Zastosowanie metody RAPD do różnicowania szczepów

Zastosowanie metody RAPD do różnicowania szczepów bakteryjnych
Wstęp teoretyczny
Technika RAPD (ang. Random Amplification of Polymorphic DNA) opiera się na
prostej
reakcji
PCR,
przeprowadzanej
na
genomowym
DNA
drobnoustrojów
z
zastosowaniem jednego startera, bądź kombinacji dwóch lub wielu starterów w zależności od
potencjału różnicującego metody. Startery te zapoczątkowują amplifikację fragmentów DNA
w różnych regionach genomu jednocześnie. Do reakcji PCR wybiera się starter o dowolnej,
często losowej sekwencji, o długości od 10 do 20 pz. Starter przyłącza się do obu nici
matrycowego DNA.
Warunkiem zajścia prawidłowej, wydajnej amplifikacji fragmentów DNA konieczne
jest, aby (rys.1):
 startery dołączone do obu nici były względem siebie w odpowiedniej orientacji
 odległość pomiędzy starterami nie przekraczała 1000 – 1500 pz ze względu na
procesywność stosowanych polimeraz DNA oraz możliwości rozdziału w
6-8% żelu poliakryloamidowym.
Rys. 1 Schemat techniki RAPD. Amplifikacji ulega fragment ograniczony starterami przyłączonymi w miejscu 3 i 4.
Pomiędzy starterami przyłączonymi w miejscu 2 i 4 jest zbyt duża odległośd do wydajnej amplifikacji, natomiast startery w
miejscach 1 i 2 są przyłączone w niewłaściwej orientacji.
W metodzie RAPD reakcję PCR w kilku pierwszych cyklach (od 3 do 5) często
prowadzi się przy obniżonej temperaturze przyłączania starterów (ok. 35-40°C), aby
umożliwić hybrydyzację startera do miejsc nie w pełni komplementarnych, zwiększając w ten
sposób prawdopodobieństwo amplifikacji fragmentów DNA. W kolejnych 30 cyklach stosuje
się już wyższą (50 - 55°C) temperaturę przyłączania, właściwą dla wybranego startera,
wyznaczoną na podstawie teoretycznie obliczonej temperatury topnienia.
Uzyskane w reakcji PCR produkty rozdziela się elektroforetycznie w żelu
poliakryloamidowym uzyskując charakterystyczne dla badanego szczepu bakterii profile
prążków. Porównanie profili pozwala wyznaczyć poziom podobieństwa pomiędzy badanymi
szczepami. Ze względu na niską specyficzność przyłączania starterów do matrycowego DNA,
technikę RAPD charakteryzuje niski stopień powtarzalności.
Tabela 1
Cechy metody RAPD
Poziom
Możliwość regulacji poziomu
Specyficzność
Metoda uniwersalna, nie wymaga znajomości
sekwencji genomowego DNA, wymaga
stosowania czystych kultur bakteryjnych
Brak możliwości regulacji poziomu
specyficzności
Poziom
dyskryminacji
Wysoki, zależy jednak od długości
i sekwencji startera/ów,
Metoda bada polimorfizm długości
amplifikowanych fragmentów
Możliwość regulacji poziomu dyskryminacji
poprzez dobór ilości starterów w reakcji PCR
oraz obniżenie lub podwyższenie temperatury
przyłączania starterów
Ćwiczenie Wybór układu do różnicowania mikroorganizmów metodą RAPD
Aby różnicować szczepy bakteryjne metodą RAPD, należy w pierwszej kolejności
wybrać układ starterów do reakcji PCR, w zależności od oczekiwanego poziomu
dyskryminacji. Zadaniem każdej grupy jest przeprowadzenie analizy dla jednego gatunku
bakterii z zastosowaniem różnej kombinacji starterów. Na podstawie uzyskanych wyników
należy wybrać jeden układ, o najwyższym potencjale różnicującym.
Cel ćwiczenia
Dobór układu do różnicowania wybranych szczepów bakterii za pomocą metody
RAPD.
