BIAŁKA Aminokwasy są podstawowymi jednostkami strukturalnymi białek. Białka są zbudowane wyłącznie z Laminokwasów. Aminokwas jest zbudowany z grup : - karboksylowej, - aminowej, - atomu wodoru, - grupy bocznej R, która to wiąże się kowalencyjnie z atomem węgla alfa. W białkach wiązanie peptydowe łączy grupę karboksylową jednego aminokwasu z grupą aminową drugiego aminokwasu. Łańcuch polipeptydowy jest złożony z powtarzających się regularnie fragmentów, tworzących łańcuch główny i fragmentów zmiennych – charakterystycznych łańcuchów bocznych różnych aminokwasów. Łańcuch ma koniec N - z grugą aminową i koniec C – z grupą karboksylową. WŁAŚCIWOŚCI BIAŁEK: Białka ulegają denaturacji, która czyni białko nieaktywnym biologicznie. Jest to spowodowane nieodwracalną utratą trzeciorzędowej lub czwartorzędowej budowy białka. Białka są na ogół rozpuszczalne w wodzie. Do białek nierozpuszczalnych należą tzw. białka fibrylarne, występujące w skórze, ścięgnach, włosach lub mięśniach. Białka posiadają zdolność wiązania cząsteczek wody tzw. hydratacja. Białka, ze względu na obecność zasadowych grup NH2 oraz kwasowych COOH mają charakter obojnaczy. Dzięki temu pełnią rolę bufora stabilizującego pH, np. krwi. Wartość pH, w której ładunki dodatnie i ujemne aminokwasów równoważą się nazywany jest punktem izoelektrycznym białka. Poziomy organizacji łańcucha polipeptydowego: Struktura pierwszorzędowa - kolejność aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym. Struktura drugorzędowa - przestrzenne ułożenie fragmentów łańcuchów. Są to: helisa alfa - harmonijka beta - beta zakręt Występują tu wiązania wodorowe. Struktura trzeciorzędowa - wzajemne położenie elementów struktury drugorzędowej w przestrzeni. Stabilizowana jest przez: - mostki disiarczkowe -oddziaływanie jonowe - oddziaływanie hydrofobowe - siły van der Waalsa Struktura czwartorzędowa - wzajemne położenie łańcuchów polipeptydowych oraz ewentualnie struktur niebiałkowych. BIAŁKA OSOCZA każde białko ma specyficzną budowę, funkcję i określone stężenie fizjologiczne. Oprócz białek występujących stale w krążeniu, okresowo mogą pojawiać się białka będące wynikiem procesu chorobowego np. białka wydzielane przez komórki (np. monoklonalne i białka będące produktem rozpadu komórek i tkanek ➢ wszystkie białka osocza to białka złożone- glikoproteiny (wyjątkiem są albuminy, które są białkami prostymi) ➢ ze względu na rozpuszczalność i kształt, białka dzielą się na globularne i fibrylarne Białka osocza nie gromadzą się w wątrobie, prawie cała pula białek znajduje się w przestrzeni międzykomórkowej, tylko 40% jest w naczyniach, pozostałe 60% w przestrzeni pozanaczyniowej. Jednakże w związku z dużą objętością tej przestrzeni stężenie białek jest w niej 3-4 razy niższe niż w osoczu. Prawidłowy poziom białka całkowitego zależy od równowagi między syntezą a degradacją dwóch głównych frakcji białkowych: albuminy (35-50 g/l) i immunoglobulin (12-18 g/l). Obrót metaboliczny poszczególnych białek jest bardzo zróżnicowany (albumina – ok. 20 dni, immunoglobuliny - 24 dni, niektóre białka układu krzepnięcia - kilka godzin). Białka osocza katabolizowane są w skórze, wątrobie lub komórkach śródbłonka naczyń. Całkowite wydalanie białka z moczem wynosi 20-80 mg/dobę (błona podstawna kłębków nie przepuszcza cząstek o masie cząsteczkowej