Glimmer

2011-11-14
 Narzędzia ułatwiające identyfikację właściwych genów
GLIMMER
TaxPlot
 Narzędzia ułatwiające amplifikację tych genów
– techniki PCR
Primer3, Primer3plus
PrimerBLAST
Reverse Complement
 Narzędzia ułatwiające weryfikację produktów:
NEBcutter
2
Glimmer
– umożliwia znalezienie regionów kodujących
3
1
2011-11-14
Glimmer = Gene Locator and Interpolated Markov Modeler
System do znajdowania genów w DNA mikroorganizmów
szczególnie genomów bakterii, archeowców i wirusów
Stosowanie tego programu obejmuje 2 etapy:
[1] Trening algorytmu na genomie konkretnego organizmu
(możliwie najbliżej spokrewnionego z gospodarzem,
z którego pochodzi identyfikowane DNA).
Na tym etapie program identyfikuje ORFs na zestawie
treningowym, czasem wykonuje też dopasowania
z bazami danych i na podstawie wyników modyfikuje
model.
[2] Uruchomienie nauczonego (udoskonalonego)
algorytmu na nieznanej sekwencji.
4
Glimmer jest dostępny z @NCBI
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/MICROBES/glimmer_3.cgi
5
2
2011-11-14
Wyniki Glimmer
ORFs
6
TaxPlot
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/taxik2.cgi

Three-way view of genome similarities – narzędzie do
porównywania 3 genomów na podstawie sekwencji
białkowych, które one kodują.

Aby użyć TaxPlot, należy najpierw wybrać genom
zapytania, a następnie wybrać kolejne dwa genomy do
których będzie porównywany. Wstępnie wyliczone wyniki
BLAST są następnie wykorzystywane do wykreślenia
wykresu, na którym punkty oznaczają każde
przewidywane białko w genomie odniesienia, w oparciu
o najlepsze dopasowanie z białkami w każdym z dwóch
porównywanych genomów.
7
3
2011-11-14
TaxPlot
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/taxik2.cgi
8
TaxPlot – interpretacja wyników
9
4
2011-11-14
TaxPlot
10
TaxPlot – wyniki
Numer dostępowy, opis i przekierowanie do BLASTp
i NCBI Protein:
- BLAST link
11
5
2011-11-14
Przydatne linki z rekordów sekwencyjnych
12
łańcuchowa reakcja polimerazy
(polymerase chain reaction)

W połowie lat 80 opracowano technikę,
służącą do amplifikacji dowolnej sekwencji
DNA z użyciem pary oligonukleotydowych
starterów oraz termostabilnej polimerazy
DNA.

PCR przeprowadza się całkowicie in vitro,
bez wykorzystania komórek.
13
6
2011-11-14
Matryca DNA lub RNA
 Startery
 Bufor
 Substraty - dNTP
 Jony Mg2+
 Termostabilna polimeraza DNA

14
PCR – reakcja łańcuchowa polimerazy
matryca
denaturacja
hybrydyzacja
wydłużanie
Forward primer = lewy starter
Backward (reverse) primer = prawy starter
15
7
2011-11-14
PCR – przebieg każdego cyklu
denaturacja
wydłużanie
hybrydyzacja
16
Denaturacja DNA pod wpływem temperatury
Tm – temperatura
topnienia,
to temperatura w której
połowa cząsteczek DNA
jest w formie
jednoniciowej
(rozdysocjowanej)
Tm jest parametrem
definiującym termiczną
stabilność DNA
17
8
2011-11-14
PCR i Tm
Obydwa startery powinny hybrydyzować w podobnej temp (Tm < 5 C)
w temp < Tm starterów
18
Zasady projektowania starterów
1.
Długość startera: typowo 18-22 nt (im dłuższe tym bardziej
specyficzne)
2.
Specyficzne = komplementarne tylko do 1 matrycy w danym
organizmie
3.
Długość amplikonu (produktu): zależy od celu eksperymentu
4.
Temperatura topnienia (mięknięcia) starterów,
zwykle Tm= 52-58°C dają najlepsze wyniki, ale ten zakres może
być dużo szerszy
5.
Zawartość GC: najlepiej 40-60%, związany z Tm
6.
Tm pary starterów: różnice w Tm starterów większa niż 5°C
może prowadzić do problemów z amplifikacją
7.
Temperatura hybrydyzacji (annealing) podczas PCR zwykle
jest ustawiana o kilka stopni poniżej Tm starterów:
TH = Tm- 2°C
19
9
2011-11-14
Rodzaje reakcji PCR:

