DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA

DIAGNOSTYKA
MOLEKULARNA
METODY MOLEKULARNE
 PCR
 Hybrydyzacja
 FISH
 Sekwencjonowanie
ŁAŃCUCHOWA REAKCJA
POLIMERAZY
Polimerase Chain Reaction (PCR)
 Pozwala na powielenie dowolnej sekwencji
DNA o długości od kilkuset do kilku tysięcy
nukleotydów
 Polega na przeprowadzeniu wielu cykli
syntezy kwasu nukleinowego
z wykorzystaniem starterów flankujących
określony odcinek DNA
IZOLACJA RNA (wirusy)
1. Przygotoanie próbek krwi, skóry,
włosów itd.
2. Dezintegracja komórek – TRIZOL,
Chloroform
3. Odwirowanie zanieczyszczeń
4. Zamrożenie RNA (- 800 C)
MECHANIZM REAKCJI
CZYNNIKI:
 Jednoniciowa matryca DNA
 Startery (primery)
 dNTP (trójfosforany deoksynukleotydów)
 Polimeraza DNA
CYKL PCR
1. Denaturacja DNA (92 - 960 C)
2. Przyłączanie starterów do
matrycy (37-720 C)
3. Polimeryzacja DNA (720 C)
DENATURACJA (> 900 C)
PRZYŁĄCZANIE STARTERÓW
(37-720 C)
WYDŁUŻANIE ŁAŃCUCHÓW
(720 C)
POWIELONA SEKWENCJA DNA
LICZBA KOPII SEKWENCJI DNA
PODCZAS REAKCJI PRC
Cykle
1
2
3
4
5
6
20
30
Liczba łańcuchów DNA
2
4
8
16
32
64
1,048,576
1,073,741,824
PROFIL TERMICZNY PCR
100
DENATURACJA
DENATURACJA
90
80
70
POLIMERYZACJA
60
50
40
30
PRZYŁĄCZANIE
STARTERÓW
20
10
0
CYKL 1
CYKL 2
METODY DIAGNOSTYCZNE
OPARTE NA PCR
 PCR
 PCR MULTIPLEKSOWY:
Równoczesna amplifikacja kilku regionów
genomu w jednej probówce stosując różne
pary starterów.
(Diagnostyka chorób genetycznych,
wykrywanie mutacji, wykrywanie
czynników zakaźnych)
 NESTED PCR:
Dodanie zestawu nowych (bardziej
swoistych) starterów po przeprowadzeniu
wstępnej reakcji PCR.
(Kontrola swoistości reakcji, stworzenie
sondy molekularnej z produktu PCR)
 KOMPETYTYWNY PCR:
Analiza ilościowa badanego fragmentu
genomu.
 PCR-RFLP
Produkt amplifikacji jest poddawany
procesowi cięcia enzymami
restrykcyjnymi, w wyniku czego otrzymuje
się fragmenty DNA różnej długości.
 RT-PCR
Właściwy PCR jest poprzedzony odwrotną
transkrypcją (przepisaniem informacji
z RNA na DNA) dzięki enzymowi:
odwrotna transkryptaza.
ODWROTNA TRANSKRYPCJA (RT-PCR)
Stała temperatura
(370 C) w czasie 30 min.
Wyizolowane
RNA
Odwrotna
transryptaza
Nukleotydy
Mieszanina
RT-PCR
Bufor
z jonami
akt.
Stabilizator
(DTT)
Nazwa i pochodzenie
enzymu
Tth
PolymeraseZ Thermus
thermophilus
MMuLV
RewerseTranskryptaseZ
Moloney Murine
Jon
aktywujący
Mn++
Uwagi
Termostabilna, z jonami Mg
wykazuje aktywność
polimerazy DNA
Mg++
najpowszechniej stosowana
odwrotna Transkryptaza
LeucemiaVirus
AMV
ReverseTranskryptaseZ
Mg++
Avian MyeloblastosisVirus
Cth Polymerase Klenow
FragmentZ
Carbohydrothermus
hydrogenoformans
Coraz powszechniej
stosowana odwrotna
Transkryptaza
Stosowana w mieszaninie z
Taq polimerazą do
Mg++
jednostopniowej reakcji
RT-PCR
 ASYMETRYCZNY PCR:
Dodanie pary starterów z których jeden zostaje
całkowicie zużyty podczas pierwszych cykli
amplifikacji DNA.
(Produkt może być sondą molekularną w reakcji
hybrydyzacji lub matrycą w reakcji
sekwencjonowania.)
 AMPLIFIKACJA ALLELOSPECYFICZNA:
Ważna jest tu komplementarność nukleotydów
przy końcach 3` primerów, ponieważ umożliwia
ona elongację DNA przez polimerazę.
(Badanie polimorfizmu alleli, punktowych
mutacji, powiązań genetycznych, wyjaśnienie
działania substancji mutagennych, wykrywanie
genów sprzężonych z chorobami, badanie
lekooporności mikroorganizmów
ANALIZA PRODUKTÓW PCR
 ELEKTROFOREZA
Elektroforeza kwasów nukleinowych
obecnie przeprowadzana jest głównie na
żelach agarozowym i akryloamidowym
oraz w tzw. płynnych (nisko
spolimeryzowanych) żelach
akryloamidowych w kapilarach.
 ELEKTROFOREZA AGAROZOWA
Produkt PCR pod wpływem napięcia
elektrycznego wędruje w żelu agarozowym.
 ELEKTROFOREZA AKRYLOAMIDOWA
Jest powszechnie, chociaż niesłusznie
uważana za bardziej precyzyjną od
agarozowej oraz (słusznie) za tańszą.
Zaletami tego podłoża są niskie koszta
oraz możliwość wybarwiania
rozdzielonych frakcji DNA poprzez
srebrzenie, które daje wyraźne, widoczne
gołym okiem i trwałe obrazy.
Wybarwianie elektroforetycznie
rozdzielonego na żelu DNA może być
przeprowadzane za pomocą bromku
etydyny lub innego, podobnego barwnika
(np. SYBR Gold, który jest o wiele czulszy
lecz znacznie droższy), natomiast w
przypadku elektroforezy kapilarnej
szczególnie popularne jest wielokolorowe
barwienie fluorescencyjne, wykorzystujące
wzbudzoną laserem fluorescencję
wbudowanych w łańcuch DNA
fluorochromów.
HYBRYDYZACJA
Wykorzystuje sondy molekularne (kwas
nukleinowy o określonej sekwencji),
będące odcinkami komplementarnymi
do szukanych fragmentów genomu.
Najważniejsze typy to:
Southern blotting - badanie DNA
Northern blotting – badanie RNA
SONDY MOLEKULARNE
SONDY MOLEKULARNE

