Inżynieria genetyczna

Inżynieria genetyczna
Ćwiczenia 15h
Biotechnologia I st
TEMAT: ANALIZA SEKWENCJI NUKLEOTYDOWEJ – ON-LINE
ĆWICZENIA 4
Zadanie 1
Program Primer-BLAST, pozwala na odnalezienie specyficznych starterów
wymaganych przy amplifikacji dowolnie wybranej sekwencji. Wybór odpowiednich
starterów jest podstawą poprawnie przeprowadzonej reakcji PCR. Primer-BLAST
pozwala na dobór starterów:
- o odpowiedniej długości (18-30 bp)
- o porównywalnej temperaturze topnienia (zależy to od zawartości par GC w
łańcuchu)
- o wysokiej specyficzności w stosunku do amplifikowanej sekwencji.
Dowiesz się również do czego służy program NEBcutter2, który jest narzędziem
pozwalającym odnaleźć enzymy restrykcyjne tnące stworzony produkt PCR na dwa,
trzy lub cztery fragmenty. Enzymy restrykcyjne są niezwykle przydatne w biologii
molekularnej, gdyż mają zdolność trawienia DNA. Pozwalają na:
- tworzenie map genetycznych
- izolację oraz identyfikację poszczególnych genów
- sekwencjonowanie DNA
- rekombinowanie i klonowanie genów
- ustalanie zgodności tkankowej
Użyj podanej poniżej nici nukleotydowej oraz narzędzia „Primer-BLAST” dostępnego
na stronie http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ do stworzenia starterów
pozwalających amplifikować jak najdłuższy produkt.
TTTACGCAGACTCCTTGTAAGGATCCTCCGGACAAGTTGTTTACGGTTCACGGT
TTGTGGCCCTCAAGCGTAATCAGATCGTAATATTGTTTATTTCCTTTATGTACTTG
TGCGTGTGTTTGTGTATAGTTTAAAATATAATCATAATTTTTTTTTTCTTTTGTGCA
TACCAGAGAGAAAAATTACTCACTCCTTGTAAGGATCCTCCGGACAAGTTGTTTA
CGGTTCACGGTTTGTGGCCCTCAAGCACGATAGGACCTGACCCAAGTAATTGCC
CGATAAGGAACATTCGGAAGGTAATATTATAACCTGACCCAAGTAATTGCCCGAT
AATCCTCAAACATAGATTTTCATGCACGTGTGTACAAATATTACAATTAGTTTAAA
ATATAATCATAATTTTTTTTTTCTTTTGTGCATACCAGAGAGAAAAATTACTC
Powiedz:
a) Jaką długość ma amplifikowany produkt?
b) Jaka jest sekwencja starterów nici plus oraz nici minus oraz jaka jest ich długość?
c) Jaka jest zawartość procentowa par GC starterów oraz temperatura ich topnienia?
Czy są podobne?
c) W których miejscach na nici program zaprojektował startery?
Następnie po ustaleniu jaka sekwencja zostanie poddana amplifikacji (pamiętaj – by
odnaleźć na sekwencji starter nici minus, należy zamienić G ◄►C ; A ◄► T oraz
odczytywać jego sekwencję od końca!), przy wykorzystaniu programu NEBcutter2
dostępnego na stronie http://nc2.neb.com/NEBcutter2/ określ:
a) Zawartość procentową par GC oraz AT w produkcie PCR
b) Czy produkt może być przecięty na dwa fragmenty przez poniższe enzymy, podaj
miejsca ewentualnego cięcia oraz czy powstają końce tępe czy lepkie:
1
- BpuEI
- DraI
- CviQI
c) Jakie enzymy potną produkt PCR na dwie, trzy lub cztery równe lub prawie równe
części?
d) Jaka jest ilość enzymów niezdolnych do przecięcia produktu PCR?
