Chemiczna modyfikacja białek - Zakład Biochemii Analitycznej
advertisement
Rozdział 6 Chemiczna modyfikacja białek 6.1. Postulat selektywnej modyfikacji reszt aminokwasowych białka Jedną z wielu wyjątkowych cech białek jest łatwość, z jaką ulegają one zmianom pod wpływem rozmaitych odczynników chemicznych. Wśród ogromnej liczby poznanych do tej pory reakcji chemicznych białek wyróŜnić moŜna w pierwszym rzędzie takie, które badano pod kątem potencjalnych zastosowań do ilościowego oznaczania samych białek lub wchodzących w ich skład aminokwasów. Zachowanie integralności cząsteczek białka nie było konieczne w tego typu zastosowaniach. Reakcje chemiczne, związane z destrukcją struktury białka, stanowią m.in. podstawy zaawansowanych technik analitycznych współczesnej chemii białek, takich jak selektywne chemiczne rozszczepianie łańcuchów polipeptydowych czy oznaczanie sekwencji aminokwasów w peptydach. Techniki te omówiono w dalszych rozdziałach niniejszej monografii. Odmienny cel przyświecał badaniom reakcji chemicznych, zachowujących zasadnicze cechy strukturalne białka: integralność wiązań peptydowych oraz naturalną (natywną) konformację łańcucha polipeptydowego. Dopiero te stosunkowo łagodne reakcje zasługują na nazwę chemicznej „modyfikacji”, gdyŜ słowo to oznacza zmianę, ale nie zniszczenie. Rozbudowana metodyka chemicznej modyfikacji białek wyrosła głównie na gruncie poszukiwań odpowiedzi na pytania typu:, „co jest szczególnego w strukturze danego białka, Ŝe ma ono taka a nie inną aktywność?”. W przypadku enzymów pytanie to zawęŜa się przede wszystkim to tzw. „centrum aktywnego”, tj. bocznych reszt aminokwasowych cząsteczki białka, zaangaŜowanych w realizację aktywności katalitycznej. Przydatne dla takich badań metody chemiczne miały zatem słuŜyć moŜliwie selektywnej modyfikacji konkretnych rodzajów reszt aminokwasowych w celu określenia ich udziału w chemicznych, fizycznych i biologicznych właściwościach białek. Stosowane po dziś dzień metody łagodnej, selektywnej modyfikacji reszt aminokwasowych białek są jednym z najuŜyteczniejszych podejść eksperymentalnych w badaniach struktury i funkcji tych biopolimerów. 1 6.2. ZróŜnicowana reaktywność reszt aminokwasowych Reaktywność jednej substancji względem drugiej zaleŜy od właściwości kaŜdej z nich oraz od otoczenia, w którym zostały one umieszczone. Reaktywność jakiejś grupy chemicznej białka z konkretnym odczynnikiem zaleŜy m.in. od wpływu otoczenia na te grupę oraz od zdolności odczynnika do wejścia w to otoczenie. PoniewaŜ białka są stosunkowo duŜe, wiele z tworzących je reszt aminokwasów jest zasłoniętych przed rozpuszczalnikiem i dlatego nie reagują one z rozpuszczonym odczynnikiem modyfikującym. Z drugiej strony, pewne reszty, być moŜe właśnie z powodu obecności w centrum katalitycznym, wykazują nietypowo wysoką reaktywność. Określenie względnej reaktywności wobec rozmaitych odczynników moŜe pomóc w zdefiniowaniu połoŜenia róŜnych reszt w trójwymiarowej strukturze białka. Takie informacje są niezwykle cenne dla interpretacji wyników badań metodami rentgenografii strukturalnej, natomiast jeśli struktura krystalograficzna białka nie jest znana – stanowią źródło informacji o strukturze trzeciorzędowej. 