oznaczanie stężenia dna na żelu agarozowym
advertisement
ĆWICZENIE NR 2 1. Ocena ilościowa i jakościowa preparatów DNA i RNA. 2. Rozdział elektroforetyczny kwasów nukleinowych. 3. Przygotowanie żelu agarozowego. 4. Elektroforetyczny rozdział wyizolowanego DNA. Ocena stężenia i jakości DNA roślinnego na żelu. Ocena spektrofotometryczna stężenia DNA. 5. Rozcieńczanie DNA z uwzględnieniem pomiarów stężenia DNA na żelu agarozowym oraz pomiarów spektrofotometrycznych. 6. Dokumentacja zdjęć rozdziałów elektroforetycznych. 1. Oznaczanie stężenia i czystości DNA a) elektroforeza na żelu agarozowym Elektroforeza – ruch naładowanych cząstek w zewnętrznym polu elektrycznym. Czynniki wpływające na prędkość migracji DNA w żelu: a) wielkość cząstek DNA – prędkość migracji cząstek liniowych jest odwrotnie proporcjonalna do log10 z ilości par zasad b) stężenie agarozy (wzrost stężenia --> spowolnienie rozdziału --> wzrost dokładności rozdziału) c) konformacja DNA (Supercoiled – superzwinięte koliste DNA; Nicked circles – koliste DNA; Linear – liniowe DNA) d) składu nukleotydowego rozdzielanego fragmentu (konformacje jednoniciowe) e) rodzaj, skład, siła jonowa buforu – przy braku jonów DNA nie migruje lub migruje bardzo wolno, zbyt dużo jonów – wydziela się dużo ciepła, żel się topi a DNA denaturuje, TAE mała pojemność buforowa, przy anodzie (+) powstają jony H+ i mogą zakwasić bufor, jeśli zostanie objęty też żel to może dojść do degradacji DNA – prążki mogą się rozmywać – mała siła jonowa – wolna migracja DNA. Czyli jak zostanie przekroczona krytyczna wartość dla pojemności buforowej to na anodzie oprócz O2 powstają jony H+. Pojemność buforowa – ilość mocnego kwasu lub mocnej zasady wyrażona w molach, która dodana do 1dm3 roztworu buforowego zmienia jego pH o jedną jednostkę. Bufor to słaby kwas + sprzężona z nim zasada (w formie soli tego kwasu np. CH3COOH + CH3COONa lub słaba zasada + sprzężony z nią kwas w postaci soli tej zasady np. NH 4OH + NH4Cl. f) napięcie prądu – 5V/cm (odcinek pomiędzy elektrodami) przy niskich napięciach prąd jest proporcjonalny do tempa migracji, przy wzroście napięcia przyśpieszenie dużych cząsteczek zmienia się nieproporcjonalnie do prądu, efektywny zakres rozdziału zmniejsza się wraz ze wzrostem napięcia. Napięcie (U) to praca potrzebna do przeniesienia ładunku z punktu A do B do wartości tego ładunku. Natężenie (I) – stosunek wartości ładunku elektrycznego przepływającego przez wyznaczoną powierzchnię do czasu przepływu ładunku. U=I*R (Ropór) g) obecnośc EtBr (wypadkowy ładunek dodatni, migruje w kierunku przeciwnym niż DNA, spowalnia tempo migracji o 15%). h) kierunek działania prądu –dotyczy tylko dużych fragmentów DNA – elektroforeza pulsacyjna – dotyczy DNA wielkości 50-5000 kB. Jeżeli zmienia się kierunek prądu to cząstki większe wolniej zmieniają kierunek niż mniejsze, dzięki temu można je rozdzielić Bufor obciążający: - ułatwia ładowanie próbek do studzienek, - wskazuje na postęp migracji fragmentów DNA, - zawiera zwykle glicerol i barwniki: Składnik prędkość migracji w agarozie 0,5-1,5% (pz dsDNA) błękit bromofenolowy 500 -400 ksylen cyjanu 10 000-4 000 Oranż G <100 bp prędkość migracji w agarozie 2-3% (pz dsDNA) 150-50 750-200 UV – promieniowanie o długości fali krótszej niż światło widzialne i dłuższej niż promieniowanie rentgenowskie. Zakres długości fali 100-380nm. b) określanie stężenia DNA na agarozie Zawartość DNA w badanych próbkach jest porównywalna do szeregu standardów stężeń DNA. O stężeniu wnioskujemy na podstawie porównania intensywności fluorescencji w badanej próbie i standardach (lub markera masy). Intensywność fluorescencji jest proporcjonalna do całkowitej masy DNA. Przybliżone stężenie (błąd ±10ng) może być określone „na oko”. Większą precyzję można osiągnąć używając programów do analizy żeli, które dokonują pomiarów densytometrycznych. Ocena DNA na żelu pozwala na określenie stopnia jego degradacji i zanieczyszczeń przez RNA. Wysokocząsteczkowe DNA (wielkości powyżej 50kb) jest widoczne w postaci dobrze wyodrębnionego prążka. Smuga DNA poniżej prążka wskazuje na mechaniczną lub/i chemiczną degradację. Dodatkowy prążek, mniej ostry, wskazuje na obecność RNA. Jeśli rozdzielane jest tylko RNA, widocznych jest kilka prążków mniejszych niż 20 kb - odpowiadają one różnym rodzajom RNA. Elektroforeza w żelach agarozowych i poliakrylamidowych - standardowa metoda rozdziału, identyfikacji bądź oczyszczania fragmentów DNA - szybka i pozwala na wycięcie i oczyszczenie fragmentu z żelu i dalsze wykorzystanie do klonowania. - żele agarozowe i poliakrylamidowe mogą mieć różne