Zbigniew Rybka, Zakład Biochemii i Fizjologii Roślin IHAR

Zbigniew Rybka, Zakład Biochemii i Fizjologii Roślin IHAR-PIB Radzików.
Metodyka wykrywania żytniego DNA w roślinach pszenicy z substytucjami chromosomów żytnich.
(Opracowanie wykonane w ramach PW, Zadanie 3, temat 2.1)
Linie substytucyjne pszenicy z podstawionymi chromosomami żytnimi lub ich fragmentami są
atrakcyjnym materiałem wyjściowym do krzyżówek z wartościowymi rolniczymi odmianami pszenicy w celu
wzbogacenia genomu o wartościowe cechy żyta (m.in. wyższa niż w pszenicy mrozoodporność, odporność na
patogeny, inny skład chemiczny ziarniaków czy lepsze wykorzystanie nawożenia mineralnego). Linie
substytucyjne są wytwarzane przeważnie z wykorzystaniem odmian niekoniecznie atrakcyjnych pod
względem przydatności rolniczej, za to podatnych na łatwe przyjmowanie i utrzymywanie obcych
chromosomów. Chromosomy żytnie z linii substytucyjnych można przenieść drogą krzyżowania do
wartościowych odmian produkcyjnych pszenicy. Metodyka zaprezentowana poniżej umożliwia łatwą
identyfikację krzyżówek zawierających wprowadzone chromosomy żytnie.
Metoda oparta jest na zastosowaniu łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) ze starterami
powielającymi wyłącznie fragmenty DNA pochodzenia żytniego. W opisanej wersji metody użyto starterów
powielających fragmenty rozproszone po całym genomie żytnim. Ponieważ wiadomo, jakiej linii
substytucyjnej użyto do krzyżówki, nie ma potrzeby użycia markerów specyficznych dla poszczególnych
chromosomów.
Odmiana, do której przenosimy chromosomy żytnie może zawierać śladowe ilości żytniego DNA
wprowadzonego wcześniej podczas procesów hodowlanych lub naturalnego przekrzyżowania w procesach
ewolucyjnych zbóż. Konieczne jest zatem podczas wykonywania reakcji wykrywającej żytnie DNA stosowanie
jako materiału odniesienia DNA izolowanego z tej właśnie odmiany (kontrola negatywna). Materiałem
odniesienia zawierającym chromosom żytni (kontrola pozytywna) jest linia substytucyjna użyta do
krzyżowania.
W najprostszej wersji metody otrzymujemy informację zero-jedynkową: krzyżówka zawiera/nie
zawiera żytniego DNA. Metodę można zmodyfikować stosując tzw. półilościowy PCR, pozwalający ocenić, czy
krzyżówka zawiera np. cały chromosom, czy tylko jego fragment.
Materiał i metody.
Materiałem badawczym mogą być np. linie substytucyjne pszenicy zawierające chromosomy żytnie
oraz krzyżówki tych linii z komercyjnymi odmianami pszenicy. Ziarniaki można wysiać na dowolnym,
wilgotnym podłożu (bibuła, piasek, gleba, siewnik hydroponiczny). Nie ma potrzeby stosowania nawożenia.
Do izolacji DNA pobiera się najczęściej pierwszy liść kilkudniowej siewki lub jego fragment.
Do przeprowadzenia reakcji niezbędne są: termocykler i odpowiednie probówki reakcyjne, zestaw
do izolacji DNA (gotowy komercyjny zestaw lub odczynniki sporządzone samodzielnie), zestaw odczynników
do PCR oraz odpowiednie startery, zestaw do elektroforezy agarozowej (aparatura i bufory), zestaw do
dokumentacji fotograficznej żeli agarozowych (transiluminator, aparat fotograficzny).
Całkowity DNA izoluje się dowolną, powtarzalną metodą (zestawy komercyjne lub odczynniki
przygotowywane samodzielnie). Zawartość DNA w próbach określa się spektrofotometrycznie po usunięciu
RNA za pomocą RNazy wolnej od DNaz.
Wyizolowany DNA jest użyty do powielenia żytnich fragmentów z wykorzystaniem PCR.
Skład typowej mieszaniny reakcyjnej (odczynniki Thermo Scientific):
DNA o stężeniu 0.1-10 ng/l - 1 l
starter „Katto 3F” o stężeniu 0.1-1.0 M – 1l
starter „Kattto 3R” o stężeniu 0.1-1.0 M – 1l
Dream Taq Green PCR MasterMix 2x – 25 l
Woda autoklawowana – do obj. 50 l
Sekwencja nukleotydowa startera „Katto 3F”: 5’-GATCG CCTCT TTTGC CAAGA-3’
Sekwencja nukleotydowa startera „Katto 3R”: 5’-TCACT GATCA CAAGA GCTTG-3’
Przykładowy schemat przebiegu reakcji (dla termocyklera Biometra i odczynników firmy Thermo
Scientific):
- 95oC, 5 min - wstępna denaturacja,
- 20-30 cykli: denaturacja DNA 95oC, 30s; przyłączanie startera 56oC, 30s; wydłużanie łańcucha DNA
72oC, 2 min.
- końcowe wyrównywanie długości łańcuchów DNA – 72oC, 5 min.
Po zakończeniu PCR mieszaninę reakcyjną można bezpośrednio nakładać na żel agarozowy (0.7-1.0%
agarozy). Do sporządzania żelu jak i do napełniania komory do elektroforezy można użyć buforu
zawierającego bromek etydyny, wtedy można niezwłocznie w świetle UV obserwować produkt w postaci
prążka o wielkości ok. 1000 par zasad. Należy stosować rękawiczki ochronne ze względu na mutagenność
bromku etydyny!
Warunki PCR należy dobrać doświadczalnie w zależności od użytych odczynników do PCR, objętości i
składu mieszaniny reakcyjnej, rodzaju termocyklera i zastosowanych probówek. Warto przetestować
również temperatury i czasy poszczególnych etapów PCR w celu uzyskania pojedynczego prążka, zwłaszcza w
przypadku stosowania półilościowego PCR.
Literatura:
Katto M.C., T.R. Endo, S. Nasuda. 2004. A PCR-based marker for targeting small rye segments in wheat
background. Genes Genet. Syst., 79, 245-250.