RT-PCR (Reverse Transcriptase) – modyfikacja polegająca na użyciu mRNA jako
matrycy. Synteza DNA na matrycy mRNA odbywa się przy użyciu odwrotnej
transkryptazy (RT). Następnie DNA namnaża się za pomocą zwykłej reakcji PCR.
Metoda ta pozwala na amplifikację wyłącznie sekwencji zawartej w dojrzałym
mRNA, a więc tylko egzonów. Powstały DNA określany jest jako cDNA –
komplementarny DNA.

Real time PCR – do środowiska reakcji wprowadzane są znakowane (np.
barwnikami fluorescencyjnymi) nukleotydy bądź sondy łączące się z DNA, które
pozwalają na podstawie odczytów w kolejnych cyklach określić ilość matrycy użytej
do reakcji, jak również śledzić ilość powstającego produktu.

nested-PCR – stosowany gdy dysponuje się niewielką ilością matryc DNA.
Jego istotą jest synteza kilku długich fragmentów zawierających interesujący nas
fragment na początku reakcji (dzięki czemu powielamy nasz materiał badawczy),
a dopiero w następnym kroku dodajemy startery okalające nasz badany odcinek.
20
Rodzaje reakcji PCR:

RAPD-PCR (Losowa Amplifikacja Polimorficznego DNA) – metoda polega na użyciu
jednego, krótkiego, losowego startera. Po zakończeniu reakcji i
analizie elektroforetycznej otrzymuje się różnej długości prążki będące cechą
charakterystyczną danego osobnika (fingerprinting

REP-PCR (Repetitive sequence–based PCR) – jest to PCR z wykorzystaniem
sekwencji repetytywnych. Metoda polega na wykorzystaniu w reakcji PCR starterów
komplementarnych do sekwencji repetytywnych występujących w genomie.
Produkty reakcji rozdzielane są na drodze elektroforezy w żelu agarozowym,
tworząc swoisty wzór prążków, charakterystyczny dla danego szczepu bakterii.

PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) – metoda
wykorzystująca enzymy restrykcyjne w celu identyfikacji mutacji w obrębie miejsc
cięcia danego enzymu. Pozwala też na wykrycie mutacji prowadzących do
powstania nowych miejsc cięcia.
21
10
2011-11-14
Multiplex PCR

Pozwala na amplifikację różnych genów w jednej
reakcji PCR

Używamy różnych par starterów

Zastosowanie:
 Identyfikacja patogenów
 Analiza mutacji
 Analiza delecji
 Detekcja RNA
 Genotypowanie SNP
22
23
11
2011-11-14
Darmowe narzędzia do projektowania starterów:

Primer3
http://frodo.wi.mit.edu/primer3/

Primer3plus
http://www.bioinformatics.nl/cgibin/primer3plus/primer3plus.cgi

primerBLAST
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
24
Primer3
http://primer3.sourceforge.net/
25
12
2011-11-14
26
27
13
2011-11-14
28
29
14
2011-11-14
30
31
15
2011-11-14
PrimerBLAST
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
32
PrimerBLAST
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
33
16
2011-11-14
Jeżeli jako matrycę poda się numer
dostępowy do baz NCBI organizm jest
rozpoznawany automatycznie, w pozostałych
przypadkach warto podać organizm źródłowy,
aby ograniczyć poszukiwania.
34
Wskazówki:
* Primer-BLAST was developed at NCBI to help users make primers that are specific to the input PCR
template. It uses Primer3 to design PCR primers and then submits them to BLAST search against userselected database. The blast results are then automatically analyzed to avoid primer pairs (all combinations
including forward-reverse primer pair, forward-forward as well as reverse-reverse pairs) that can cause
amplification of targets other than the input template.
35
17
2011-11-14
36
37
18
2011-11-14
Reverse Complement
http://www.bioinformatics.org/
sms/rev_comp.html
38
Enzymy restrykcyjne: NEBcutter
NEB cutter – bardzo przydatne narzędzie dostępne online tool do
znajdowania miejsc restrykcyjnych, zawiera także zbiór sekwencji
standardowych (np. popularnych wektorów jak pUC19).
39
19
2011-11-14
40
41
20