większej od 40 kDa). BIAŁKA OSTREJ FAZY Grupa białek syntetyzowanych w wątrobie, których poziom wzrasta w przebiegu stanów zapalnych, chorób zakaźnych, urazów, nowotworów i procesów martwiczych (np. zawał mięśnia sercowego). Czynnikami aktywującymi syntezę tych białek są produkty rozpadu uszkodzonych tkanek oraz cytokiny które są wytwarzane przez limfocyty pobudzane przez proces zapalny. Przywrócenie zaburzonej homeostazy ustroju dzięki różnorodnym funkcjom: hamowanie proteinaz, regulacja procesów krzepnięcia, wiązanie i neutralizacja patogenów czy transport metabolitów. Wzrost stężenia tych białek zaznacza się w elektroforezie białek surowicy zwiększeniem frakcji alfa1i alfa2-globulin. Metody oznaczania białka całkowitego METODA Biuretowa Lowry-Rosenbau Folin Ciocalteu Bradforda Spektrofotometryczna ODCZYNNIK Miedziowy Miedziowy + kwas molibdenowy Kwas fosfomolibdenowy Comassie brillant blue G-250 Absorpcja światła przy 280 nm CZUŁOŚĆ 10 mg/l 1 mg/l 10 mg/l 0,5 mg/l 20 mg/l Zasada metody biuretowej: Polega na tworzeniu barwnego kompleksu jonów miedzi z sąsiadującymi wiązaniami peptydowymi, co zmienia barwę roztworu z niebieskiej na granatowo-fioletową. Im więcej wiązań peptydowych w próbie, tym więcej powstałych kompleksów i tym intensywniejsze zabarwienie mieszaniny reakcyjnej (metoda kolorymetryczna). Reszty aminokwasowe i wolne aminokwasy nie dają barwnych pochodnych z odczynnikiem biuretowym. Reakcja biuretowa zachodzi w środowisku alkalicznym. Maksimum absorbancji dla kompleksu białkowo-miedziowego znajduje się przy długości fali 546 nm. W reakcji biorą udział również oligo- i polipeptydy , dla nich jednak maksimum absorbancji przesunięte jest w stronę mniejszych długości fali (nadfiolet), więc w rutynowym postępowaniu można wyeliminować interferencję ze strony tych związków. Zasada metody Lowry’ego: Reakcja przebiega w dwóch etapach: 1. Przyłączenie jonów miedzi do wiązań peptydowych cząsteczek białka, 2. Redukcja kwasu fosfomolibdenowego i fosfowolframowego ( składników odczynnika Folina-Ciocalteau) do odpowiednich tlenków przez miedź związaną z białkiem oraz przez tyrozynę i tryptofan, zawarte w oznaczanym białku. Ze względu na 100-krotnie większą czułość niż metoda biuretowa, metoda ta stosowana jest do oznaczania białka w rozcieńczonych roztworach i w homogenatach tkankowych. HIPOPROTEINEMIA I HIPOALBUMINEMIA Hipoproteinemia - obniżenie ogólnej zawartości białek w surowicy/osoczu < 65 g/l Hipoalbuminemia - obniżenie stosunku stężeń albumina/globuliny (A/G): marskość wątroby i zespół nerczycowy, przewlekłe stany zapalne, szpiczak mnogi. Niskie stężenia białka całkowitego mogą wynikać z dwóch podstawowych powodów: Upośledzonej syntezy (zarówno w wątrobie jak i w szpiku) Utraty białka z osocza Charakterystyka białek surowicy Albuminy jednorodne białko o globularnej strukturze 60% całej masy białek w osoczu syntezowanym w wątrobie – parenchymalne komórki - 15g/ dobę czasie półtrwania około 15-20 dni Stężenie albumin w osoczu, u zdrowej osoby, powinno mieścić się w przedziale 35-50 mg/ml. U poszczególnych ludzi występuje jeden rodzaj albuminy W bardzo rzadkich przypadkach obserwuje się bisalbuminemię, dziedziczne występowanie dwóch rodzajów albuminy o różnym składzie aminokwasowym i różnej mobilności elektroforetycznej. Inną rzadką dziedziczną anomalią