Real Time PCR — podstawy i historia metody

advertisement
Real Time PCR — podstawy i
historia metody
Każdy biolog molekularny musi znać tę technologię (przynajmniej w
teorii). Tradycyjny PCR zrewolucjonizował badanie jakościowe DNA, a PCR
w czasie rzeczywistym stał się podstawą ilościowania kwasów
nukleinowych.
Słowo wstępne
Metoda ma wiele nazw i akronimów: ilościowy PCR, PCR w czasie rzeczywistym,
Real-Time PCR, Real-Time Quantitative PCR, qPCR, RQ-PCR, RTQ-PCR i inne (nie
powinno się go jednak nazywać RT-PCR, gdyż skrót ten zarezerwowany jest dla
reakcji odwrotnej transkrypcji!). Wszystkie te nazwy to synonimy, określające
zmodyfikowaną łańcuchową reakcję polimerazy, która pozwala na monitoring
przyrostu ilości produktu w czasie jej trwania. Osiągnięto to poprzez dodatek
związków fluorescencyjnych do mieszaniny reakcyjnej. Emisja fluorescencji
związana jest z kinetyką przyrostu liczby cząsteczek DNA (o rodzajach znaczników
fluorescencyjnych piszemy w drugiej części niniejszego cyklu).
Trochę historii
Początki metody były skromne: Russell Higuchi i jego współpracownicy w roku
1992 opublikowali pracę, w której opisali system swojego pomysłu służący do
detekcji przyrostu ilości DNA w czasie amplifikacji. Wykorzystali bromek etydyny
i odczytywali luminescencję po wzbudzeniu przez światło UV. Bromek etydyny
interkalował pomiędzy nici DNA, więc na etapie elongacji lub bezpośrednio po
niej można było odczytać względny poziom ilości zamplifikowanego DNA. Reakcja
nie cechowała się duża wydajnością i precyzją, gdyż bromek istotnie zakłócał
działanie polimerazy, stanowiąc dla niej zawadę steryczną, zaś światło UV
niszczyło stopniowo strukturę enzymu. Pomysł jednak doczekał się szybko
ulepszeń i został skomercjalizowany. Pojawiły się rekombinowane polimerazy o
większej stabilności termicznej (HotStart), barwniki nie zmieniające kinetyki
reakcji, a niedługo później także sondy molekularne, które umożliwiały precyzję
pomiaru niespotykaną nigdy wcześniej. W drodze za odczynnikami ewoluowały
także systemy amplifikacji i detekcji sygnału- początkowo korzystały z tylko
jednego kanału emisji i detekcji, wkrótce jednak już z kilku, pozwalając prawie
dowolnie łączyć barwniki w reakcjach typu multiplex.
Jak to działa?
Do przygotowania najprostszej reakcji qPCR potrzebujemy tych samych
składników, co do konwencjonalnego PCR-u, a zatem pary starterów, buforu,
MgCl2, dNTP, wody i polimerazy. Dodatkowym składnikiem mieszaniny będzie
bądź znakowana fluorescencyjnie sonda specyficzna dla amplifikowanej
sekwencji, bądź niespecyficzny barwnik interkalujący pomiędzy zasady w
DNA. Gotową reakcję wstawiamy do odpowiedniego termocyklera i przyglądamy
się, co będzie się działo na ekranie podczas zachodzenia reakcji.
W teorii z każdym cyklem przybywa nam zamplifikowanego DNA w sposób
wykładniczy, a więc 2^n (gdzie n to liczba cykli). W przyrodzie jednak taki idealny
układ nie istnieje- kinetyka naszej reakcji enzymatycznej przebiega zgodnie z
założeniami Michaelisa-Menten,a więc istnieje pewne plateau, związane z
wyczerpywaniem składników reakcji, zaś na początku jej trwania amplikony są w
zbyt małym stężeniu, by być namnażane z maksymalną wydajnością. Tak więc
tylko pewien etap reakcji zachodzi liniowo i tylko na podstawie tego etapu
będzięmy mogli obliczyć ilość matrycy. Liczba cykli, która umożliwia osiągnięcie
maksymalnej wydajności reakcji nazywana jest Ct (threshold cycle), cyklem
granicznym, który zależy od początkowej liczby cząsteczek matrycy i od kinetyki
danej reakcji. Tą wartością i innymi parametrami kinetycznymi reakcji zajmiemy
się w IV części cyklu.
Po zakończeniu reakcji możemy w niektórych przypadkach (barwniki
niespecyficzne i sondy niehydrolizujace) wykonać analizę krzywej topnienia, która
informuje nas o specyficzności reakcji czy też o obecności różnych alleli danego
amplikonu w mieszaninie reakcyjnej, co zostało wykorzystane w metodzie HRM do
poszukiwania mutacji i polimorfizmów.
Zastosowania metody
Obecnie ilościowy PCR znalazł zastosowanie w niemal każdej gałęzi branży
biotechnologicznej. Pozwala m.in. na detekcję GMO i ocenę jego ilości w
żywności. W diagnostyce laboratoryjnej używa się go do stwierdzania obecności
patogenów u chorego i do monitoringu poziomu wiremii/bakteriemii. W onkologii i
hematologii qPCR daje możliwość oceny odpowiedzi na leczenie celowane. W
przemyśle metodami ilościowymi monitoruje się właściwości szczepów, a w
badaniach podstawowych używa się ich chyba w każdym możliwym
eksperymencie z udziałem DNA i RNA: monitoruje się hodowle komórkowe,
poszukuje mutacji (moduł HRM), zmian w profilu metylacji, potwierdza wyniki
mikromacierzowe i wiele innych. O części z zastosowań w diagnostyce
laboratoryjnej będzie mowa w części V naszego cyklu.
Piśmiennictwo:
Doświadczenia własne.
Data publikacji: 04.02.2016r.
Download
Random flashcards
ALICJA

4 Cards oauth2_google_3d22cb2e-d639-45de-a1f9-1584cfd7eea2

Motywacja w zzl

3 Cards ypy

Pomiary elektr

2 Cards m.duchnowski

2+2=?

2 Cards jogaf85537

Create flashcards