Monomeryczne białka G
advertisement
Molekularne przełączniki - nie wszystkie procesy przebiegają w komórce równocześnie – część działa cyklicznie, kontrolując zachowanie komórki i jej reakcje w zależności od różnorodnych sygnałów - takie białka, szczególnie często spotykane w obrębie szlaków przekazywania sygnałów, nazywane są molekularnymi przełącznikami - główną klasą MP są GTPazy (białka G), kontrolujące włączanie/wyłączanie większości procesów komórkowych Białka G GNBP - guanine nucleotide binding protein GAP - GTPase activating protein GEF - guanine nucleotide exchange factor GDI - guanine nucleotide dissociation inhibitor GPR - G protein regulatory motif ATP - energia dla enzymatycznych reakcji metabolicznych, fosforylacji w regulacji wewnątrzkomórkowej i ruchu motorów molekularnych GTP - głównie używany w regulacji procesów z udziałem GNBP (z wyjątkiem dynaminy, septyny, tubuliny i czynnika elongacyjnego G) Guanine nucleotide binding proteins Heterotrimeryczne białka G – zbudowane z podjednostek , – outside-in signaling Monomeryczne białka G (100 kDa) i (20-29 kDa) – małe białka G, GNBP – przekazywanie sygnałów wewnątrz komórki – przełączniki molekularne Nadrodzina Ras Rho Ras reorganizacja cytoszkieletu, podziały komórek podziały i różnicowanie komórek Rab Ran transport pęcherzykowy i sekrecja transport jądrowy, kontrola cyklu komórkowego Arf/Sar tworzenie pęcherzyków, aktywacja PLD GTPazy z rodziny Rho Small GTP-binding proteins of the Rho subfamily (Rho, Rac, Cdc42) function to organize the actin cytoskeleton, including: filopodium extension, lamellipodium formation, generation of actin stress fibers, focal adhesions Rho GTPases Cdc42 cells send out exploratory filopodia RhoA formation of actin stress fibers and focal adhesions, microtubule stabilization Rac1 extensions of broad sheet-like lamellipodia, destabilization of microtubules signal membrane G protein cycle R GDP GD RhoI GDP GTP GDP GTP inactive GAP – GTPase activating protein GEF – guanine nucleotide exchange factor GDI – guanine nucleotide dissociation inhibitor GAP GEF GTP Rho active effector proteins biological response Rho GTPases amplification integration time control precision (No. of genes) http://www.sciencemag.org Struktura GNBP - minimalna domena G Uniwersalny przełącznik wiązanie γ-fosforanu przez grupy NH łańcucha głównego zachowywanych ewolucyjnie reszt Thr35 i Gly60 uwolnienie grupy fosforanowej powoduje lokalną relaksację, przekładającą się na zmianę konformacyjną pętli switch I i II Ruchliwość regionów przełącznikowych Ruchliwość regionów przełącznikowych G domain Vetter & Wittinghofer, 2000 Grupa gamma fosforanowa określa strukturę regionów przełącznikowych Domena G Zmiany konformacyjne w białku Ran w czasie hydrolizy GTP do GDP Dodatkowe domeny w GNBP i ich lokalizacja względem domeny G Czynnik elongacyjny Tu (EF-Tu), czynnik inicjacyjny (IF2/eIF5B), czynnik elongacyjny G (EF-G) - mają odpowiednio dwie, trzy lub cztery dodatkowe domeny Gi - niezależnie zwijająca się domena -helikalna Rho - dodatkowy 13 aa, -helikalny insert hGBP1 (human guanylate - wiele dodatkowych elementów II rzęd. i C-terminalna domena typu coiled-coil binding protein) Mnogość oddziaływań domeny G z efektorami Regiony przełącznikowe ‘switch’ są zawsze przynajmniej częściowo zaangażowane w wiązanie efektora Różne rodziny przełączników molekularnych – podobieństwo struktury i funkcji Kinezyna Miozyna Małe białko G Model for the motor actions of muscle myosin Models for the motor actions of muscle kinesin signal membrane G protein cycle R GDP GD RhoI GDP GTP GDP GTP inactive GAP – GTPase activating protein GEF – guanine nucleotide exchange factor GDI – guanine nucleotide dissociation inhibitor GAP GEF GTP Rho