jest analbuminemia, która charakteryzuje się umiarkowanymi obrzękami oraz niskim ciśnieniem krwi. Albuminy odpowiadają za regulację ilości wody znajdującej się we krwi oraz zapobiegają jej przenikaniu z osocza do płynu tkankowego. Funkcja ta wynika ze stężenia białka w osoczu, które jest znacząco większe w porównaniu ze stężeniem w płynie międzykomórkowym. Ciśnienie onkotyczne niejako równoważy ciśnienie hydrostatyczne krwi i uniemożliwia tym samym przechodzenie wody z elektrolitami poza naczynia. Ciśnienie onkotyczne - rodzaj ciśnienia osmotycznego wywieranego przez roztwór koloidalny białek obecnych w osoczu krwi. Zmniejsza prawdopodobieństwo powstania obrzęków. Obniżenie stężenia albuminy jest uważane za jeden z głównych objawów zaawansowanego niedożywienia białkowego i kaloryczno-białkowego. Niskie stężenie jest też wskaźnikiem zespołu wyniszczenia u chorych z nowotworami złośliwymi • • • • FUNKCJE: Transportowa – wiązanie i transport długołańcuchowych kwasów tłuszczowych, endogennych substancji hydrofobowych, leków, jonów metali przejściowych, Ca2+ i Mg2+ Koloidoosmotyczna – wiązanie wody osocza i wywieranie ciśnienia koloidoosmotycznego, które utrzymuje wodę w łożysku naczyniowym Buforowa - wiązanie jonów H+ i kationów Na+ i K+, wzrost siły buforowania w miarę obinżenia pH od 7,4 do 5,5 Przeciwzapalna - hamuje tworzenie leukotrienów zarówno przez neutrofile, jak i przez płytki krwi; hamuje wzrost aktyny przez pobudzone neutrofile i zmniejsza reakcję neutrofilów na działanie cytokin zapalnych Antyoksydacyjna - wiązanie jonów metali przejściowych Cu, Fe, hamuje tworzenie rodnika OH-; wiązanie wolnych kwasów tłuszczowych i nadtlenków kwasów tłuszczowych; wiązanie HOCl; hamowanie wydzielania O2- neutrofilów Odżywcza – pinocytoza i rozkład albuminy – idealne źródło aminokwasów dla komórek, przy niedoborze białek synteza albuminy zostaje 2,5-krotnie przyspieszona, a zasoby obniżają się ok. 60% α1-antytrypsyna (AAT) Białko ostrej fazy o właściwościach inhibitorów proteaz serynowych Znacząco wzrasta w przebiegu ostrej fazy (4-5 krotnie między 2 a 4 dniem) Inaktywuje enzymy proteolityczne (głównie elastazę leukocytarną) uwalniane podczas fagocytozy przez granulocyty wielojądrzaste. Istnieją liczne warianty genetyczne AAT: Fenotyp MM występujący najczęściej (95% populacji) i ma najsilniej wyrażoną aktywność antyproteazową podczas gdy fenotyp heterozygot MZ lub MS ma znacznie obniżoną aktywność tego enzymu. • • • Wiąże trypsynę, chymotrypsynę, kolagenozę, plazmine i trombinę Wrodzony niedobór AAT jest spowodowany defektem wydzielania tego białka z komórek wątroby, skutkiem tego jest gromadzenie się złogów białka w hepatocytach, prowadzące do marskości wątroby Niedobór AAT w osoczu oznacza się jako czynnik ryzyka rozwoju rozedmy płuc i rozstrzeni oskrzeli, niedobór umożliwia degradację włókien kolagenu w płucach, aktywacje układu kinin, dopełniacza procesów krzepnięcia i fibrynolizy Kwaśna α1-glikoproteina (AAG) tzw. Orozomukoid Duża zawartość reszt glikozydowych. Wiązanie i transport progesteronu., tworzy kompleksy z niektórymi białkami układu krzepnięcia Stężenie w stanach zapalnych wzrasta powoli (około 5 dni). Spadek stężenia w ciężkich uszkodzeniach wątroby, zespołach utraty białka, niedożywieniu i wyniszczeniu. Ma zdolność wiązania leków i ksenobiotyków o