Analiza genetyczna w niepowodzeniach ciąży i badaniach

Analiza genetyczna w niepowodzeniach ciąży i badaniach prenatalnych Dr n. med. Joanna Walczak-­‐Sztulpa Katedra i Zakład Genetyki Medycznej Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Diagnostyka niepowodzeń ciąży Badania cytogenetyczne i molekularne: §  Badanie kariotypu rodziców po dwóch poronieniach, po jedynym porodzie martwym §  Ocena kariotypu poronionego zarodka/płodu §  Skrining genów Diagnostyka prenatalna chorób genetycznych §  Aberracje chromosomowe • 
• 
• 
• 
• 
Metody klasycznej cytogenetyki FISH QF-­‐PCR MLPA aCGH §  Choroby uwarunkowane jednogenowo •  Metody biologii molekularnej Analiza kariotypu metodą klasyczną §  Hodowla amniocytów (komórek płynu owodniowego), trofoblastu lub limfocytów – pośrednia lub bezpośrednia §  Możliwość oceny wszystkich chromosomów §  Kontaminacja komórkami matczynymi – wzrastanie komórek matczynych (kariotypy żeńskie prawidłowe) §  Długi czas oczekiwania na wynik 2-­‐3 tygodnie Kariotyp komórek płynu owodniowego FISH – fluorescencyjna hybrydyzacja in situ §  Hybrydyzacja DNA chromosomów lub jąder interfazowych z sondą molekularną wyznakowaną fluorescencyjnie §  Diagnostyka wybranych aberracji chromosomowych §  Wynik uzyskany wciągu 1-­‐2 dni Zastosowanie wielokolorowych sond molekularnych do określenia liczby kopii chromosomów •  chromosom X •  chromosom Y •  chromosom 18 •  chromosom 13 •  chromosom 21 a – płytka metafazowa i jądro interfazowe limfocytów b -­‐ jądro niehodowanej komórki płynu owodniowego – płód żeński c -­‐ jądro niehodowanej komórki płynu owodniowego – płód męski d -­‐ jądro niehodowanej komórki płynu owodniowego-­‐ płód męski z trisomią chromosomu 21 Wyniki FISH przeprowadzone bezpośrednio na niehodowanych komórkach płynu owodniowego komercyjna sonda 22q11.2; wykrycie mikrodelecji charakterystycznej dla zespołu podniebno-­‐sercowo-­‐twarzowego; kontrolna sonda specyficzna dla 22q QF-­‐PCR -­‐ Quanftafve fluorescence polymerase chain reacfon §  Amplifikacja specyficznych regionów mikrosatelitarnych (wysoce polimorficznych krótkich powtórzeń tandemowych typu STR) z zastosowaniem fluorescencyjnych starterów w reakcji PCR §  Ilościowa ocena produktów po amplifikacji §  Szybka diagnostyka najczęstszych aneuploidii, np. 13, 18, 21 Wynik Wykrycie trisomii 13 metodą QF-­‐PCR Wykrycie trisomii 18 metodą QF-­‐PCR Wykrycie trisomii 21 metodą QF-­‐PCR Wynik QF-­‐PCR MLPA -­‐ Mulfplex Ligafon -­‐ dependent Probe Amplificafon §  Połączenie metody hybrydyzacji i PCR §  Umożliwia ilościową ocenę 40 różnych sekwencji w jednym badaniu §  Ilościowa ocena produktów po amplifikacji §  Szybka diagnostyka najczęstszych aneuploidii, np. 13,18, 21 MLPA -­‐ Mulfplex Ligafon -­‐ dependent Probe Amplificafon Określenie liczby kopii chromosomu X Badania genetyczne materiału z poronienia mogą wskazać nosicielstwo mikrorearanżacji materiału genetycznego u któregoś z partnerów Jedyną metodą diagnostyczną jest ArrayCGX materiału z poronienia!
Mikromacierze kliniczne ArrayCGX Mikromacierz DNA (ang. DNA microarray) Szklana lub plasfkowa płytka wielkości szkiełka mikroskopowego z naniesionymi w regularnych pozycjach polami (ang.spots) mikroskopijnej wielkości. Pola te zawierają różniące się od siebie sekwencją jednoniciowe cząsteczki DNA, które są sondami molekularnymi mającymi zdolność specyficznego wiązania komplementarnych sekwencji DNA badanego. Technologia mikromacierzy arrayCGH I.  Stanowi przełom w diagnostyce genetycznej II.  Umożliwia w jednym badaniu wykrycie wszystkich niezrównoważonych aberracji chromosomowych oraz submikroskopowych mikrodelecji i mikroduplikacji III.  Nie wymaga hodowli komórek IV.  Krótki czas oczekiwania na wynik aCGH – genomowa hybrydyzacja porównawcza do mikromacierzy §  Hybrydyzacja wyznakowanego fluorescencyjnie DNA pacjenta do płytki mikromacierzy z naniesionymi sekwencjami DNA w postaci klonów BAC lub fragmentów oligonukleotydowych §  Rozdzielczość – od 1Mpz do <100 kpz (?) §  Nie identyfikuje zmian zrównoważonych oraz poliploidii §  Czasami trudna interpretacja uzyskanych wyników Array-­‐CGH Array-­‐CGH Test DNA
e.g. Cancer
Cot-1 DNA
Reference DNA
Array-­‐CGH Sample
Reference
Sample
Reference
Sample
Reference
Analiza wyników -­‐ Array-­‐CGH Wynik Array-­‐CGH Przykład 1 Ciąża III, poronienie II, 10 Hbd, zdrowych, niespokrewnionych rodziców – kariotypy obojga prawidłowe. W materiale z ciąży III stwierdzono interstycjalną duplikację w chromosomie 7 pary (region 7q11.23; rozmiar duplikacji 4.22 Mb). Zmiana znajduje się w regionie krytycznym dla zespołu mikroduplikacyjnego 7q11.23. Przykład 2 Ciąża III, poronienie II, 17 Hbd. Rodzice niespokrewnieni, kariotypy obojga prawidłowe. Wynik badania techniką mikromacierzy kosmówki z ciąży III: Terminalna delecja w chromosomie 4 (region 4p16.3-­‐ 4p14; rozmiar 33,44 Mb). Zmiana obejmuje region krytyczny dla zespołu Wolf-­‐Hirschhorn. Dziękuję za uwagę!