Materiały
 10x stężony bufor do reakcji PCR Shark, 20 mM roztwór MgCl2, 8 mM
mieszanina dNTPs
 startery 1247 (AAGAGCCCGT); 1290 (GTGGATGCGA); 400
(GCTGGCGACGTTGCGCCG); Baeza (GGTGCGGGAA); starter A08
(GTGACGTAGC); OPK 20 (GTGTCGCGAG); OP107 CAGCGACAAG,
 polimeraza DNA termostabilna Pwo [2U/µl]
 woda jałowa, agaroza, bufor 1xTEA,
 termocykler, aparat do elektroforezy poziomej, transilluminator, zimny blok,
statywy do probówek
 szczepy bakteryjne wg tabeli 1
Tabela 2
Szczepy bakteryjne
Lp
Gatunek
Oznaczenie
1
Escherichia coli
Ec 1
2
Escherichia coli
Ec 2
3
Escherichia coli
Ec 3
Wykonanie
1. Przygotować 4 probówek 0,2 ml, opisać odpowiednio 1-3 dla szczepów badanych, Kdla kontroli ujemnej.
2. W probówce 1,5 ml przygotować mieszaninę Master MIX wg tabeli 2, zawierającą
wszystkie składniki z wyjątkiem matrycy DNA, zastosować kombinację dwóch
dowolnych starterów (każda grupa inny układ), wymieszać i rozporcjować po
24µl.
Tabela 3
Skład mieszaniny reakcyjnej
Profil temperaturowo czasowy
Ilość [µl]
Skład
x1
Master
MIX
(x5)
1-3
K-
Temper
atura
[°C]
Czas [s]
Liczba
cykli
Woda1)
10 x bufor Shark
2,5
95
300
MgCl2 [20 mM]
2,5
95
30
dNTPs [8 mM]
2,5
35
30
72
60
24
24
Starter 1 [10µM]
1,0
Starter 2 [10µM]
1,0
95
30
Starter 3 [10µM]
1,0
55
30
Polimeraza Pwo
[2U/µl]
0,3
72
60
24
72
300
4
∞
DNA
1,0
Woda
Objetość całkowita
X
1,0
-
X
-
1,0
25
25
25
5
30
3. Do probówek oznaczonych od 1 do 3 dodać po 1µl genomowego DNA badanych
szczepów, do K- dodać 1µl wody.
4. Umieścić probówki w termocyklerze. Przeprowadzić reakcję PCR zgodnie z profilem
temperaturowo – czasowym, przedstawionym w tabeli 3.
5. Produkty PCR rozdzielać w 6% żelu poliakryloamidowym w buforze 1xTBE przy
napięciu ok. 170 V. Żel wybarwić i analizować w świetle UV.
Wyniki i wnioski:
1. Wklej i opisz zdjęcie przedstawiające elektroforetyczny rozdział produktów PCR,
zaznacz marker wielkości DNA, próby badane oraz kontrolę ujemną.
2. Porównaj profile elektroforetyczne produktów PCR dla badanych szczepów E.coli.
Oznacz genotypy i zapisz je w tabeli 4.
3. Wybierz najlepszy układ starterów. Przeprowadź dyskusję na temat skuteczności
metody RAPD do różnicowania badanych szczepów.
Tabela 4
Wyniki genotypowania metodą RAPD
Układ starterów
nr
Genotyp
szczep
RAPD
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Piśmiennictwo:
1.
Tyler K.D., Wang G., Tyler S.D., Johnson W.M. 1997. Factors affecting reliability and
reproducibility of amplification-based DNA fingerprinting of representative bacterial
pathogens. J. Clin. Microbiol. 35(2):339-346. Comment in: J. Clin. Microbiol. 2007.
35(11):3008-3009.
2. Caetano-Anolles G: Amplifying DNA with arbitrary oligonucleotide primers. PCR
Methods Appl 1993, 3(2):85-94.
3. Williams JG, Kubelik AR, Livak KJ, Rafalski JA, Tingey SV: DNA polymorphisms
amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res 1990,
18(22):6531-6535.
4. Caetano-Anolles G, Bassam BJ, Gresshoff PM: DNA amplification fingerprinting
using very short arbitrary oligonucleotide primers. Biotechnology (N Y) 1991,
9(6):553-557.
5. Gzyl A, Augustynowicz E: Technical aspects of random amplified polymorphic DNA
(RAPD) technique in genotyping of bacterial strains. Acta Microbiol Pol 1999,
48(3):243-259.