zasadowym charakterze cząsteczki Oznacza się w celu monitorowania przebiegu reakcji ostrej fazy i odróżnianiu ostrych stanów zapalnych od reumatoidalnego zapalenia stawów, tocznia rumieniatowatego układu, choroby Crohna i niektórych guzów nowotworowych Prawidłowe stężenie 500-1200 mg/l Stężenie w stanach zapalnych wzrasta powoli do około 5g/l (około 5 dni). Spadek stężenia w ciężkich uszkodzeniach wątroby, zespołach utraty białka, niedożywieniu i wyniszczeniu. Haptoglobina (HP) Polimorficzne białko, które wiąże nieodwracalnie wolną hemoglobinę. Zabezpiecza nerki przed hemoglobiną i oszczędza żelazo. Przy masywnej ostrej hemolizie może całkowicie znikać z surowicy. W stanach zapalnych poziom haptoglobiny wzrasta w ciągu 48 godzin Znaczny wzrost w przypadku nowotworów W elektroforezie – we frakcji α2 - globulinowej Podstawowe stężenie wynosi 0,3-2,0 g/l • Diagnostyczne znaczenie tego białka jest związane z jego niskimi stężeniami towarzyszącymi lizie erytrocytów i anemiom hemolitycznym o różnej etiologii Ceruloplazmina (CER) Późne białko ostrej fazy Nie wpływa na obraz elektroforetyczny Pojedynczy łańcuch CER wiąże 6-7 atomów miedzi, jednak nie jest białkiem transportowym. Katalizuje utlenianie Fe2+ do Fe3+ umożliwiając jego związanie z transferyną. Niski poziom CER i wysokie stężenie dializowanej miedzi są wskaźnikami w rozpoznaniu choroby Wilsona. Wysoki wzrost stężenia tego białka u kobiet w ciąży lub stosujących doustne środki antykoncepcyjne może powodować charakterystyczne zielonkawe zabarwienie surowicy. Obniżony poziom obserwuje się w ciężkich uszkodzeniach wątroby, zespole nerczycowym i w enteropatiach. Transferyna (TRF) Główne białko osocza transportujące Fe3+ do szpiku kostnego. Syntezowane głównie w wątrobie; w mniejszych ilościach w układzie siateczkowo- śródbłonkowym, jądrach i jajnikach. W anemiach z niedoboru żelaza poziom TRF jest wysoki a wysycenie żelazem niskie. W stanach zapalnych, chorobach nowotworowych stężenie ulega obniżeniu. Wysoki poziom obserwuje się w ciąży i podczas podawanie estrogenów. Spadek stężenia stwierdza się w zespole nerczycowym, w upośledzeniu funkcji wątroby i niedożywieniu FIBRYNOGEN ➢I czynnik krzepnięcia. ➢Wytwarzany w wątrobie. ➢Bierze udział w końcowej fazie procesu krzepnięcia.. ➢Przekształca się w białko fibrylarne – fibrynę, współtworzącą skrzep krwi. Fibrynogen łącząc się z receptorami GpIIb/IIIa powoduje agregację aktywowanych trombocytów. ➢Jest zaliczany do białek ostrej fazy. • Najwyższe stężenia sięgające 15 g/l obserwuje się w rozrostowym zapaleniu kłębków nerkowych, przy jednoczesnym obniżeniu poziomu białek drobnocząsteczkowych w osoczu, wskutek utraty z moczem • Podwyższone stężenia dodatnich białek ostrej fazy i niskie stężenie fibrynogenu mogą towarzyszyć niezdiagnozowanym procesom wykrzepiania ALFAFETOPROTEINA (AFP) ● W okresie płodowym syntetyzowana jest głównie przez wątrobę i ciałko żółte oraz w mniejszych ilościach przez komórki błony śluzowej przewodu pokarmowego. ● Oznaczanie stężenia AFP w surowicy stanowi podstawę diagnostyki dla pierwotnego raka wątroby, nowotworów jądra i jajników, nowotworu złośliwe przewodu pokarmowego (w tym rak trzustki, żołądka i jelita grubego). ● Również u chorych z marskością wątroby, przewlekłym HBs-Ag-dodatnim zapaleniem wątroby, niedoborem alfa-1antytrypsyny