PCR – łańcuchowa reakcja polimerazy technika amplifikacji
advertisement
Powodzenie reakcji PCR wymaga właściwego doboru szeregu parametrów: •dobór warunków samej reakcji PCR (temperatury, czas trwania cykli, ilości cykli itp.) •dobór odpowiednich starterów do reakcji amplifikacji •dobór właściwych ilości składników mieszaniny reakcyjnej tj.: stężenia dNTP, polimerazy, starterów, magnezu Warunki temperaturowe reakcji Denaturacja •Temperatura i czas trwania etapu denaturacji zależy od rodzaju matrycowego DNA używanego do reakcji •wstępna denaturacja - ogrzewanie DNA przez okres 3-5 min w temp. 94-96C jest wystarczające do denaturacji genomowego DNA •opcjonalnie etapy denaturacji w kolejnych cyklach mogą być krótsze i przebiegać w niższej temperaturze Temperatura etapu przyłączania - hybrydyzacji (annealingu) starterów •jest najważniejszym czynnikiem wpływającym na skuteczność i specyficzność reakcji PCR •czas trwania tego etapu jest zależny od wielkości starterów, ale zwykle nie przekracza 1 min •temperatura przyłączania starterów powinna być o 5C niższa niż obliczona temperatura topnienia starterów (Tm). Zbyt niska temperatura powoduje, że startery przyłączają się w niespecyficznych miejscach (na zasadzie niepełnej komplementarności Istnieje wiele wzorów na obliczenie temperatury topnienia starterów. Do najprostszych, a zarazem najczęściej używanych należy wzór: Tm = [4(G + C) + 2(A + T)] (C) Temperatura przyłączania starterów musi być dobrana doświadczalnie – gradientowy PCR W praktyce ilość startera, matrycowego DNA, stężenie soli i innych związków obecnych w mieszaninie reakcyjnej wpływa na temperaturę przyłączania startera, która bywa czasami wyższa o kilka stopni od obliczonej temperatury topnienia. Dlatego też temperaturę przyłączania starterów najlepiej zoptymalizować przygotowując szereg reakcji PCR z różnymi temperaturami annealingu primerów. Temperatura i czas trwania wydłużania - elongacji startera •zależy od używanej polimerazy - zwykle optymalna temperatura wynosi 72-75C (szybkość przyłączania nowych nukleotydów 100 nt/s) •przyjmuje się jednak, że do syntezy fragmentów o wielkości 1 kpz wymagany czas elongacji wynosi 1 min. Temperatura elongacji startera c. d. •obniżenie temperatury elongacji wpływa znacznie na szybkość syntezy np. już przy 70C ilość wstawianych nukleotydów wynosi ok. 60 nt/s. •obniżenie temperatury elongacji kosztem wydłużenia czasu jej trwania jest korzystne np. wtedy, gdy wymagana jest większa dokładność w syntezie nowej nici np. w reakcji cyklicznego sekwencjonowania lub wówczas gdy amplifikowany fragment będzie klonowany do wektorów ekspresyjnych. W takich przypadkach stosowane są temperatury 6068C i wydłużamy czas elongacji. •Przy wysokiej temperaturze przyłączania starterów możliwe jest ograniczenie etapów reakcji PCR do denaturacji i wspólnego etapu przyłączania i wydłużania starterów. Jest to tzw. dwustopniowy PCR Ilość cykli w reakcji PCR •wynosi od 20 do 50 i zależy głównie od początkowej ilości matrycowego DNA. Dla małej ilości docelowego DNA (ok. 50 cząsteczek) sugeruje się 40- 50 cykli •teoretyczna wydajność reakcji po “n” cyklach wynosi 2n dwuniciowych, specyficznych cząsteczek DNA •rzeczywista wydajność jest niższa (mniejsza wydajność reakcji np. przez spadek ilości dNTP, zmniejszenie aktywności polimerazy). Składniki reakcji PCR •matrycowe DNA •startery •termostabilna polimeraza DNA •odpowiedni bufor reakcyjny •jony magnezu •mieszanina czterech dezoksyrybonukleotydów (dNTP) Startery •długość primerów powinna wynosić około 20-30 zasad, a temp. ich topnienia, która zależy od rodzaju i ilości nukleotydów od 45-65C •ze względu na wydajność syntezy i stabilność oligonukleotydów, powinno się unikać starterów o długości powyżej 40 nukleotydów •startery mogą zawierać zmodyfikowane nukleotydy, najczęstsze modyfikacje to: znakowanie fluorochromami, biotyną, digoksgeniną czy wbudowywanie tionukleotydów •jeśli amplifikowane produkty mają wielkość kilkuset pz startery mogą być nieco krótsze (16-18 nt), dla fragmentów rzędu kilku kpz startery powinny być dłuższe (24 i więcej nt) Parametry dobrego startera •powinien być wysoko specyficzny dla danej sekwencji Przy amplifikacji z użyciem całkowitego DNA nietrudno sobie wyobrazić, że starter przyłączy się tylko do jednego miejsca. Prawdopodobieństwo wystąpienia dwóch identycznych 20 nt