active effector proteins biological response Schemat działania białka GEF Seria szybkich i odwracalnych reakcji: - binarny kompleks GNBP-nukleotyd - trimeryczny kompleks GNBP-nukleotyd-GEF - binarny kompleks GNBP-GEF Równowaga jest przesuwana na korzyść związanego GDP czy GTP przez odpowiednie powinowactwo GDP i GTP do GNBP; stężenie nukleotydów; powinowactwo i stężenie dodatkowych białek (jak efektory które przesuwają równowagę w stronę formy związanej z GTP - strukturalnie białka GEF nie są spokrewnione i szczegóły „zwalniania” GDP są różne. Jest kilka mechanistycznych podobieństw: oddziaływanie ze switch I i II oraz dostarczenie reszt w obrębie pętli P. - nie jest jasne, jaka jest kolejność wydarzeń prowadzących do wymiany GDP/GTP, ani która cześć nukleotydu jest zwalniana pierwsza – zasada czy fosforan Białka GEF GDI – inhibitor dysocjacji nukleotydu - zupełnie różne sposoby zwinięcia poznanych GDI - wymagają do wiązania prenylowanego końca GNBP - kompleks GNBP-GDI tworzy rezerwuar komórkowy GNBP i pozwala na jego transport do różnych błon w obrębie komórki - stąd rola GDI jako inhibitora zdaje się być jedynie przypadkową konsekwencją Figure 7. Guanine nucleotide dissociation inhibitors. A. Rac2·RhoGDI (LyGDI) complex (PDB 1ds6). Cterminal immunoglobulin-like domain is designated LyC, N-terminal - LyN, linker recognized by ICE protease – ICE. B. Surface and electrostatic potential of LyGDI. Positively charged (basic) regions in blue and negatively charged (acidic) ones in red. The hydrophobic cavity responsible for binding of the Cterminally attached isoprenyl moiety is also shown. The switch I (SwI) and switch II (SwII) regions are buried in the interaction site. C. RabGDI (PDB 1gnd). The GCD domain responsible for Rab binding is shown. signal membrane G protein cycle R GDP GDP GTP GAP – GTPase activating protein GEF – guanine nucleotide exchange factor GDI – guanine nucleotide dissociation inhibitor GD RhoI GDP GTP inactive GAP GEF GTP Rho active effector proteins biological response Domena GAP • GAP dostarcza reszt stabilizujących rejony przełącznikowe I i II, a głównie resztę Arg stabilizującą Gln-61 (Gln-63 w RhoA), powodując tym samym odpowiednią orientację cząsteczki wody do hydrolizy -fosforanu. W większości przypadków palec argininowy (arginine-finger) jest niezbędny, ale są również inne kluczowo ważne dla aktywności typu GAP reszty. Dla przykładu domena BH p85PI3-kinazy (BHPI3-K) zawiera zachowywaną Arg, wiąże się do Rho, ale nie posiada aktywności typu GAP. Wyjątek stanowią: Rap, PSF, hGBP-1septyna, dynamina gdzie zamiast Gln występuje Thr, His, reszta hydrofobowa Mechanizm działania GAP GAP GTP GTPaza Multifunctional GAP proteins Domena GAP A. Giα1·GDP·AlF4­­-· RGS4 B. H-Ras·GDP·p120GAP C. Rho·GDP·AlF4­­-·RhoGAP Domena GAP Nałożenie kompleksów białkowych: Ran–RanBP1–RanGAP (czerwony) Rho–RhoGAP (pomarańczowy) Ras–RasGAP (zielony) G –RGS (niebieski) Bardzo podobna architektura regionów ‘switch’ I i II, podobna lokalizacja reszty glutaminy i nałożenie cis-Arg z G , trans-Arg z Ras i RhoGAP, oraz reszty tyrozyny z Ran. Domena GAP RasGAP – zółty, RhoGAP – czerwony, RacExoS – niebieski, G RGS Toksyna ExoS z Pseudomonas aeruginosa inaktywuje Rho „udając” GAP - Zwykle jedyną funkcją hydrolizy GTP przeprowadzanej przez małe białka G przy udziale GAPów jest zmiana stanu białka G – z włączonego na wyłączony - Zdarzają się jednak przypadki, gdy wytworzona energia może być wykorzystana również w inny sposób – w przypadku białka Ran hydroliza GTP jest siłą napędową dla transportu przez por jądrowy - W cytozolu RanGAP utrzymuje Ran prawie wyłącznie w formie nieaktywnej, natomiast w jądrze białko Ran nucleotide exchange factor (RCC1) umożliwia przejście z Ran·GDP