obserwuje się podwyższone (nie przekraczające jednak 500 ng/ml) stężenie AFP. PROKALCYTONINA (PCT) czuły i w wysokim stopniu swoisty marker ciężkich infekcji bakteryjnych. jest markerem przydatnym w różnicowaniu ostrych infekcji bakteryjnych od wirusowych (zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, zapalenie płuc) u osób zdrowych stężenie tego białka nie przekracza 0.05 ng/ml, w przebiegu miejscowych infekcji bateryjnych może wzrastać dziesięciokrotnie, a we wstrząsie septycznym obserwuje się wartości sięgające nawet 1000 ng/ml. Wzrost stężenia PCT obserwuje się już po 2 godzinach od wystąpienia stanu ostrej fazy, Okres połowicznego zaniku PCT 24 godziny czynnikiem pobudzającym produkcję PCT są toksyny bateryjne. Wzrost stężenia PCT: Infekcje bakteryjne (nieznaczny wzrost w infekcjach miejscowych) Infekcje grzybicze Infekcje pasożytnicze Posocznica SIRS (zespół uogólnionej reakcji zapalnej) Rozległe oparzenia Malaria Martwicze ostre zapalenie trzustki Rak rdzeniasty tarczycy, drobnokomórkowy rak płuc Guzy neuroendokrynne zawał mięśnia sercowego Urazy mechaniczne Skład frakcji białkowych surowicy FRAKCJA Albuminy α1-globuliny α2-globuliny β1-globuliny β2-globuliny γ-globuliny BIAŁKA Albumina α1-antytrypsyna α1-kwaśna glikoproteina α1-lipoproteina (apo A, HDL) α2-makroglobulina haptoglobina Transferryna β-lipoproteina (apo B, LDL) Frakcja C3 dopełniacza IgA IgG Immunoglobuliny klasy IgA, IgG, IgM (niektóre z nich wykazują mobilność frakcji β, a nawet α2) Białko C-reaktywne Wartości prawidłowe frakcji elektroforetycznych w surowicy: Albuminy α1-globuliny α2-globuliny β1-globuliny β2-globuliny γ-globuliny 55 - 70 % (frakcja najbliższa anodzie) 1,4 - 4 % 6 – 11 % 4–8% 2–4% 9 – 18 % (frakcja najbliższa katody) IMMUNOGLOBULINY ➢Heterogenna grupa białek o podobnej budowie, syntezowanych przez limfocyty B. ➢W zależności od pobudzającego antygenu skład aminokwasowy poszczególnych przeciwciał znacznie się różni. ➢Powoduje to znaczne różnice zarówno w ich działaniu biologicznym jak i w ruchliwości elektroforetycznej. BUDOWA IMMUNOGLOBULIN ➢Tetramery zbudowane z 2 łańcuchów ciężkich (H) i 2 łańcuchów lekkich (L). ➢Łańcuchy H i L są połączone ze sobą mostkami disiarczkowymi. ➢W odcinku C-końcowym (Fc) zawierającym po dwie lustrzane domeny łańcuchów H znajduje się miejsce wiązania dopełniacza. ➢Odcinek N-końcowy (Fab) zawiera w każdym z ramion po 2 domeny łańcuchów H i L. Znaczna zmienność sekwencji aminokwasów. ➢Punkt zawiasowy powoduje zmiany konformacji cząsteczki Ig po związaniu z antygenem. ➢Istnieje 5 klas Ig w zależności od budowy i sekwencji aminokwasów w stałych domenach łańcuchów H. ➢IgG, IgM, IgA, IgD, IgE zawierające odpowiednio łańcuchy H: γ, μ, α, δ, ε. ➢Wszystkim klasom łańcuchów H wspólne są łańcuchy L klasy Kappalub Lambda. KLASY IMMUNOGLOBULIN Metody rozdziału i detekcji: 1) elektroforeza Elektroforeza białek polega na rozdziale białek surowicy na różnego rodzaju podłożach w buforze o zasadowym pH. W lekko zasadowym środowisku większość białek jest anionami i wędruje w kierunku anody ( albumina, alfa-globuliny). Szybkość wędrówki poszczególnych białek zależy od wielkości ich ładunku ujemnego i jego stosunku do masy cząsteczki białka. Większe białka ( gamma-globuliny) zostają bliżej katody ( miejsce nałożenia). W większości technik