6.2.1. Specyficzność bocznych reszt aminokwasowych RóŜne właściwości chemiczne reszt aminokwasowych stanowią podstawę ich zróŜnicowanej reaktywności (patrz dalsze podrozdziały). Większość odczynników do modyfikacji białek reaguje z więcej niŜ jednym rodzajem reszty. Brak zadowalającej specyficzności ogranicza uŜyteczność szeregu odczynników. Wiele najreaktywniejszych łańcuchów bocznych moŜe występować w róŜnych formach protonacji w zaleŜności od warunków. PoniewaŜ formy te mają zasadniczo róŜne własności chemiczne, pH ma istotny wpływ na przebieg modyfikacji chemicznej tych grup. Reaktywność z wybranym odczynnikiem jest zwykle zdeterminowana przez to, czy w danych warunkach grupa jest sprotonowana czy nie. Przykładowo, anion tyrozyny reaguje szybko z jodem, ale niezjonizowana reszta - bardzo powoli lub wcale. Faktycznie w przypadku większości grup najreaktywniejsza jest najbardziej nukleofilowa forma o najniŜszym stopniu sprotonowania. I tak, przyłączenie protonu do grupy aminowej lub imidazolowej powoduje utratę ich reaktywności względem większości odczynników. Kwas jodooctowy (I-CH2-COOH), w zaleŜności do warunków, moŜe reagować w róŜnym stopniu z grupami sulfhydrylowymi, aminowymi, imidazolowymi i metionylowymi. Niemal we wszelkich warunkach prędkość reakcji z grupami sulfhydrylowymi jest o wiele większa niŜ z wszystkimi pozostałymi z wymienionych grup, a z kolei prędkość reakcji z tymi ostatnimi jest zróŜnicowana, zwłaszcza w zaleŜności do pH. Wykorzystując róŜnice w prędkościach reakcji róŜnych grup w róŜnych warunkach, moŜna osiągnąć wysoką 2 selektywność, niemal dokładnie taką, jaka jest w danej chwili potrzebna. ChociaŜ pH ma ogromy wpływ na reaktywność grup aminowych i imidazolowych, niemal nie wpływa na reaktywność tioeterowej grupy metioniny. W niskim pH, gdy dwa pierwsze rodzaje grup są sprotonowane, a zatem niereaktywne, moŜna więc selektywnie zmodyfikować metioninę. W środowisku obojętnym, gdzie grupy aminowe są sprotonowane ale imidazolowe nie, ta ostatnia staje się najreaktywniejsza. W jeszcze wyŜszym pH najbardziej reaktywne stają się wreszcie grupy aminowe. Zmiany reaktywności pod wpływem pH są najwygodniejszym sposobem kontrolowania przebiegu wielu typów modyfikacji białek. Niestety, uŜyteczność tego podejścia ograniczona jest przez stosunkowo wąski zakres pH, w którym mieszczą się wartości pKa grup, występujących w białkach (Tabela 6-1). Tabela 6-1: Typowe wartości pKa jonizowalnych grup, występujących w białkach. -----------------------------------------------------------------------------------------------------------Grupa Reszta aminokwasowa Spodziewana wartość pK -----------------------------------------------------------------------------------------------------------α-COOH koniec karboksylowy 2.1 – 2.4 β-COOH kwas asparaginowy 3.7 – 4.0 γ-COOH kwas glutaminowy 4.2 – 4.5 imidazoliowa histydyna 6.7 – 7.1 α-NH3+ koniec aminowy 7.6 – 8.0 - SH cysteina 8.8 – 9.1 ε-NH3+ lizyna 9.3 – 9.5 fenolowa tyrozyna 9.7 – 10.1 guanidyniowa arginina >12 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 6.2.2. Grupy „wyeksponowane” i „ukryte” Względne połoŜenie róŜnych grup w cząsteczce białka ma oczywiste znaczenie dla fizycznych, chemicznych i biologicznych własności tych biopolimerów. Reszty we wnętrzu makrocząsteczki oddziałują słabiej ze składnikami roztworu niŜ reszty powierzchniowe. ChociaŜ, rzecz jasna, najlepszą metodą określenia lokacji kaŜdej reszty jest rentgenografia strukturalna, częściowych informacji na ten temat dostarczają teŜ badania względnej reaktywności tych reszt względem rozmaitych odczynników chemicznych. MoŜna się 3 spodziewać, Ŝe reszty powierzchniowe mają reaktywność taką, jak te same grupy w prostym peptydzie, natomiast reszty „zagrzebane” powinny wykazywać reaktywność obniŜoną. ChociaŜ wiele