Mikromacierz
nylonowa
(powiększenie)
4 x 5 mm

Mikromacierz
nylonowa
8 x 12 cm
 HYBRYDYZACJA in situ (FISH)
Pozwala zlokalizować sekwencję kwasu
nukleinowego w komórce lub
odpowiednim rejonie chromosomu.
Znakomita większość sond
wykorzystywanych w metodzie FISH
znakowana jest bezpośrednio
fluorochromem. Najczęściej stosowanymi
fluorochromami są fluoresceina (FITC),
rodamina, czerwień teksańska (Texas
Red) i Aqua (DEAC).

Obraz chromosomów
komórek linii raka

prostaty
Metoda M-FISH
Hybrydyzacja
in situ multipleksowa
 SEWENCJONOWANIE:
Polega na określeniu sekwencji
nukleotydów.
Metoda chemiczna – chemiczne
rozszczepianie kolejnych nukleotydów
badanego fragmentu DNA.
Metoda enzymatyczna (Sangera) –
synteza komplementarnej nici DNA
na matrycy wykorzystująca system
znakowania trójfosforanów czterech
dideoksynukleotydów fluorochromami w
czterech różnych kolorach, są 3 warianty:
1. Dye Primer Sequencing - przeprowadza się cztery
niezależne reakcje PCR z czterema porcjami primera,
każda porcja znakowana jest fluorochromem w innym
kolorze. Produkty czterech reakcji miesza się i analizuje
wspólnie.
2. Cycle Sequencing - startuje się z bardzo małą ilością
DNA, przeprowadza reakcję PCR, a po każdej denaturacji
termicznej uzyskuje się coraz dłuższy łańcuch
zakończony znakowanym nukleotydem.
3. Dye Terminator Sequencing - używa się mieszanki nie
znakowanych trójfosforanów nukleotydów i znakowanych
trójfosforanów dideoksynukleotydów. Była stosowana
przez konkurujące zespoły naukowe które z sukcesem
zakończyły sekwencjonowanie genomu człowieka.
Schemat automatycznego sekwencjonowania DNA
Starter komplementarny do matrycy DNA
3’
5’
GCCTAGGGTTTGCGCTAC
3’
CGGATCCCAAACGCGATGCAGGCATGCAATGACC
dATP
dGTP
dTTP
dCTP
5’
ddATP
ddGTP
ddTTP
ddCTP
Terminatory
znakowane
fluorescencyjnie
Wydłużanie startera przy użyciu polimerazy DNA
Rozdział produktów reakcji w
automatycznym sekwenatorze

GTCCGTACGTTACTGddG
GTCCGTACGTTACTddG
GTCCGTACGTTACddT
GTCCGTACGTTAddC
GTCCGTACGTTddA
GTCCGTACGTddT
GTCCGTACGddT
GTCCGTACddG
GTCCGTAddC
GTCCGTddA
GTCCGddT
GTCCddG
GTCddC
GTddC
GddT
ddG
-=*=-