kształty, rozmiary i porowatość - żele poliakrylamidowe - elektroforeza pionowa - są używane do rozdziału fragmentów wielkości 5-500bp, różniących się wielkością nawet o 1bp. - żele agarozowe – elektroforeza pozioma - mają mniejszą precyzję rozdziału (do ~ 3-4 pz), do rozdziału fragmentów od 200 bp do 10kb. Rozdział fragmentów wielkości powyżej 10kb odbywa się w trakcie elektroforezy pulsacyjnej, o zmieniającym się okresowo kierunku przepływu prądu. - agaroza - liniowy polimer D-galaktozy i 3,6-anhydro-L-galaktozy uzyskiwany z glonów morskich. Obecnie dostępne są na rynku agarozy o różnym stopniu oczyszczenia oraz agarozy zmodyfikowane, charakteryzujące się niższymi temperaturami topnienia i zestalania oraz umożliwiające rozdział fragmentów wielkości od 10 do 500pz. - ilość DNA w prążku nie powinna przekraczać 500 ng, fragment DNA o stężeniu powyżej 500 ng, po rozdziale na żelu agarozowym (1,5%) rozlewa się i ciągnie tym bardziej im większe są fragmenty DNA. - objętość nakładanej próbki ~ od objętość studzienki, (np. 0,5cm x 0,5cm x 0,15cm daje objętość 37,5μl, aby nie dopuścić do kontaminacji próbek nie należy całkowicie wypełniać studzienek) - marker wielkości DNA powinien być ładowany po obu brzegach żelu i rozdzielany równocześnie z badanymi próbkami. - w trakcie elektroforezy bromek etydyny migruje do katody, czyli w kierunku przeciwnym niż DNA. Uważa się, że rozdział w obecności bromku etydyny powoduje mniejszą ostrość prążków i stąd zalecane jest barwienie żelu po rozdziale, przez 30-45min w 0,5 μg/ml roztworze bromku etydyny. c) barwienie DNA w żelu agarozowym - bromek etydyny (EtBr) interkaluje pomiędzy zasady DNA (nie tylko badanej próby – dlatego należy zachować ostrożność). Barwienie dsDNA jest 10X czulsze niż barwienie ssDNA, czy RNA - promieniowanie UV, 254nm jest absorbowane przez DNA i przekazywane do barwnika, promieniowanie to jest wzbudza bromek etydyny (o max absorbancji dł. 302 i 366nm) i reemitowana jest fluoresencja przy długości fali 590nm, jako światło widzialne, w pomarańczowo-czerwonej części widma - fluorescencja barwnika związanego z DNA wielokrotnie (20x) przewyższa intensywność fluorescencji wolnego barwnika w żelu. Odbarwienie żelu powodujące rozjaśnienie tła, niezbędne do wizualizacji małych ilości DNA (poniżej 10ng), zachodzi poprzez inkubację żelu w wodzie lub siarczanie magnezu przez 20 min. w temp. pokojowej - fluorescencja EtBr jest wychwytywana przez polikarylamid, ograniczając wrażliwość 10-20 krotnie na żelach poliakrylamidowych - granica detekcji DNA na żelu agarozowym barwionym EtBr wynosi 10-20 (do 1-5) ng DNA. d) spektrofotometryczny pomiar stężenia DNA - bezpośredni pomiar stężenia DNA, RNA, oligonukleotydów a nawet mononukleotydów w formie rozcieńczonej lub nierozcieńczonej w roztworze wodnym - idealne bufory do tego typu pomiarów mają niskie stężenie jonów (np. bufor TE). - pomiar absorpcji A - gęstości optycznej (OD) w świetle ultrafioletowym (czasem też w zakresie światła widzialnego) - spektrofotometryczny pomiar ilości UV zaabsorbowanego przez zasady w DNA jest prosty i dokładny jeśli próbka jest czysta (bez znacznych ilości zanieczyszczeń białkowych, fenolowych czy agarozy) Długość fali (nm) substancje absorbujące 230 EDTA, polisacharydy, etanol 260 DNA, RNA 270 fenol 280 białka 320 drobiny komórkowe - interferencja wynikająca z zanieczyszczeń próbki może być określana poprzez wyznaczenie współczynnika A260/A280: - w przypadku czystego DNA A260/A280 = ok. 1.8 - dla czystego RNA A260/A280 = ok. 2.0 - A260/A280 < 1.8 świadczy o zanieczyszczeniach białkowych - współczynnik A260/A230 = ok. 2.2 dla próbek czystych - dla próbek zanieczyszczonych niemożliwe będzie dokładne ustalenie ilości DNA metodą spektrofotometryczną - zanieczyszczenia próbki DNA przez RNA nie mogą być w sposób jednoznaczny zidentyfikowane spektrofotometrycznie - absorbancja przy długości fali 325 nm - wyznacznik wytrąceń w roztworze oraz zanieczyszczeń kuwety. Wszystkie cząsteczki absorbują kwanty energii przy specyficznej długości fali, dzięki czemu możliwa jest ekstrapolacja stężenia związku w roztworze. Według prawa Lamberta-Beera istnieje liniowa zależność pomiędzy absorbancją A (gęstość optyczna OD) a stężeniem makrocząsteczek, która określana jest następującym wzorem: A=OD=lc Gdzie jest molowym współczynnikiem absorpcji, c to stężenie substancji w próbie, a l to grubość warstwy absorbującej (szerokość kuwety). Dla warstwy absorbującej 10 mm, przy długości fali 260 nm, absorpcja o wielkości A=1 odpowiada około 50 g/ml dwuniciowego dsDNA, około 33 g/mL jednoniciowego ssDNA, 40 g/ml RNA