętości buforu elucyjnego w zakresie 20–200 µl. Więcej wskazówek do tego etapu znajduje się w sekcji VIII. Szczególne zalecenia i uwagi. 12. Inkubować minikolumnę z buforem elucyjnym przez 2 min. 13. Wirować 1 min przy 10–12 tys. rpm (11–15 tys. x g). 14. Minikolumnę usunąć, a wyizolowane DNA przechowywać w temp. +4°C lub -20°C do czasu dalszych analiz. 9 XII. MOŻLIWE PROBLEMY I ICH ROZWIĄZYWANIE Problem Prawdopodobna przyczyna Rozwiązanie Niska wydajność izolacji DNA. Niecałkowicie rozpuszczony bloczek agarozowy. Wydłużyć czas inkubacji w temp. 50°C do momentu rozpuszczenia agarozy. Po rozpuszczeniu agarozy, dla pewności przedłużyć inkubację o dodatkowe 5 minut. Nieefektywne wiązanie DNA do złoża. Upewnić się, że po rozpuszczeniu agarozy mieszanina posiada żółte zabarwienie. W przypadku zmiany barwy na różową, należy dodać 10 µl 3 M octanu sodu o pH 5,2. Niedodany etanol do buforu płuczącego. Upewnić się, że 96–100% etanol został dodany w odpowiedniej ilości do GW Buffer. Niecałkowita elucja DNA. Przed naniesieniem na złoże podgrzać Elution Buffer do temp. 80°C. Nanieść Elution Buffer centralnie na powierzchnię złoża. Wydłużyć czas inkubacji z Elution Buffer do 10 minut. Przeprowadzić powtórną elucję. Zwiększyć objętość Elution Buffer do 200 μl. Niewłaściwe pH buforu elucyjnego lub wody (pH <7,0). Do elucji użyć Elution Buffer. Zatkane złoże kolumny. Niecałkowicie rozpuszczony bloczek agarozowy. Wydłużyć czas inkubacji w temp. 50°C do momentu rozpuszczenia agarozy. Po rozpuszczeniu agarozy, dla pewności przedłużyć inkubację próbki o dodatkowe 5 minut. Inhibicja enzymatycznej obróbki wyizolowanego DNA. Obecność soli w próbce. Wszystkie etapy wirowania przeprowadzać w temp. pokojowej. Upewnić się, że w GW Buffer nie wytrącił się osad. Obecność agarozy w próbce. Wydłużyć czas inkubacji w temp. 50°C do momentu rozpuszczenia agarozy. Dla pewności przedłużyć inkubację próbki o dodatkowe 5 minut. Obecność etanolu w próbce. Po każdym etapie płukania usuwać przesącz z probówki odbierającej. Upewnić się, że po etapie wirowania (pkt. 9 Protokołu izolacji) nie pozostały w minikolumnie resztki buforu płuczącego, w przeciwnym wypadku należy powtórzyć wirowanie. Błędne wyniki Zbyt długa ekspozycja sekwencjonowania DNA. próbki na promienie UV. www.dnagdansk.com Skrócić czas operacji związanych z wycinaniem DNA z żelu. Zanieczyszczony bufor do elektroforezy. Używać świeżo przygotowanego buforu, zarówno do prowadzenia elektroforezy, jak i przygotowania żelu. Zanieczyszczony sprzęt. Oczyścić skalpel i powierzchnię transiluminatora przed wycinaniem bloczka agarozowego. 10 Nr kat. EM08 Nieostre prążki w obrazie elektroforetycznym. Obecność nukleaz w buforze do elektroforezy. Używać świeżego, wolnego od DNaz buforu do prowadzenia elektroforezy oraz przygotowania żelu agarozowego. Przechowywać żel agarozowy w temp. +4°C w warunkach wolnych od DNaz nie dłużej niż kilka dni. DNA wypływa ze studzienek w żelu agarozowym. Obecność nukleaz w buforze elucyjnym. Wymienić zanieczyszczony bufor elucyjny na nowy. Gdy do elucji zamiast Elution Buffer używa się wody, upewnić się, że jest ona wolna od DNaz. Obecność etanolu w próbce. Po każdym etapie płukania usuwać przesącz z probówki odbierającej. Upewnić się, że po etapie wirowania (pkt. 9 Protokołu izolacji) nie pozostały w minikolumnie resztki buforu płuczącego, w przeciwnym wypadku należy powtórzyć wirowanie. XIII. BEZPIECZEŃSTWO I POSTĘPOWANIE Z PRODUKTEM GB BUFFER Niebezpieczeństwo H302, H312, H315, H319, H331, H335, P261, P273, P280, P405, P305+P351+P338, P302+P352 H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H312 Działa szkodliwie w kontakcie ze skórą. H315 Działa drażniąco na skórę. H319 Działa drażniąco na oczy. H331 Działa toksycznie w następstwie wdychania. H335 Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. P261 Unikać wdychania pyłu/ dymu/ gazu/ mgły/ par/ rozpylonej cieczy. P273 Unikać uwolnienia do środowiska. P280 Stosować rękawice ochronne/ odzież ochronną. P405 Przechowywać pod zamknięciem. P305 + P351 + P338 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Nadal płukać. P302 + P352 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ NA SKÓRĘ: Umyć dużą ilością wody z mydłem. 11 www.dnagdansk.com