dodatkowych czynników moŜe powodować odchylenia od tej prostej reguły, wyniki uzyskane metodami chemicznymi na ogół są zgodne z przewidywaniami płynącymi z analiz rentgenostrukturalnych. Podział na reszty „wyeksponowane” i „ukryte” zastosowano najwcześniej w odniesieniu do reszt tryptofanu i tyrozyny. Są one chromoforami, których własności spektralne zaleŜą od polarności otoczenia. Skądinąd wiadomo, Ŝe wnętrze cząsteczki białka wypełnione jest grupami o charakterze hydrofobowym. Z rozmaitych badań spektroskopowych wynika, Ŝe znaczna część chromoforów tyrozyny i tryptofanu występuje w otoczeniu hydrofobowym i jest trudno dostępna dla hydrofilowego rozpuszczalnika. Istnieje jednak równieŜ frakcja reszt wyeksponowanych, których widma, o cechach wskazujących na otoczenie hydrofilowe, ulegają perturbacji pod wpływem dodawanych do roztworu domieszek rozpuszczalników organicznych. Chemiczne metody określania „dostępności” reszt tyrozyny i tryptofanu, oparte na badaniach względnej podatności na działanie róŜnych odczynników modyfikujących (np. N-acetyloimidazolu lub tetranitrometanu dla tyrozyny czy N-bromobursztynoimidu dla tryptofanu) prowadzą zwykle do wniosków zgodnych z danymi, uzyskanymi metodami fizykochemicznymi. Liczba i natura reszt „ukrytych” jest bardzo zmienna w róŜnych białkach. Większe i stosunkowo sztywne białka zwykle mają większą proporcję takich reszt, w porównaniu z białkami małymi i luźno ufałdowanymi. Ukryte reszty moŜna wyeksponować, działając na białka czynnikami denaturującymi takimi jak mocznik, chlorowodorek guanidyny czy bufory o skrajnych wartościach pH. Tym samym frakcję reszt ukrytych określić moŜna, porównując wyniki modyfikacji danej reszty w białku natywnym oraz białku zdenaturowanym. Proporcja reaktywnych, tj. „wyeksponowanych” reszt jest często zmienna w zaleŜności od rodzaju uŜytego odczynnika. Uwarunkowane to jest rozmaitą zdolnością odczynników do penetrowania głębszych, bardziej hydrofobowych regionów cząsteczki białka. ChociaŜ koncepcja reszt „ukrytych” i „wyeksponowanych” pierwotnie odnosiła się tylko do reszt hydrofobowych, została później rozciągnięta na inne typy reszt. Tym samym obniŜona reaktywność reszt konkretnego typu jest często automatycznie interpretowana jako wynik ukrycia reszty we wnętrzu makrocząsteczki. Zmiany w liczbie reaktywnych grup, rejestrowane w trakcie tworzenia rozmaitych dwucząsteczkowych kompleksów, wykorzystywane były czasem do oceny wielkości powierzchni oddziaływania lub zakresu zmian konformacyjnych towarzyszących wiązaniu. Warianty tych procedur znalazły szerokie 4 zastosowanie do identyfikacji reszt aminokwasowych, występujących w centrach aktywnych, co w sposób bardziej szczegółowy omawiane jest w kolejnym podrozdziale. 6.3. Modyfikacja reszt aminokwasowych, istotnych dla aktywności białka 6.3.1. „Miejsca aktywne” i „grupy istotne” Badanie zaleŜności własności białka od konkretnych reszt aminokwasowych stanowi aktualnie najwaŜniejszą dziedzinę zastosowań chemicznej modyfikacji tych biopolimerów. Słabym punktem tych metod jest niemoŜność rozróŜnienia reszt absolutnie niezbędnych dla aktywności od takich, które są po prostu obecne w centrum aktywnym, czy teŜ przylegają do tego obszaru albo w jakiś inny sposób są pośrednio powiązane z badanym rodzajem aktywności. Jednak i tak aktualne koncepcje centrów aktywnych na ogół nie definiują precyzyjnie ich granic. ChociaŜ tendencja do rozwaŜania aktywnych miejsc jako ograniczonych obszarów na powierzchni białka jest współcześnie dobrze