do Ran·GTP. - Receptory importowe (importyny ) i eksportowe (eksportyny) w jądrze wiążą się z różnym powinowactwem do Ran·GTP i Ran·GDP, co umożliwia wymianę ładunku. Regulacja białek GAP - jest przynajmniej 140 ludzkich małych białek G - około 160 ludzkich genów koduje białka GAP. Stanowi to 0,5% genomu - ”drugorzędowa” rola białek G w cyklu? -regulacja aktywności białek GAP (fosforylacja, oddziaływanie białkobiałko, białko-lipid, lokalizacja komórkowa, proteoliza) - białka GAP mogą być efektorami dla GTPaz – integracja sygnałów Regulacja poprzez oddziaływanie z białkami -aktywność p190-B RhoGAP jest stymulowana oddziaływaniem z Rnd3 – kaskadowe oddziaływanie GTPaz mediowane przez białka GAP, podobnie jak w przypadkach opisanych dla białek GEF - wewnątrzcząsteczkowo: poprzez domenę P (w p120 RasGAP) Regulacja poprzez fosforylację Regulacja białek GAP http://www.sciencemag.org Tubulina - struktura oznacza funkcje... -- dla biochemika jest to biochemiczna rola białka, dla genetyka funkcje wyznacza fenotyp mutanta, dla fizjologa spojrzenie na funkcje jest jeszcze szersze - (a) wiązanie monomerów (b) tworzenie protofilamentów (c) wiązanie motorów białkowych (d) siła napędowa wici (e) sieć „autostrad” komórkowych Rozpoznanie, komplementarność i centra aktywne - miejsca wiążące ligandy i centra aktywne są tworzone w trakcie zwijania białka poprzez nieidealne pakowanie się łańcuchów bocznych - regiony te tworzą mikrośrodowiska, które znacznie różnią się od otaczającego rozpuszczalnika (jeśli reszty budujące kieszeń są hydrofobowe, jej wnętrze przypomina rozpuszczalnik organiczny i może ona wiązać np. lipidy) - kompromis energetyczny kumulacji reszt o tych samych własnościach (np. przy tworzeniu naładowanych łatek) Wiązanie substratu (MAPKK-2) do czynnika L toksyny wąglika (anthrax toxin lethal factor) Rozpoznanie, komplementarność i centra aktywne - wyspecjalizowane mikrośrodowiska miejsc wiążących Centrum aktywne racemazy ze związanym substratem są podstawą zdolności katalitycznych enzymów - silne pole elektrostatyczne jest tworzone poprzez bliskość Arg/Lys i Glu/Asp. W roztworze wodnym lub strukturze białka powstanie mostek solny, ale w pewnych mikrośrodowiskach wymiana protonu między nimi jest niekorzystna bliskość reszt Lys164 i 166 obniża ich powinowactwo do protonu Białka są cząstkami elastycznymi - najszybsze ruchy to wibracje atomów i rotacja grup metylowych - tranzycje z jednego rodzaju zwinięcia do drugiego zachodzą niezwykle rzadko - fluktuacje konformacyjne w strukturze domen zachodzą jedynie lokalnie (ligandy mogą powodować lokalne uporządkowanie, zwinięcie się fragmentu białka) Izomeraza triozofosforanowa - 8 reszt 10Å - po związaniu liganda, pętla „na dwóch zawiasach” zamyka miejsce wiązania i wchodzi z nim w interakcje, jednocześnie osłaniając ligand od rozpuszczalnika - ruchy pozostałej części białka są dużo mniejsze („rigid-body movement”) -białka nazwano cząsteczkami „półciekłymi” – ruch atomów większy niż w ciałach stałych (np. NaCl), ale mniejszy niż w wodzie -im ciemniejsze zacieniowanie, tym bardziej sztywny atom -powierzchnia nie jest jednakowo dynamiczna -grupy metylowe i reszty aromatyczne wykazują ruchy kolektywne Mioglobina kaszalota zacieniowana zgodnie ze stopniem elastyczności Aminotransferaza Asp forma zamknięta i otwarta -ruchy indukowane wiązaniem liganda – o najwyższej wadze funkcjonalnej -rearanżacja pojedynczej reszty vs. ruch całej domeny siłą sprawczą dla induced fit jest mostek solny między Arg domeny mobilnej a grupą karboksylową liganda (Asp) -indukowane dopasowanie – związanie substratu powoduje przejście z formy nieaktywnej w aktywną (w tym przypadku z 10o przesunięciem mniejszej domeny w kierunku głównej części cząsteczki) Różna