elektroforetycznych ( różniących się rodzajami podłoża) otrzymuje się 5-6 głównych frakcji białek surowicy. Przy elektroforezie białek osocza fibrynogen lokuje się między frakcjami beta-gamma. bibułowa na agarozie w żelu poliakryloamidowym (PAGE) w warunkach denaturujących (SDS-PAGE) i niedenaturujących W warunkach denaturujących: Podłożem usieciowanym jest jest żel poliakrylamidowy. Dodawany jest detergent jonowy larylosulfonianu sodu( sól sodowa siarczanu dodecylu – SDS), który powoduje opłaszczenie cząsteczek białka przez SDS i ich denaturację. Cząsteczki białka tworzą z detergentem agregaty na zasadzie oddziaływania lipofilowej części cząsteczki SDS z organicznymi rodnikami aminokwasów wchodzących w skład białka. Opłaszczone białka migrują w żelu z prędkością proporcjonalną do logarytmu odwrotności masy cząsteczkowej. SDS elektroforezę stosujemy do analizy mas cząsteczkowych białek. Po rozdziale uzyskuje się białka o osłabionej aktywności biologicznej. SDS przyłącza się do hydrofobowych obszarów protein. Powoduje nie tylko rozwinięcie cząsteczki przez rozerwanie wiązań stabilizujących strukturę wyższych rzędów, ale również maskowanie pierwotnego ładunku białka w danym elektrolicie. Oznacza to, że wszystkie cząsteczki niezależnie na swój pierwotny ładunek wypadkowy, po połączeniu z SDS otrzymują ładunek ujemny. Pozwala to na migrację wszystkich białek w kierunku anody i rozdział elektroforetyczny jedynie pod względem masy cząsteczkowej (a nie ładunku). W warunkach niedenaturujących: Warunki są takie same jak w przypadku elektroforezy w warunkach denaturujących z tym, że nie dodaje się SDS oraz białka nie są poddawana denaturacji cieplnej przed aplikacją na żel, co wpływa na ich strukturę III i IV-rzędową oraz aktywność biologiczną. Efektem jest rozdzielenie białek bez wpływania na ich aktywność biologiczną. Wprowadzenie tych warunków pozwala zachować nienaruszoną strukturę białka oraz jego ładunek, zatem prędkość białek uzależniona jest i od masy cząsteczkowej białka i od ładunku. ogniskowanie izoelektryczne (IF) Jest techniką o wysokiej rozdzielczości pozwalającą na rozdział białek o bardzo złożonej budowie. Analiza ta wykorzystuje zjawisko punktu izoelektrycznego tj. takiej wielkości pH przy którym wypadkowy ładunek białka jest równy zeru. Z chwilą znalezienia się w takim pH cząsteczki białka zatrzymują się. Gdy cząsteczki amfoteryczne umieści się w nośniku z ciągłym gradientem pH, pod wpływem pola elektrycznego będą one poruszać się w stronę pH równego ich pI aż do osiągnięcia zerowego ładunku wypadkowego(gdzie nie będą podlegać już działaniu pola elektrycznego). Istotnym etapem rozdziału jest stworzenie warunków, w których pH buforu zmienia się w w sposób ciągły, uzyskując najniższą wartość przy anodzie, a najwyższą przy katodzie. Technikę tę można prowadzić na żelach agarozowych jak i poliakryloamidowych dwukierunkowa w układzie IF – SDS-PAGE Technika łącząca ogniskowanie izoelektryczne z elektroforezą strefową, co skutkuje rozdziałem białek pod względem punktu izoelektrycznego i masy molekularnej. Jest doskonałą alternatywą dla rozdziału np. białek tego samego rodzaju poddanych różnym modyfikacjom potranslacyjnym. Pierwszym tzw. Kierunkiem rozdziału jest ogniskowanie izoelektryczne, gdzie następuje rozdział białek pod względem ich pI. Po dokonaniu rozdziału