i około 30 g/ml oligonukleotydów. e) Oznaczanie stężenia kwasów nukleinowych Wybór kuwety Ilość roztworu kwasu nukleinowego, który możemy użyć do oznaczeń absorbancji A, zależy od pojemności stosowanej kuwetki. Wybór kuwetki powinien zależeć od przewidywanej ilości DNA, współczynnika rozcieńczenia próbki i objętości próbki jaką dysponujemy. Do pomiarów spektroskopowych niewielkich objętości kwasów nukleinowych polecanych jest kilka typów kuwetek o niewielkiej pojemności – od 5 do 70 uL. Nastawienie pomiarów. W celu kalibracji spektrofotometru, ważne jest by: - ustalić właściwą wielkość kuwety (grubość warstwy absorbującej) - ustalić właściwy współczynnik (zależy czy matrycą jest dsDNA, ssDNA, czy RNA) - wykonać pomiar dla próby ślepej, zawierającej wodę lub bufor, w którym rozpuszczono próbkę (A260 = 0) - upewnić się, czy ślepa próbka mierzona jest periodycznie - wykonać pomiary dla próbek referencyjnych o znanym stężeniu dla upewnienia się o dokładności wyników Pomiary próbek o nieznanym stężeniu Po wykonaniu kalibracji spektrofotometru do kuwety dodajemy rozcieńczony roztwór DNA, zatykamy kuwetę i energicznie mieszamy, a następnie mierzymy absorbancję próbki. W celu zmniejszenia błędu pomiaru wynikającego z pipetowania, pomiar powinien być powtórzony przynajmniej raz, a do pipetowania powinno być pobrane przynajmniej 5 ul próbki DNA. Wynik dla A260 mniejszy od 0.02 lub pomiędzy 1 i 1.5 (zależnie od użytego spektrofotometru) nie powinny być brane pod uwagę za względu na duży margines błędu. Stężenie c kwasu nukleinowego [ng/µL] w próbce jest mierzone zgodnie z poniższymi wzorami: ssDNA c(pmol/ul) = A260/0.027 dsDNA c(pmol/ul) = A260/0.020 RNA c(pmol/ul) = A260/0.025 Oligonukleotydy c(pmol/ul) = A260 100/1.5NA + 0.71NC + 1.2NG + 0.84NT gdzie A260 jest absorbancją mierzoną przy długości fali 260 nm f) metoda fluorymetryczna – pomiar intensywności fluorescencji barwnika Hoechst 33258 (bisbenzamid zinterkalowany z DNA), wzbudzanego UV 350 nm i emitującego 450 nm. - Hoechst 33258: - wiąże się w rejonach bogatych w AT dsDNA - wykazuje zwiększoną fluorescencję w warunkach silnie jonowych - czułość do 10 ng/mL zależność liniowa od 10ng/mL do 1ug/mL - DNA referencyjne z grasicy cielęcej zawiera 58%AT – standard dla roślin i zwierząt - wrażliwy na konformację plazmidowego DNA - połowa wydajności wiązania do ssDNA w porównaniu z dsDNA - nie wiąze się z RNA i białkiem - stężenie wyznaczane metodą dwupunktową - PicoGreen: - ultrawrażliwa metoda oznaczania ilościowego dsDNA w procedurach tworzenia bibliotek, diagnostyce, oznaczeniach wydłużania startera - czułość do 1 ng/ml - zakres od 1 ng/mL do 1000 ng/mL jeden pomiar, wzrost liniowy - niewrażliwy na zanieczyszczenia solami, mocznikiem, etanolem, chloroformem, detergentami, białkami i agarozą - minimalna wrażliwość na obecność RNA i ssDNA Materiały: agaroza, 10XTBE, bufor do ładowania, parafilm lub 3 zużyte płytki, markery wielkości DNA kuchenka mikrofalowa, kolba 250 mL, chwytak do gorących butelek, pojemnik na odpady EtBr folia nakrywkowa do kolby, tacka do wylewania żelu agarozowego, roztwór EtBr, 3 statywy na probówki 1,5 mL 3 zestawy pipet, końcówki do pipet 200mL. 3 pudełka na zużyte końcówki mieszadło magnetyczne, kuweta do chłodzenia żelu, aparat do rozdziału na agarozie ze stoperem, 200 ml 0,1 M NaOH, 200 ml 0,1 M HCl. statywy na stripy, stripy, pisaki, woda, lód, DNA, pipety, końcówki PRZYGOTOWYWANIE ŻELU AGAROZOWEGO Objętość żelu: Ilość agarozy na żel 0,8% Ilość agarozy na żel 1,5% Ilość agarozy na żel 3.0% Ilość buforu TBE 1X Ilość roztworu EtBr 2% 100 ml 0.8 g 1.5 g 3.0 g do 100 ml 1 L 150 ml 1.4 2.25 4.5 do 150 ml 1,5 L 200 ml 1.6 g 3.0 g 6.0 g do 200 ml 2 L 300 ml 2.4 g 4.5 g 9.0 g do 300 ml 3 L UWAGA: praca z EtBr; stosować środki ochrony indywidualnej. 1. odważyć w zlewce odpowiednią ilość agarozy (ile próbek będzie rozdzielanych?, ile mieści się na 1 grzebień?); 2. zalać buforem TBE 1X do odpowiedniej objętości; 3. rozmieszać agarozę na mieszadle magnetycznym do uzyskania jednorodnego roztworu bez bryłek agarozy, 4. przykryć zlewkę lub kolbkę folią plastykową odporną na działanie mikrofali 5. podgrzać w mikrofalówce do zagotowania, roztwór po zagotowaniu ma być klarowny (nie mogą pływać drobinki nierozpuszczonej agarozy) UWAGA: roztwór nie może wykipieć z naczynia, gotować i przenosić ostrożnie, po zagotowaniu używać do przenoszenia chwytaka; Nie wstrząsać gwałtownie grozi poparzeniem 6. schłodzić roztwór agarozy w zlewce z zimną wodą (destylowana, o temperaturze pokojowej) na mieszadle magnetycznym pod przykryciem. Prędkość mieszania należy tak dobrać, żeby do roztworu nie dostawało się powietrze a równocześnie nie następowała polimeryzacja przy ściankach będących w kontakcie z czynnikiem chłodzącym. W tym czasie przygotować stanowisko do wylania żelu. 7. po wystygnięciu roztworu do temperatury 60 C (należy wziąć w rękę – potrzymać kilkanaście sekund, żeby szkło się ogrzało - roztwór powinien być ciepły – nie gorący) dodać do niego POD WYCIĄGIEM bromku etydyny z zachowaniem szczególnych środków ostrożności. UWAGA: końcówkę po dodaniu EtBr należy wrzucić do specjalnego zamykanego pojemnika na odpady niebezpieczne. Po dodaniu bromku naczynie przykryć szczelnie folią i wymieszać na mieszadle magnetycznym. 