ugruntowana, nie oznacza to wcale, Ŝe znacznie większe fragmenty makrocząsteczki nie są waŜne dla jej funkcji. W przeszłości, typowym podejściem w badaniach katalitycznie waŜnych reszt była modyfikacja prawie wszystkich reszt danego rodzaju i oznaczanie, czy ta modyfikacja spowodowała utratę lub zmianę danej aktywności. Badania tego rodzaju zostały zastąpione przez modyfikacje mniej intensywne i ich korelowanie z obserwowanymi zmianami aktywności biologicznej. Resztami „istotnymi” nazywa się grupy, które są zaangaŜowane w rozpatrywany rodzaj aktywności. Opisane wyŜej aktywne centra składają się z jednej lub kilku takich reszt. Z operacyjnego punktu widzenia, grupy istotne to takie, których modyfikacja pociąga za sobą utratę aktywności białka. Zakłada się, Ŝe inaktywacja wynika ze zmiany w charakterze chemicznej tej grupy. Tego, Ŝe modyfikacja funkcjonalnie witalnej grupy nie zawsze musi prowadzić do utraty aktywności, zwykle nie bierze się pod uwagę. Z praktycznego punktu widzenia waŜniejsze są „fałszywe grupy istotne”, których modyfikacja powoduje eliminację rozpatrywanej aktywności wskutek efektów wtórnych. Identyfikacja takich grup, chociaŜ często niezmiernie trudna, jest jednak niezbędna dla prawidłowej interpretacji zaleŜności pomiędzy funkcją a chemiczną strukturą. Gdy modyfikacja reszty aminokwasowej w białku prowadzi do utraty aktywności, resztę tę zwykle rozwaŜa się jako istotną. Czasem jednak taka naiwna dedukcja okazuje się nieprawidłowa. Przykładowo, inaktywacja moŜe być pozorna, gdyŜ oznaczana jest w 5 warunkach „standardowych” a faktycznie nastąpiło tylko przesunięcie optimum pH i po korekcie kwasowości buforu aktywność zostaje uwidoczniona. Dalej, jeśli enzym wykazuje aktywność katalityczną wobec kilku substratów, zdarza się, Ŝe modyfikacja chemiczna powoduje większy spadek aktywności wobec jednego substratu niŜ wobec innych. Utratę aktywności wskutek modyfikacji reszt odmiennych od tych, które występują w centrum aktywnym (a więc reszt faktycznie „nieistotnych”) tłumaczy się zwykle w sposób dwojaki, albo jako skutek sterycznego zablokowania przez podstawnik albo jako konsekwencję zmiany konformacyjnej białka. Pierwszą z moŜliwości moŜna czasem zweryfikować przez porównanie efektów modyfikacji białka za pomocą dwóch podobnych odczynników, znacznie róŜniących się wielkością wprowadzanego do białka podstawnika. Zmiany konformacyjne białka, które często zachodzą wskutek modyfikacji chemicznej, moŜna natomiast wykrywać rozmaitymi metodami fizykochemicznymi, np. spektroskopią dichroizmu kołowego. Najmniej wątpliwości budzić moŜe sytuacja, gdy modyfikacja chemiczna białka nie pociąga za sobą zmiany badanej aktywności. Dowodzi to raczej jednoznacznie, Ŝe reszty ulegające danej modyfikacji nie są dla aktywności istotne. 6.3.2. Chemiczna modyfikacja czy mutageneza punktowa? Mimo wszystkich wymienionych wyŜej, raczej oczywistych ograniczeń, metoda chemicznej modyfikacji pozostaje po dziś dzień najprostszym i najbardziej bezpośrednim sposobem identyfikacji reszt aminokwasowych istotnych dla funkcji białka. Znane są odpowiednio selektywne reakcje chemiczne wobec reszt kwasu asparaginowego, kwasu glutaminowego, histydyny, lizyny, argininy, metioniny, tryptofanu, tyrozyny i cysteiny. Dostępnych jest ponadto kilka mniej satysfakcjonujących metod modyfikacji reszt seryny, treoniny, asparaginy i glutaminy. Niedostępne natomiast dla metod łagodnej modyfikacji chemicznej są reszty glicyny, alaniny, waliny, leucyny, izoleucyny, fenyloalaniny i