nośnik obraca się o 90o, inkubuje się w roztworze SDS a następnie przeprowadza rozdział próby w drugim kierunku pod względem masy molekularnej. Wizualizacja odbywa się w podobny sposób jak w przypadku bawienia żeli po przeprowadzeniu innych rozdziałów elektroforetycznych – przez barwienie barwnikiem brylantowym Coomassie lub znacznie czulsze – barwienie srebrem. Kapilarna Zwana też elektroforezą w wolnym buforze, służy najczęściej do rozdziału niewielkich cząsteczek (podobnie jak wysokosprawna chromatografia cieczowa). Technika ta umożliwia rozdzielanie anionów i kationów soli organicznych i nieorganicznych, analizę DNA oraz rozdział peptydów. Rozdział mieszanin prowadzi się w cienkiej (średnica wewnętrzna 25–100 µm) i długiej (0,5– 1 m) kapilarze kwarcowej, przypominającej wyglądem światłowód. Kapilara ta wypełniana jest buforem rozdzielającym (inaczej separacyjnym). Próbkę wprowadza się do wlotu kapilary, po czym przykłada do niej wysokie napięcie elektryczne (do 30 kilowoltów). U wylotu kapilary zamontowany jest detektor rejestrujący wychodzenie z rurki kolejnych związków chemicznych. Bufor płynie przez kapilarę ze stałą szybkością w stronę jednej z elektrod (dla układu wodnego jest to zwykle katoda). Cząsteczki poruszają się z różną prędkością zależną od ich masy cząsteczkowej i wielkości ładunku. 2) techniki barwienia prążków uzyskanych po rozdziale elektroforetycznym na żelach Stosowanych jest wiele metod wizualizacji żeli i membran. Białka najczęściej wybarwia się stosując naturalne barwniki, takie jak błękit kumassi (ang. Coomassie Brilant Blue) czy czerń amidową. Barwnik dodawany jest zwykle do roztworu utrwalającego położenie białka w żelu (denaturacja i unieruchomienie molekuł), po czym nadmiar barwnika jest wymywany. Pozostaje tylko barwnik związany z białkami. Czułość takiej detekcji białek jest stosunkowo dobra. Można w ten sposób znaleźć 1 μg białka w prążku. Znacznie bardziej czułą metodą jest barwienie srebrem. Metoda ta pozwala oznaczyć 10 ng białka w prążku. Przy pomocy srebra można również wybarwić kwasy nukleinowe oraz oligonukleotydy, a czułość detekcji zbliżona jest również do 10 ng DNA na prążek. 3) technika Western blotu Najprostsza metoda wykorzystywana do immunodetekcji białek. Polega na przeniesieniu białek z żelu poliakrylamidowego na stałe podłoże . technika ta umożliwia anaizę badanego białka , zarówno biochemiczną jak immunologiczną , pozwala na molekularne określenie róznych wariantów białka oraz pracę z ieoczyszczonymi preparatami antygenu: dzieki wysokiej czułości umożliwia detekcję antygenow w iości oniżej 1ug. Technika blottingu skąłda się z 3 etapów: 1. Rozdział elektroforetyczny preparatu białkowego 2. Przeiesienie i trwałe związanie rozdzielonego w procesie elektroforezy materiału na podłoże stałe 3. Wykrywanie utrwalonych na podłożu białek technikami immunoenzymatycznymi(związanie białka ze specyficznym przeciwciałem np mysim, a następnie wykrycie mysich przeciwciał przeciwciałami króliczymi związanymi z enzymem katalizującym reakcję barwną ) lub immunoradiologicznymi. 