8. wylać żel do przygotowanego korytka. Umyć na świeżo zlewkę i mieszadło. TRAWIENIE PREPARATU DNA RNA-zą Uwaga: Wielkocząsteczkowe DNA rozpuszczone w wodzie jest wrażliwe na mieszanie mechaniczne 1. 2. Zwirować krótko probówki po wyjęciu z lodówki Przygotować płytkę 96-dołkową w zespołach. Określić liczbę i kolejność próbek DNA. Dla każdej z wyizolowanych próbek należy zapipetować do dołka 5 µL wody i 2,5 µL buforu obciążającego do agarozy (LB agaroza). Do tak przygotowanych próbek zapipetować 2,5 µl DNA przed trawieniem (P1.1-15) 3. Dla wybranych losowo 5 próbek w zespole przygotować na płytce rozcieńczenie 20x do objętości całkowitej 50 µL (S1.1-5) 4. Do reszty preparatu DNA (po izolacji) dodać 10 µL roztworu RNAzy (0,1 µg/µl) na spód probówki (do roztworu) lub na ściankę (wtedy krótko zwirować) 5. Po rozpuszczeniu inkubować 30 minut w 37°C; przełożyć na lód; Spektrofotometryczne oznaczanie stężenia DNA: 1. 2. 3. Próbki z DNA po izolacji trzymamy na lodzie. Wyzerować spektrofotometr na próbce z wody. Określić absorbancję dla 4 fal dla próbkek S1.1-5. Zmierzyć A przy długościach fali 230, 260, 280 i 320 nm. Wpisać wartości do tabeli. Rozc. DNA 20X Abs S1.1 fala S1.2 S1.3 S1.4 S1.5 A230 A260 A280 A320 20x A260 A280 A320 40x A260 A280 A320 S2.15 S2.14 S2.13 S2.12 S2.11 S2.10 S2.9 S2.8 S2.7 S2.6 S2.5 S2.4 S2.3 S2.2 Dla wszystkich wyizolowanych próbek DNA po trawieniu RNA-zą w zespole przygotować na płytce rozcieńczenie 20x do objętości całkowitej 50 µL (S2.1-15) 5. Zmierzyć absorbancję dla A260, A280 i A320. Absorbancja Rozc. fala DNA S2.1 4. 6. Doprowadzić do końcowego rozcieńczenia 40x (dopipetować do kuwety 50 L wody). Zamieszać pipetą. Ponownie zmierzyć. 7. Obliczyć stężenie wyjściowego roztworu DNA i czystość na podstawie pomiarów z rozcieńczeń 20X i 40X: C [ng/µL]=A260x50xrozcieńczenie= czystość = A260/A280 8. Pomiędzy pomiarami kuwetę przemywaj 3-krotnie tryskawką z wodą usuwając pipetą pozostałości wody w korytku pomiarowym OZNACZANIE STĘŻENIA DNA NA ŻELU AGAROZOWYM 1. Na wolnej części płytki, dla każdej z wyizolowanych próbek po trawieniu RNA-zą należy zapipetować do dołka 5 µL wody i 2,5 µL buforu obciążającego do agarozy (LB agaroza). Do tak przygotowanych próbek zapipetować 2,5 µl DNA po trawieniu (P2.1-15) 2. Zaplanować ładowanie na żelu (opis z nazwami próbek i to czy były trawione czy nie). Nastawić pipetę na objętość 10 μL, załadować próbki do studzienek w żelu agarozowym (w płytce nie powinien zostawać roztwór) optymalnie w kolejności P1.1 i P2.1; P1.2 i P2.2 itd. 3. Rozdział elektroforetyczny prowadzić jednocześnie z wzorcem masy Mass Ruller (10μl) przy natężeniu 120V, przez ok. 0,5h. 4. Zrobić zdjęcie żelu. Porównać natężenie prążków badanego DNA z markerem masy. Na podstawie intensywności prążków określić stężenie wyjściowego roztworu DNA. Opisać zdjęcie w grupach nazwą próbki z zaznaczeniem trawionych i nietrawionych. Porównać wyniki pomiaru stężenia otrzymane za pomocą obu metod. PRZYGOTOWANIE ROZCIEŃCZENIA ROBOCZEGO DNA DO PCR 1. Obliczyć ilość stoku i wody potrzebnych do uzyskania 100μL roztworu roboczego o stężeniu 20 ng/μL (z próbki trawionej RNAzą). Numer próbki Nazwa próbki Stężenie DNA (1 uL) a Objętość St. końc końcowa ng/uL b c Ilość Ilość DNA w DNA objętości (uL) d e Ilość wody (uL) f a) stężenie DNA (1 uL) – przeliczone na 1 uL (odczyt z żelu) b) objętość końcowa (podana przez nas) c) stężenie końcowe ng/uL (robocze) d) ilość DNA w objętości (d)= (b) x (c) e) ilość DNA w rozcieńczeniu (e) [uL] = (d)/(a) f) ilość wody (uL) = (b)-(e) 2. Pokazać obliczenia do sprawdzenia 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Przygotować listę zbiorczą próbek do rozcieńczeń. Opisać probówki zgodnie z listą. ułożyć probówki DNA na statywie w kolumnach (po 8 w kolumnie) przygotować (opisać) odpowiednie stripy/probówki przygotować odpowiednie pudełko z tipsami rozpipetować wodę dodać obliczone ilości DNA roztwory robocze przechowywać w temp. 0 do +4 ºC. Ćwiczenie III 1. Metoda PCR 2. Przeliczanie stężeń (wdrażanie oznaczeń np. danych publikowanych). 