proliny, gdyŜ łańcuchy boczne tych aminokwasów nie zawierają odpowiednio reaktywnych grup. Na szczęście to właśnie reaktywne grupy wymagane są dla waŜnych aktywności biologicznych białek, przeto metoda chemicznej modyfikacji pozwala na testowanie wszystkich potencjalnie funkcjonalnych rodzajów reszt aminokwasowych. Rozwinięta ostatnio technologia inŜynierii genetycznej białek pozwala na zastosowanie mutagenezy punktowej, dzięki której moŜliwe jest wprowadzanie do białka zmian o wiele bardziej specyficznych niŜ za pomocą tradycyjnej chemicznej modyfikacji. Korzystając ze specyficzności aparatu genetycznego, zmienia się wyłącznie konkretne reszty aminokwasowe, 6 w pojedynczych, ściśle określonych pozycjach łańcucha polipeptydowego. Mogą to być teŜ wymienione wyŜej reszty, niedostępne dla metod chemicznej modyfikacji. Metoda mutagenezy punktowej ma jednak ograniczenia, gdyŜ przed jej zastosowaniem muszą być wstępnie znane kandydatury na reszty istotne. Jeśli nie wiadomo byłoby, które reszty mogą być istotne, zbyt wielka liczba reszt musiałaby być testowana genetycznie. Takich informacji dostarczyć jednak moŜe z łatwością metoda chemiczne modyfikacji, tak więc obie metody są nie tyle konkurencyjne, co komplementarne. Chemiczna modyfikacja pozwala na wyselekcjonowanie reszt, które mogą być istotne; inŜynieria genetyczna pozwala na określenie szczegółowej ich roli w funkcji biologicznej białka. 6.3.3. Ochrona grup centrum aktywnego przez substrat W przypadku wielu enzymów, substraty lub spokrewnione z nimi związki skutecznie chronią istotne reszty, występujące w centrum aktywnym, przed modyfikacją chemiczną. RóŜnicowe znakowanie (tzn. najpierw modyfikacja w obecności substratu a potem bez niego) pozwala na identyfikację tych reszt. JeŜeli aktywność została zachowana po modyfikacji w obecności substratu ale w jego nieobecności nastąpiła inaktywacja, zwykle zakłada się, Ŝe aktywne centrum było chronione przez substrat. JeŜeli po modyfikacji w obecności substratu usunie się go a następnie ponownie przeprowadzi się modyfikację, tym razem połączoną z wprowadzeniem piętna radioaktywnego, z ilości znacznika przyłączonego do białka moŜliwe będzie określenie liczby reszt, których modyfikacja jest odpowiedzialna za inaktywację. Dzięki radioaktywnemu znacznikowi, po chemicznej lub enzymatycznej degradacji łańcucha polipeptydowego moŜliwa jest izolacja i identyfikacja fragmentu centrum aktywnego. Aczkolwiek określanie takich fragmentów mianem „centrów aktywnych” moŜe czasem być błędne, gdyŜ ochrona za pomocą substratu moŜe dotyczyć reszt spoza centrum, chronionych przez zmianę strukturalną cząsteczki enzymu, towarzyszącą wiązaniu substratu. 6.3.4. Odczynniki selektywne wobec centrum aktywnego DąŜąc do wygodniejszego oznaczania grup istotnych wynaleziono tzw. „odczynniki specyficzne miejscowo” (ang. site-specific reagents). Odczynniki te zaprojektowano tak, aby niekowalencyjnie łączyły się z konkretnymi miejscami na powierzchni białka, a następnie reagowały z resztami w tym miejscu lub w jego pobliŜu. JeŜeli wiązanie kowalencyjne, wytworzone w drugim etapie, jest stabilne w warunkach chemicznego lub enzymatycznego rozszczepiania łańcucha polipeptydowego, moŜna zidentyfikować i scharakteryzować 7 fragmenty pochodzące z wyznakowanego miejsca. Odczynniki tego rodzaju dzieli się na: substraty jako znaczniki, pseudo-substraty oraz znaczniki bioswoiste (ang. affinity labels). Znakowanie substratami Substrat enzymu jest chyba przykładem najlepszego odczynnika specyficznego