ĆWICZENIE IV Wykaz zagadnień na ćwiczenia z przedmiotu

ĆWICZENIE IV
Wykaz zagadnień na ćwiczenia z przedmiotu
Biologia molekularna z elementami diagnostyki
molekularnej
dla studentów II roku kierunku: biotechnologia
medyczna
20.03-24.03.2017
TEMAT: PCR i RT-PCR. Projektowanie starterów, wyznaczanie sekwencji
nukleotydów w amplimerach. RT-PCR - przygotowanie mieszaniny
reakcyjnej, planowanie analizy techniką RT-PCR
Prowadzący: mgr Aleksandra Skubis
Cel: Nauka projektowania starterów oraz wyznaczania sekwencji nt w amplimerach.
Zapoznanie studenta z zasadami projektowania reakcji łańcuchowej polimerazy oraz
zasadami przygotowania mieszaniny reakcyjnej i projektowania profilu termicznego
reakcji.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Omówienie i interpretacja analizy spektrofotometrycznej DNA.
Wprowadzenie do techniki PCR i RT-PCR.
Analiza etapów reakcji i profilu termicznego.
Zastosowanie metody PCR i RT-PCR w praktyce laboratoryjnej
Zasady projektowania starterów.
Projektowanie starterów komplementarnych do wariantów sekwencji wzorcowej mRNA
a) wyszukiwanie sekwencji wzorcowej
b) projektowanie starterów
c) weryfikacja komplementarności sekwencji starterów względem sekwencji wzorcowej
d) charakterystyka starterów i wyznaczanie Tm – metody obliczeń.
7.
Charakterystyka i zasady przygotowania starterów do reakcji RT-PCR
8.
Protokół przygotowania mieszaniny reakcyjnej RT-PCR z wykorzystaniem firmowego zestawu
odczynników.
9.
Przygotowanie matrycy do optymalizacji reakcji oraz do analizy RT-PCR.
10. Powtórzenia techniczne i biologiczne.
11. Kontrole pozytywne i negatywne reakcji RT-PCR.
12. Planowanie lokalizacji próbek badanych i kontrolnych w powtórzeniach technicznych oraz kontroli
pozytywnych i negatywnych na płytce do amplifikacji.
13. Przygotowanie protokołu mieszaniny reakcyjnej do RT-PCR – obliczenia.
14. Profil termiczny reakcji – planowanie protokołu z uwzględnieniem Tm zaprojektowanych starterów.
15. Zasady obowiązujące podczas pracy pod komorą laminarną.
Piśmiennictwo:
1.
2.
3.
4.
Słomski R. Analiza DNA. Teoria i praktyka. Wydawnictwo Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu, 2008; str.131144,
Gola J, Mazurek U, Raczek E. Analiza DNA w medycynie sądowej, wydanie I. Katowice 2012, str. 52-60.
Magdalena Kotowska1, Jolanta Zakrzewska-Czerwińska. Kurs szybkiego czytania DNA – nowoczesne techniki
sekwencjonowania Biotechnologia Biotechnologia 2010 4 (91) 24–38
Krystian Bączkowski, Paweł Mackiewicz, Maria Kowalczuk, Joanna Banaszak, Stanisław Cebrat. Od sekwencji do
funkcji – poszukiwanie genów i ich adnotacje Biotechnologia 3 (70) 22–44 2005