3. Ocena polimorfizmu międzygatunkowego metodą RAPD lub/i ISSR. PCR PCR umożliwia uzyskanie milionów kopii danego odcinka DNA na matrycy tylko kilku cząsteczek, ponieważ produkt jednego cyklu PCR staje się substratem (matrycą) w kolejnym cyklu. Jeśli cykl jest w 100% efektywny to podwaja ilość amplifikowanej sekwencji. Wrażliwość metody wymaga, aby próbka nie była zanieczyszczona żadnym innym DNA lub produktami wcześniejszej amplifikacji prowadzonej w laboratorium. Znaczenie kontroli zanieczyszczeń PCR: - laboratoria medycyny sądowej - wykrywanie czynników zakaźnych Źródła zanieczyszczeń: - areozol produktu PCR powstały po analizie PCR; - zanieczyszczenia wniesione z matrycą DNA Zapobieganie zanieczyszczeniom w laboratorium PCR Rozdział przestrzenno-czasowy: rozdział pomieszczeń: - przygotowanie próbki, - nastawianie reakcji PCR - pomieszczenie do amplifikacji - pomieszczenie do analizy po PCR przy braku rozdziału na pomieszczenia PCR trzeba nastawiać pod komorą laminarną z UV sterylizacja ścian komory 10% wybielaczem, odpady z produktami PCR nie mogą być składowane w pomieszczeniach przed PCR rozdział czasowy: czynności pre PCR (izolacja DNA) rano, - niezależne źródła wody dejonizowanej, wirówki, zamrażarki, magazyny, telefony itp. w częściach przed- i po PCR Kontrola kontaminacji metody fizyczne: - końcówki pipet z filtrami - komora z laminarnym przepływem powietrza metody chemiczne: - UV (dimeryzacja pirymidyn przy UV 254 n, skuteczna dla cząsteczek powyżej 700 pz – następuje blokowanie polimerazy lub brak denaturacji nici; w fotoreakcji preferowana jest tymidyna do cytozyny 10:1; do dekontaminacji wody i buforu; niszczy polimerazę, startery i matrycę DNA; psoralen w stężenu poniżej 25 ug/ml wzmacnia działanie UV) - uracylo-DNA-glikozylaza (UDG) – dTTP na etapie przed PCR jest zastępowane dUTP i UDG jest dodawane do mieszaniny reakcyjnej. W czasie PCR polimeraza włącza dU zamiast dT w tworzonych produktach. W produktach po PCR jest dU zamiast dT i przy nastawianiu nowych reakcji matryca z dU jest niszczona przez UDG) Wykorzystanie oddzielnych pipet do poszczególnych etapów Unikanie zanieczyszczeń: 1. Przygotowanie DNA wyjściowego (matrycy), sporządzanie mieszaniny reakcyjnej oraz reakcja PCR powinny odbywać się w odrębnych pomieszczeniach lub wydzielonych do poszczególnych celów miejscach w obrębie laboratorium. 2. Wskazane jest przygotowywanie mieszaniny reakcyjnej w komorze laminarnej wyposażonej w lampę UV. 3. Każdy etap przygotowań do PCR powinien być wykonywany w różnych rękawiczkach. 4. Zaleca się używanie jałowych probówek, pipet i tipsów. Odpowiednie zestawy pipet powinny być przeznaczone tylko do jednego z etapów PCR. Szczególnie polecane są tipsy z filtrem. 5. Odczynniki do przygotowania mieszaniny reakcyjnej powinny być wykorzystywane jedynie do PCR. Zaleca się autoklawowanie wody (MQ). Odczynniki (dNTP, startery i polimeraza) należy rozpipetowywać na małe objętości, wystarczające do jednorazowego użytku i przechowywać zamrożone. Odczynniki nie powinny być przechowywane w tym samym miejscu, co próbki DNA. 6. Zawsze należy wykonać reakcję kontrolną (bez matrycowego DNA), aby upewnić się, że odczynniki nie są zanieczyszczone. Jest to kontrola negatywna, brak produktów PCR świadczy o czystości odczynników. W razie stwierdzenia zanieczyszczeń (prążków) należy wymienić wszystkie, bądź niektóre z odczynników (zastępować poszczególne składniki mieszaniny reakcyjnej nowymi odczynnikami). Przeciwieństwem jest kontrola pozytywna, gdzie próbka zawiera wszystkie odczynniki wraz z DNA, które na pewno zostanie zamplifikowane. Potwierdza się w ten sposób przydatność odczynników do PCR. W razie braku produktów amplifikacji należy wymienić odczynniki (wszystkie lub część), sprawdzić matrycowe DNA lub parametry ustawienia termocyklera. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej: Aby przygotować kilka (-naście, -dziesiąt) równoległych reakcji zaleca się sporządzenie tzw. Master Mixu, zawierającego: wodę, bufor, MgCl2, dNTPy, primer(-y) i polimerazę, (ewentualnie tylko te składniki, które są dodawane do każdej próbki w tych samych ilościach). Mix należy rozpipetować do probówek zawierających DNA. Taki sposób przygotowania reakcji minimalizuje błąd pipetowania oraz oszczędza czas. Matrycowe DNA Zazwyczaj ilość matrycowego DNA wynosi 10pg-1ng dla plazmidowego bądź fagowego DNA oraz 100ng-1μg dla genomowego DNA na 100μl mieszaniny reakcyjnej. Większa ilość DNA powoduje amplifikację niespecyficznych produktów PCR. Niemal każda rutynowa procedura izolacji DNA jest odpowiednia do uzyskania matrycy o właściwym dla PCR stopniu oczyszczenia i degradacji. Inhibitorami polimerazy Taq są m.in. fenol, EDTA, proteinaza K. Primery (Startery) 1. Startery do klasycznego PCR mają długość 18-25nt. 2. Zawartość GC powinna wynosić od 40 do 60%. GC powinny być równomiernie rozłożone na całej długość primera. Nie należy umieszczać więcej niż trzech GC na końcu 3’ z uwagi na możliwość niespecyficznego przyłączania się primera. 