Zadanie 2
CRISPRs Web Browser (http://crispr.u-psud.fr/) to zbiór narzędzi służących do pracy
nad sekwencjam CRISPR, czyli „zgrupowanymi, regularnie przerywanymi, krótkimi
powtórzeniami palindromicznymi” (z ang. Clustered Regularly Interspaced Short
Palindromic Repeats). W 1987 roku zidentyfikowano je po raz pierwszy w genomie
Escherichia coli. Uznaje się, że system CRISPR jest naturalnym, powszechnie
występującym mechanizmem obrony prokariotów (bakterii i archeonów) przed np.
fagami, plazmidami. Na jego podstawie opracowano system CRISPR-Cas9
wykorzystywany jako rewolucyjna metoda w inżynierii genetycznej.
a) Z menu po lewej stronie wybierz „CRISPR database”. Odpowiedz na pytania:
ile genomów bakteryjnych zostało przeanalizowanych? Ile spośród nich
zawiera sekwencje CRISPR? Porównaj znalezione informacje z domeną
archeonów.
b) Na podstronie z podpunktu a znajduje się lista różnych gatunków bakterii,
różnych szczepów. Krótko przeanalizuj listę. Czy wszystkie bakterie posiadają
sekwencje CRISPR? Uzasadnij odpowiedź – określ co wynika z takiej sytuacji.
Czy dostrzegasz podobieństwo w liczbie tych sekwencji między rożnymi
szczepami danego gatunku? Czy przy obecnym stanie wiedzy można z
całkowitą pewnością można określić liczbę tych sekwencji w danym szczepie?
c) CRISPRFinder to narzędzie internetowe pozwalające na wyszukiwanie
sekwencji CRISPR w genomach. Pobierz z bazy Nucleotide w NCBI w
formacie FASTA sekwencję o ID BA000007.2. Korzystając z narzędzia
CRISPRFinder przeanalizuj pobraną sekwencję. Ile potencjalnych sekwencji
CRISPR znajduje się w tym genomie? Na stronie wynikowej możesz zobaczyć
na schemacie rozmieszczenie tychże względem siebie. Wykonaj podobną
analizę dla sekwencji o ID AL590842.1.
d) Korzystając z narzędzia CRISPRCompar porównaj oba genomy (należy
wyszukać określone organizmy z listy). Zinterpretuj wyniki.
e) Na podstawie podpunktu d wykonaj to samo polecenie dla dwóch szczepów
E. Coli: 55989 i APEC O78 Za pomocą przycisku Compare Spacers -> Find
CRISPRs -> continue dokonaj dokładniejszej analizy tych sekwencji. Jakie
informacje możemy uzyskać dzięki temu narzędziu?
Zadanie 3
Baza danych OMIM
1) Wejdź na stronę NCBI i analizując listę zasobów (resource list) odszukaj bazę
danych OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man).
2) Rozpoczynając pracę w wyżej wymienionej bazie danych (naciśnij łącze
„getting started“), dowiedz się co to za baza danych i jakie informacje możesz
w niej znaleźć.
3) Odszukaj w bazie danych OMIM choroby zwanej pląsawica Huntingtona
wpisując w okno wyszukiwania numer 143100.
4) Podaj podstawowe informacje na temat pląsawicy Huntingota. Mutacja w
genie kodującym pewne białko powoduje tą chorobę. Jak nazywa się to
białko? Podaj lokalizację chromosomową genu kodującego to białko.
Odszukaj osobny rekord opisujący wyłącznie to białko w bazie danych OMIM.
2
Następnie analizując strukturę genu kodującego to białko opisz jego długość,
liczbę eksonów oraz ich średnią długość.
5) W zakładkach znajdujących się po prawej stronie odszukaj link do bazy
danych UniProt, gdzie możemy znaleźć szczegółowe informacje dotyczące
białka, którego mutacja powoduje pląsawicę Huntingtona, w tym jego
dokładną sekwencję. Z ilu aminokwasów się ona składa i jaka jest średnia
masa tego białka?
3