starterów wynosi 420 czyli 1099511627776. Oznacza to, że sekwencja danego startera występuje raz na 1012 nukleotydów. Ze względu na wielkość genomów teoretycznie niemożliwe jest występowanie dwóch takich starterów w genomie. •obecność na 3’ końcu startera nieunikalnych sekwencji o długości 6-7 nt objawia się występowaniem niespecyficznych produktów w reakcji PCR. Pracując z DNA ssaków trzeba zawsze sprawdzać czy projektowany starter nie wykazuje homologii z sekwencjami powtórzonymi typu Alu lub innymi sekwencjami repetetywnymi. Należy również unikać homooligomerów (jak – AAAAAA-) i dwunukleotydowych powtórzeń typu np. –ATATAT-. Primery c. d. starter powinien zawierać około 50% par GC. Ilość GC wpływa na temperaturę topnienia starterów, która nie może być większa niż optymalna temperatura działania polimerazy • wymóg co do proporcji GC/AT nie jest bezwarunkowy, gdyż np. dla genomów o dużej zawartości par GC, czy miejsc bogatych w AT niemożliwe jest jego spełnienie • przyjmuje się że startery powinny zawierać ilość GC/AT podobną lub wyższą niż amplifikowana matryca •nie powinny tworzyć struktur typu szpilki do włosów •nie powinny zawierać w części 3’ końcowej sekwencji komplementarnych do samych siebie oraz do drugiego startera •odległość między starterami w amplifikowanym DNA powinna wynosić od 0.1 do kilku kpz, ponieważ... •Większość „standardowych” polimeraz używanych w reakcji PCR wydajnie amplifikuje fragmenty do kilku tysięcy nukleotydów. •Amplifikacja dłuższych fragmentów wymaga użycia specjalnie przystosowanych polimeraz lub ich mieszanin, a także specyficznych warunków amplifikacji. •robocze stężenie każdego z primerów w mieszaninie reakcyjnej wynosi od 0,2 - 0,4 M i stanowi stosunku do ilości moli matrycy! molowy nadmiar w •stężenie 1M odpowiada ilości 1pmola startera w 1l roztworu Bufor reakcyjny •bufor reakcji PCR jest specyficzny dla danej polimerazy i zwykle jest dostarczany razem z polimerazą •stabilizuje pH mieszaniny reakcyjnej •w buforze obecne są również jednowartościowe jony w postaci KCl, ich standardowe stężenie wynosi ok. 50mM i umożliwia amplifikację fragmentów o wielkości powyżej 500pz. Większe stężenie soli (70100mM) poprawia amplifikację fragmentów poniżej 500pz Jony dwuwartościowe •wszystkie polimerazy wymagają do działania dwuwartościowych kationów, zwykle są to jony Mg+2, ale niektóre polimerazy działają również po dodaniu jonów Mn+2 •ilość cząsteczek Mg+2 musi przewyższać ilość grup fosforanowych obecnych w mieszaninie reakcyjnej ponieważ zarówno wolne nukleotydy jak i startery wiążą jony Mg+2 •końcowe stężenie Mg+2 wynosi zwykle od 0,5 do 5 mM Deoksynukleotydy (dNTP) •stosowany mix dNTP powinien zawierać nukleotydów dATP, dTTP, dCTP i dGTP równe ilości czterech •końcowe stężenie poszczególnych nukleotydów w mieszaninie reakcyjnej wynosi zwykle od 200 do 250M (w objętości 50l jest to ilość dNTP wystarczająca do syntezy ok. 6-6,5 g DNA) •Wysokie stężenie dNTP (>4 mM) hamuje reakcję PCR prawdopodobnie poprzez wiązanie jonów Mg+2. •Przy amplifikacji krótkich fragmentów DNA (do 1 kpz) można używać mniejszych ilości nukleotydów (0,5 pM-20 M) Czułość reakcji PCR •ilość matrycowego DNA potrzebna do PCR jest stosunkowo mała (teoretycznie wystarczy jedna cząsteczka DNA) •Jeśli to możliwe końcowe stężenie DNA w próbce powinno być rzędu ng. •Ilość matrycy potrzebnej do wydajnej amplifikacji zależy od jej złożoności. Np. w 4kb plazmid niosącym 1 kb wstawkę interesujący nas „target” stanowi 25%. Dla porównania 1 kb „target” w genomie ludzkim (3.3 × 109bp) stanowi ok. 0.00003%. A zatem dla utrzymania tej samej ilości docelowego DNA matrycowego na starcie reakcji PCR należy użyć 1,000,000razy więcej ludzkiego genomowego DNA niż plazmidu 1μg of 1kb dsDNA = 9.12 × 1011 molecules 1μg of pGEM® Vector DNA = 2.85 × 1011 molecules 1μg of lambda DNA = 1.9 × 1010 molecules 1μg of E. coli genomic DNA = 2 × 108 molecules 1μg of human genomic DNA = 3.04 × 105 molecules •Mała ilość matrycy – mała wydajność amplifikacji, zbyt duża ilość matrycy – niespecyficzna amplifikacja. Unikanie zanieczyszczeń w reakcji PCR •Główną zasadą jaka powinna być spełniona to fizyczne rozdzielenie etapów procedury przygotowania próbki i reakcji PCR •Zestaw plastików (końcówki pipet, próbówki) pipety automatyczne powinny być używane tylko do określonego przeznaczenia (izolacja lub PCR)