3. Primer nie może być komplementarny do samego siebie, ani innych primerów w mieszaninie reakcyjnej, aby uniknąć tworzenia struktury spinki do włosów w obrębie primera lub tworzenia się dimerów. 4. Temperatura topnienia primerów flankujących dany fragment nie powinna różnić się o więcej niż 5ºC, a więc należy odpowiednio dobrać skład nukleotydowy primerów, szczególnie zawartość CG. 5. Jeśli dysponujemy sekwencją matrycowego DNA należy rozpatrzyć wszystkie możliwe miejsca przyłączania starterów. Określanie temperatury topnienia oraz annealingu (przyłączania) primera: Jeśli primer jest krótszy niż 25 nt., jego przybliżoną temperaturę topnienia można określić na podstawie wzoru: Tm= 4(G+C) + 2(A+T), gdzie GCAT oznaczają liczbę poszczególnych nt. Temperatura przyłączania powinna być w przybliżeniu o ok. 5ºC niższa od temperatury topnienia. Jeśli primer jest dłuższy (powyżej 25 nt.), temperatura topnienia powinna być obliczana za pomocą specjalnych programów komputerowych, które uwzględniają więcej parametrów niż skład nukleotydowy primera. Stężenie MgCl2 Jony Mg2+ tworzą kompleksy z dNTP, primerami i matrycowym DNA. Stąd optymalne stężenie MgCl2 musi być dobrane eksperymentalnie dla każdej reakcji. Zbyt mała ilość jonów Mg obniży ilość produktów PCR, zbyt duża spowoduje wzrost produktów niespecyficznych. Rekomendowany zakres stężeń MgCl2 to 1-4mM dla standardowych warunków reakcji. Jeśli matrycowe DNA jest zanieczyszczone EDTA lub innymi związkami chelatującymi należy podwyższyć stężenie MgCl2. dNTP 1. Stężenie każdego dNTP w mieszaninie reakcyjnej wynosi zazwyczaj 200μM. Jest bardzo istotne, aby w mieszaninie reakcyjnej stężenie każdego dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) był jednakowe, ponieważ nadmiar lub niedobór chociaż jednego z nukleotydów powoduje mylne przyłączanie niewłaściwych nukleotydów w trakcie amplifikacji. 2. Aby uzyskać najbardziej wiarygodny wynik zaleca się stosowanie niższych stężeń dNTP w zakresie 10-50μM, przy jednocześnie obniżonym stężeniu jonów Mg2+ (ok. 1mM MgCl2, dobranym indywidualnie do każdej reakcji). Polimeraza Zazwyczaj używa się 2-3U polimerazy Taq na 100μl mieszaniny reakcyjnej. Wyższe stężenia polimerazy mogą powodować amplifikacje produktów niespecyficznych. Jednakże, jeśli w mieszaninie reakcyjnej znajdują się inhibitory polimerazy np. matrycowe DNA jest zanieczyszczone, wówczas wyższe ilości polimerazy (4-5U/100μl) mogą zwiększyć amplifikację. Termostabilne polimerazy oprócz aktywności polimeraz 5’3’ posiadać mogą również aktywność 3’5’ i/lub 5’3’ egzonukleazy. Jeśli polimeraza posiada aktywność 3’5’ egzonukleazy syntetyzuje bardziej wierne kopie matrycy z uwagi na rzadsze błędne wstawianie nukleotydów. Polimerazy bez aktywności 3’5’ egzonukleazy: Taq – Thermus aquaticus, akt. 5’3’ egzonukleazy i słaba odwrotnej transkryptazy Tbr – Thermus brockianus, akt. 5’3’ egzonukleazy i odwrotnej transkryptazy Tfl – Thermus flavus Tth – Thermus thermophilus, akt. 5’3’ egzonukleazy i odwrotnej transkryptazy Polimerazy z aktywnością 3’5’ egzonukleazy: Pfu – Pyrococcus furiosus Psp – Pyrococcus sp. GB-D Pwo – Pyrococcus woesei Tli – Thermococcus litoralis Tma – Thermotoga maritima ETAPY CYKLU PCR Etap wstępnej denaturacji i) Całkowita denaturacja DNA na początku reakcji PCR jest bardzo istotna. Niepełna denaturacja sprawia, że nie całe DNA może być wykorzystane jako matryca w pierwszym cyklu, a to z kolei powoduje zmniejszenie ilości amplifikowanych produktów. j) Etap wstępnej denaturacji powinien trwać 1-3min. w temp. 94-95ºC, ale jeśli matrycowe DNA jest szczególnie bogate w CG można wydłużyć czas denaturacji do 10min. k) Jeśli denaturacja trwa dłużej niż 3min., zaleca się dodanie polimerazy po zakończeniu tego etapu, z uwagi na możliwość destabilizacji enzymu. Etap denaturacji l) Zazwyczaj wystarcza 1-2min. denaturacji w temp. 94-95ºC, z uwagi na to, że produkty reakcji PCR są krótsze od matrycowego DNA i w krótszym czasie ulegają kompletnej denaturacji. m) Jeśli amplifikowane fragmenty są bogate w GC można wydłużyć czas denaturacji do 