4. immunoidentyfikacja 6. Rodzaje nośników elektroforetycznych Nośniki elektroforetyczne - Rozdziały elektroforetyczne mogą być prowadzone bezpośrednio w objętości elektrolitu, rozwiązanie takie stosowane jest często w elektroforezie kapilarnej, lub w nośniku elektroforetycznym wypełnionym odpowiednim elektrolitem. W tym drugim przypadku nośnik elektroforetyczny (bibuła, azotan celulozy, agaroza, poliakrylamid i inne) nie tylko stabilizuje elektrolit ale często przyczynia się do lepszej separacji makrocząsteczek. Szczególnie zastosowanie porowatych nośników (agarowa, poliakrylamid) potęguje efekt separacji poprzez dodatkowe frakcjonowanie makrocząsteczek na zasadzie sita molekularnego. Żel poliakrylamidowy posiada następujące cechy: jest bezbarwny, pozbawiony ładunków, odznacza się dużą wytrzymałością mechaniczną, łatwy w przygotowaniu łatwy w formowaniu w odpowiednich naczyniach. Żel poliakrylamidowy to łańcuchy akrylamidu (H2C=CH-CO-NH2) połączone wiązaniami poprzecznymi za pomocą N,N’-metyleno-bisakrylamidu (H2C=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2). W ten sposób tworzy się sieć, przez „oczka „ której migrują rozdzielane cząsteczki. Wielkość „oczek” sieci żelu zależy od stężenia akrylamidu oraz bisakrylamidu. Agaroza to polisacharyd będący polimerem pochodnych galaktozy, otrzymywany przez oczyszczanie z agaru jadalnego. Agaroza jest łatwo rozpuszczalna w wodzie, w temperaturze pokojowej odwracalnie tworzy żel. Metoda z uzyciem agarozy jest bardzo prosta Agar z bromkiem etydyny umożliwia ustelenia bezpośrednio lokalizacji fragmentów DNA Temperatura przejścia żelu w zol (potocznie topnienie agarozy) jest wyższa od temperatury zestalania. Elektroforeza DNA w żelu agarozowym jest standardową metodą pozwalającą rozdzielić, zidentyfikować lub oczyścić fragmenty DNA. 7. Metody immunoelektroforetyczne Immunofiksacja Jest metodą immunoelektroforetyczną, która wykorzystuje swoiste przeciwciała celem uwidocznienia oraz identyfikacji frakcji białkowych wcześniej rozdzielonych przy pomocy elektroforezy. Dzięki immunofiksacji rozpoznaje się typ immunoglobuliny, która wcześniej pojawiła się jako pojedynczy monoklonalny prążek w elektroforezie. Pozwala na wykrycie białka monoklonalnego (często klasy IgA) migrującego w wąskiej strefie beta-globulin. Ułatwia też interpretacje nietypowych lub budzących wątpliwości rozdziałów. W trakcie immunofiksacji strefa białka monoklonalnego łączy się z immunoglobulinami diagnostycznymi, co zwiększa ilośc białka w analizowanej frakcji i podnosi czułość analityczną metody. Immunoelektroforeza W tej metodzie próbka materiału (surowicy) podlega rozdziałowi elektroforetycznemu. Następnie do podłużnego wgłębienia w podłożu, biegnącego wzdłuż ścieżki rozdziału elektroforetycznego, nakłada się przeciwciała przeciwko wszystkim białkom surowicy lub swoiste przeciwciała reagujące tylko z wybranymi białkami. W wyniku dyfuzji białek zawartych w rozdzielanym materiale i zastosowanych przeciwciał powstają luki precypitacyjne antygen-przeciwciało, których położenie i kształt są charakterystyczne dla danego białka i w pewnym zakresie zależą od jego ilości. Znaczenie tej metody polega na tym, że można ją za pomocą uzyskać ponad 20 łuków immunoprecypitacyjnych odpowiadającym poszczególnym białkom po elektroforetycznym rozdziale białek surowicy tylko na 5 frakcji. 8. Znaczenie diagnostyczne rozdziału elektroforetycznego białek surowicy (zespół nerczycowy, kłębuszkowe zapalenie nerek, marskość wątroby, wirusowe zapalenie wątroby, białaczka limfatyczna, nowotwory, ostre zakażenia).