elastyczność/sztywność białek w zależności od ich funkcji i pochodzenia (białka termofilne) Różnice w temperaturowej zależności aktywności dehydrogenazy 3fosforanu D-gliceraldehydu (GAPDH) z dwóch organizmów są pochodną ich sztywności Elastyczność białek Ścisłe dopasowanie pomiędzy białkiem i ligandem (Kinaza białkowa A z analogiem peptydowym) klucz – zamek indukowane dopasowanie (induced fit) By związać ligand, białko musi być zdolne do utworzenia miejsca wiążącego o odpowiedniej dla partnera stereochemii, konfiguracji ładunków i potencjale grup tworzących HB Białko „otula” ligand dzięki swej naturalnej elastyczności Dopasowanie białka do różnych ligandów -elastyczność białek zapewnia możliwość dopasowania konformacyjnego do wiązanego liganda (pod warunkiem, że dojdzie do utworzenia wystarczająco wielu korzystnych oddziaływań, przewyższających energetyczny koszt dopasowania strukturalnego) proteaza HIV w kompleksie z trzema różnymi inhibitorami powodującymi zamknięcie „klapy” (a) haloperidol (b) crixivan (c) peptydowy analog substratu Zmiany konformacyjne wymuszone związaniem liganda AMP Przykład dużej zmiany konformacyjnej (kinaza adenylanowa) AMP+ATP Miejsca wiązania makrocząsteczek – wklęsłe, wypukłe lub płaskie -oddziaływanie poprzez jedną dużą powierzchnię zagrzebania (setki Å2) lub kilka oddzielonych obszarów -trudne do przewidzenia (setki kontaktów) -ścisłe dopasowanie, wiele punktów kontaktu -najczęściej ligand wiązany jest przez wystające pętle lub w obrębie dużego zagłębienia (dodatkowe dopasowanie kształtu), ale zdarzają się też całkiem płaskie interfejsy oddziaływania Kompleks hGH z dwoma cząsteczkami receptora, dwie niezależne powierzchnie oddziaływania hGH z dwiema identycznymi cząsteczkami receptora Miejsca wiązania – wystające helisy i pętle Dwa kompleksy białko-DNA (a) represor genu toksyny dyfterytu (rozpoznanie przez helisa-zwrot-helisa) (b) czynnik transkrypcyjny Gal4 (rozpoznanie przez pętlę stabilizowaną przez Zn) cyt P450 ze związanym substratem Wiązanie liganda we wnętrzu „kieszeni” białka -elastyczność białek pozwala znaleźć się w ich wnętrzu bardzo dużym ligandom -miejsce wiązania liganda często można zidentyfikować jako „jamkę” w strukturze wolnego białka Położenie miejsc wiążących Dimeryczna dehydrogenaza bakteryjna 3-izopropylomaleinianu Miejsca katalityczne często występują na styku domen strukturalnych i/lub podjednostek Słabe oddziaływania prowadzą do łatwej wymiany partnerów w ścieżce sygnalizacyjnej (partner swapping) STAT – signal transducer and activator of transcription Wymiana domen w białku kapsydu wirusa papilloma służy stabilizacji trimeru (domain swapping) Wiązanie liganda poprzez oddziaływania hydrofobowe i HB: siła i/lub specyficzność -wkład w energię wiązania dzięki siłom niekierunkowym (oddziaływania hydrofobowe) -wkład w specyficzne rozpoznanie dzięki siłom kierunkowym (HBs) Białka strukturalne - komórka jest tworem silnie ustrukturyzowanym a zarazem dynamicznym - nadanie i utrzymanie kształtu komórek i organelli, a także jego zmiany w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne, zależą od białek strukturalnych - kształt samego tylko rybosomu zależy od ponad 100 różnych białek - wiele struktur tworzonych przez białka ma charakter tymczasowy, np. skrzepy krwi, włókna naprężeniowe Oddziaływania w białkach strukturalnych -rusztowania wyłącznie białkowe (α - kolagen, β - jedwab, elastyna, keratyna, wirusy) lub mieszane (chrząstka) -często cross-linking łańcuchów białkowych (kolagen, elastyna) Białka - szkielety, rusztowania i łączniki Białka strukturalne o aktywności katalitycznej (miozyna II) – polimeryzacja/depolimeryzacja, ruch białek względem siebie Białko będące rusztowaniem - Ste5p (scaffold protein)