3-4min. lub zastosować odczynniki wspomagające denaturację: 10-15% glicerol, 10% DMSO, 5% formamid. Jednakże stosując te odczynniki należy eksperymentalnie dobrać temperaturę annealingu, ponieważ obniża się ona znacznie w porównaniu do standardowych warunków reakcji. Należy również zwiększyć ilość polimerazy, gdyż DMSO i formamid w podanych stężeniach obniżają aktywność polimerazy o 50%. Etap przyłączania (annealingu) startera n) Optymalna temperatura annealingu jest zazwyczaj o 5ºC niższa od temperatury topnienia dupleksu starter-matryca DNA, a czas trwania tego etapu to 1-2min. o) Jeśli uzyskiwane są produkty niespecyficzne należy o 1-2ºC podnieść temperaturę przyłączania. Etap wydłużania p) Przebiega w temp. 70-75ºC, ponieważ tempo syntezy przez polimerazę Taq jest największe i wynosi ok. 2-4kz/min. Wydłużanie trwające 1 min. wystarcza do uzyskania produktów o wielkości do 2kb. Jeśli amplifikowane są większe fragmenty, czas wydłużania należy zwiększyć o 1min. na każde 1000pz. Liczba cykli Liczba cykli zależy od ilości DNA matrycowego w mieszaninie reakcyjnej oraz od pożądanej ilości produktu. Dla niskich ilości DNA (ok. 10 kopii matrycowego DNA) zaleca się ok. 40 cykli, dla wyższych ilości 25-35 cykli. Końcowe wydłużanie Po ostatnim cyklu następuje etap końcowego wydłużania, trwający 5-15 min. w temp. 72ºC. Ma on na celu dobudowanie niedokończonych w trakcie poprzednich cykli fragmentów DNA. W trakcie tego etapu polimeraza Taq działa jako terminalna transferaza i dosyntetyzowuje dodatkowe nukleotydy A do końców 3’ produktów PCR. Jeśli produkty PCR są używane do klonowania ten etap może zostać wydłużony do 30 min. Optymalizacja warunków reakcji Specyficzność – eliminowanie niespecyficznych produktów podwyższyć temperaturę annealingu (przyłączania starterów), obniżyć stężenie jonów Mg2+ zmienić skład nukleotydowy primera obniżyć ilość cykli zmienić polimerazę Wierność – redukcja błędów syntezy obniżyć liczbę cykli podwyższyć stężenie matrycy obniżyć stężenie dNTP zmienić polimerazę Ilość produktu – zwiększenie ilości amplifikowanych fragmentów zwiększyć liczbę cykli podwyższyć stężenie matrycy zmienić polimerazę obniżyć temperaturę annilingu wydłużyć czas syntezy Długość produktu – amplifikacja długich fragmentów wydłużyć czas syntezy dobrać odpowiednie stężenie jonów Mg2+ zmienić polimerazę skrócić czas denaturacji podwyższyć stężenie matrycy zmienić pH buforu do PCR Rozwiązywanie problemów związanych z PCR Symptom Przyczyna brak lub słaba amplifikacja niekompletna denaturacja matrycy brak docelowej sekwencji na matrycy nieodpowiedni profil termiczny reakcji nieodpowiednie probówki do PCR nieodpowiednia sekwencja primera(-ów) degradacja primerów przez polimerazę niedostateczne stężenie jonów Mg2+ zanieczyszczenie odczynników nukleazami obecność inhibitorów np. w matrycowym DNA brak amplifikacji niektórych próbek niedokładnie wymieszana miesz. reakcyjna zanieczyszczenie próbek talkiem z rękawiczek wada termocyklera smuga produktów widoczna po elektroforezie zbyt długi czas wydłużania nadmiar matrycy nadmiar primera niespecyficzne produkty niespecyficzne przyłączanie primera do matrycy nadmiar polimerazy nadmiar Mg2+ produkty PCR w kontroli negatywnej zanieczyszczenie odczynników i/lub sprzętu Nastawienie reakcji RAPD lub/i ISSR na wyizolowanych próbkach DNA z jęczmienia. PROTOKÓŁ OGÓLNY WYKONYWANIA PCR Miejsce wykonania PCR: pomieszczenie do PCR, komora do pracy sterylnej Stanowisko pracy należy zdezynfekować przed rozpoczęciem protokołu i po jego zakończeniu skażonym etanolem Nastawianie reakcji PCR ma na celu powielenie fragmentu/ów DNA, przygotowuje się odpowiednią mieszaninę składników zgodnie z protokołem szczegółowym i probówki wstawia się na urządzenie (tremocykler), które zmienia cyklicznie temperatury pozwalając na wielokrotne wzmocnienie sygnału z DNA. W efekcie uzyskuje się probówki z mieszaniną fragmentów DNA w ilości pozwalającej na detekcję tych fragmentów po rozdziale na żelach. Przy pipetowaniu obowiązuje kontrola następujących szczegółów: - kontrola ustawionej objętości i rodzaju roztworu; - czy tips jest szczelnie dociśnięty? - czy pobrano odpowiednią ilość płynu? (gęstość płynu trzeba uwzględnić) - gdzie należy zapipetować?, otwór probówki należy trzymać skierowany od siebie - po zapipetowaniu należy sprawdzić czy w końcówce nie ma roztworu? - czy trzeba zmienić końcówkę i gdzie należy ją zrzucić? 1. Przygotować szczegółowy skład PCR i zaplanować jego wykonanie; 2. Przygotować potrzebne próbki DNA i odczynniki umieścić je na lodzie; 3. Rozpipetować DNA do probówek na dno, nie dotykając ścianek NA LODZIE!! (sprawdzić czy DNA jest na właściwym miejscu) 4. Przygotować mix PCR w przygotowanych wcześniej, jałowych probówkach (opisać probówki nazwą próbki i nazwą oznaczenia); 5. Dodać poszczególne odczynniki - wodę, bufor PCR 10x, MgCl2, nukleotydy i startery (WYCISKAĆ DO DRUGIEGO OPORU) 6. Po dodać polimerazę zawsze nowym tipsem (wyjąć z zamrażarki dodać i odłożyć z powrotem do zamrażarki) mieszać przez pipetowanie 6-10 x pipetą nastawioną na około 1/3 objętości miksu; 7. Rozporcjować mix PCR do probówek z DNA; można pipetować (DO PIERWSZEGO OPORU) jedną końcówką pod warunkiem, że nie ma ona kontaktu z DNA – pipetujemy na ściankę (1-2 mm poniżej krawędzi otworu probówki; 8. Zamknąć probówki i umieścić je w termocyklerze (BEZ BĄBELKÓW W PROBÓWKACH – SPRAWDZAJĄC OBJĘTOŚĆ), zwracając uwagę na to czy probówki są ułożone w tym samym kierunku, czy żadna nie wystaje i czy są szczelnie domknięte; 9. Wybrać odpowiedni program i włączyć ENTER, POCZEKAĆ DO MOMENTU ROZPOCZĘCIA CYKLU; 10. Po zakończeniu cyklu amplifikacji wyjąć probówki na statyw, opisać go i umieścić reakcję w lodówce. Protokół szczegółowy RAPD RAPD składnik St0 StK Fermentas bufor (X) 10 1 starter (uM) 10 0,5 MgCl2 (mM) 25 2,5 dNTP (uM) 2000 200 spermidyna (mM) 10 0,6 Fermentas Taq (U) 1 0,8 DNA (ng/uL) 20 30 Woda MQ 1 Starter: B89: ggg ggC TTg g Ilość objętość Dil. składnika na 1 próbkę reakcji (L) rate 20 0,1 2 20 0,025 1 20 0,1 2 20 0,1 2 20 0,06 1,2 20 0,8 20 1,5 20 9,5 Starter: B102: ggT ggg gAC T Cykl: RAPD54: 94 2', 45x(92 40”, 38 1'10”, 72 2') 72 5' ISSR Ilość objętość Dil. składnika na ISSR składnik St0 StK reakcji (L) rate 1 próbkę Fermentas bufor (X) 10 1 20 0,1 2 starter (uM) 10 0,25 20 0,025 0,8 MgCl2 (mM) 25 2,5 20 0,1 2 dNTP (uM) 2000 200 20 0,1 2 spermidyna (mM) 10 0,6 20 0,06 1,5 Fermentas Taq 1 0,5 20 0,5 DNA 20 50 20 1,5 Woda MQ 1 20 9,7 JOHN: AGA GAG AGA GAG AGY C (AG)7-YC-3’ 899: CAC ACA CAC ACA RG (CA)6-RG Chris: CAC ACA CAC ACA CAY G (CA)7-YG Manny: CAC CAC CAC CAC RC (CAC)4-RC 902: GTG TGT GTG TGT AY (GT)6-AY Terry: GTG GTG GTG GTG RC (GTG)4-RC Cykl: ISSR444: 95 4', 45x(94 45”, 45 45" ; 72 45") 5' 72 CAPS objętość Ilość reakcji składnika na Dil. rate 1 próbkę (L) 25 0,1 2,5 25 0,025 0,625 25 0,025 0,625 25 0,1 2,5 25 0,1 2,5 25 0,06 1,5 25 0,5 25 2,5 25 11,75 STS składnik St0 StK Fermentas bufor (X) 10 1 starter_L (uM) 10 0,25 starter_R (uM) 10 0,25 MgCl2 (mM) 25 2,5 dNTP (uM) 2000 200 spermidyna (mM) 10 0,6 Fermentas Taq 1 0,5 DNA 20 50 Woda MQ 1 Startery: Mwg2230_L: AATgATgTTgCTTTCCTgTTTgCTC Mwg2230_R: ACAgATgATgATggCgTgCAgCTTT Cykl: SSR50B Planowanie reakcji PCR W laboratorium wykorzystywane początkowych: Składnik (St0) Bufor do PCR 10x MgCl2 25 mM dNTP 2 mM są składniki Składnik Starter Polimeraza Matryca DNA Spermidyna PCR o następujących (St0) 10 M 1U/L 20 ng/L 10 mM stężeniach Obliczyć ile należy dodać poszczególnych składników do 1 reakcji PCR żeby powtórzyć procedury opisane w poniższych zadaniach. Obliczyć ile składników należy zmieszać, żeby przygotować Mix dla 10 próbek, zakładając, że Mixu należy przygotować o 5% więcej niż wynika z liczby próbek (na nieprecyzyjne pipetowanie). Na podstawie treści zadań trzeba określić stężenie końcowe (StK) poszczególnych składników. Dla składników (za wyjątkiem matrycy DNA i polimerazy) należy obliczyć wskaźnik rozcieńczenia (diluton rate Dr) Dr=StK/St0. Ilość składnika w jednej reakcji o objętości (Vol) powinna wynosić Dr*Vol. Pozostałą objętość reakcji (po zsumowaniu wszystkich składników) uzupełniamy wodą. Zadanie 1 Reakcję PCR wykonano w objętości 25 ul zawierającej 15–20 ng matrycy DNA, 5 pmol każdego startera, 5 nmol każdego dNTPs, 37.5 nmol MgCl2, 0.13 U Taq polimerazy DNA (Promega, Madison, Wis. 5U/uL) 1x bufor do PCR. objętość stosunek Ilość składnika składnik St0 StK reakcji (L) rozcieńczenia na 1 próbkę bufor (X) 10 1 25 0,1 2 starter_L (uM) 10 0,4 0,025 1 starter_R (uM) 10 0,4 0,025 1 MgCl2 (mM) 25 0 0,1 2 dNTP (uM) 2000 200 0,1 2 spermidyna (mM) 10 0,6 0,06 1,2 Taq 1 1 0,8 DNA 20 30 1,5 Woda MQ 1 9,5 Zadanie 2 Roztwór PCR (25 ul) zawierał 0.5–1 U rTaq DNA polymerazy (TaKaRa, Shiga, Japan), 1 x bufor do PCR (50 mM KCl, 10 mM Tris–HCl pH 8.3, 1.5 mM MgCl2 i 0.001% żelatyny), 200 uM dNTPów, 400 nM starterów i 50 ng matrycy DNA. składnik St0 bufor (X) starter_L (uM) starter_R (uM) MgCl2 (mM) dNTP (uM) spermidyna (mM) Taq DNA Woda MQ StK objętość stosunek Ilość składnika reakcji (L) rozcieńczenia na 1 próbkę Zadanie 3 Mix do PCR zawierał 0.25 µM startera, 1.5 mM MgCl2, 200 µM każdego gNTP, 1x Taq bufor, 0.5 U polimerazy Taq i 50 ng matrycy DNA, w objętości 10 µl.