miejscowo. Niestety, wiązania tworzone między enzymami a ich substratami są zwykle nietrwałe i przejściowe. Specyficzność ich oddziaływania była jednak motorem do poszukiwań sposobów utrwalania tych wiązań. Na tej zasadzie oparte są np. metody specyficznej modyfikacji centrów aktywnych takich enzymów, w których cyklu katalitycznym występuje przejściowy związek o charakterze zasady Schiffa. Nietrwałe wiązanie podwójne w tym addukcie moŜna ustabilizować przez redukcję borowodorkiem sodu. Na rys. 6-1 zilustrowano schematycznie ten sposób modyfikacji, zastosowany do enzymu aldolazy. Rysunek 6-1: Znakowanie substratem centrum aktywnego aldolazy. Pseudo-substraty Proteinazy serynowe (trypsyna, chymotrypsyna itd.) oraz wiele esteraz (np. acetylocholinoesteraza) ulegają inaktywacji pod wpływem diizopropylofluorofosforanu (DFP, wzór strukturalny na rys. 6-2) wskutek jego reakcji z istotną katalitycznie resztą seryny w centrum aktywnym. We wszystkich wymienionych enzymach sekwencja aminokwasów wokół reaktywnej reszty seryny centrum aktywnego jest bardzo podobna. O H3C CH O H3C P F O CH H3C CH3 Rysunek 6-2: Przykład pseudo-substratu: diizopropylofluorofosforan (DFP). 8 „Typowe” reszty seryny, tj. inne reszty seryny w tych samych enzymach czy reszty seryny w innych białkach, nie reagują w tych samych warunkach. Chemiczne podstawy „nietypowej” reaktywności reszty seryny centrum aktywnego nie są w pełni zrozumiałe, ale wiadomo, Ŝe jest ona uzaleŜniona od natywnej struktury enzymu. Denaturacja enzymu znosi reaktywność względem DFP. DFP nazywa się pseudo-substratem, gdyŜ posiada pewne cechy wspólne z właściwymi substratami. Elektrofilowy atom fosforu DFP reaguje z nukleofilową grupą reaktywnej reszty seryny. Następuje eliminacja jonu fluorkowego i tworzy się stabilny addukt, diizopropylofosfoenzym, pod pewnymi względami przypominający acylo-enzym naturalny produkt pośredni powstający w trakcie normalnej hydrolitycznej reakcji, katalizowanej przez wymienione enzymy. Znaczniki bioswoiste Bioswoiste znakowanie centrów aktywnych białek wykorzystuje normalne oddziaływania enzym-substrat aby zapewnić wysokie, lokalne stęŜenie odczynnika modyfikującego wokół centrum aktywnego. UzaleŜnione jest teŜ od zdolności reaktywnej grupy w cząsteczce odczynnika do tworzenia stabilnego wiązania kowalencyjnego z enzymem. Bioswoisty znacznik jest zatem zwykle analogiem substratu, zawierającym reaktywną grupę o niekoniecznie wysokiej specyficzności względem określonych rodzajów reszt aminokwasowych. Jest to wyrafinowana technika modyfikacji chemicznej białek, której zakres współcześnie wciąŜ się poszerza. Jej dokładniejsze omówienie znaleźć moŜna m.in. w literaturze uzupełniającej do niniejszego rozdziału (pozycje 1 i 2). W tym miejscu ograniczymy się do omówienia jednego z najwcześniejszych, ale spektakularnych zastosowań. Za pomocą chlorometyloketonu tosylofenyloalaniny (TPCK, rys. 6-3) moŜna bardzo specyficznie alkilować resztę histydyny w centrum aktywnym α-chymotrypsyny. 9 + NH 3 CH 2 CH O 2 CH O 2 CH CH CH C NH CH 3 CH C 2 2 CH 2 Cl NH CH SO 3 2 CH 2 Cl SO 2 TLCK TPCK Rysunek 6-3: Przykłady bioswoistych znaczników dla α-chymotrypsyny (TPCK) oraz trypsyny (TLCK) Odczynnik został tak zaprojektowany, aby posiadał strukturalną cechę przypominającą substrat, która kieruje go do centrum aktywnego, gdzie reaktywna cześć chlorometylowa nieodwracalnie łączy się z reaktywną resztą histydyny. TPCK nie wywiera wpływu na trypsynę, która hydrolizuje wiązania peptydowe utworzone przez zasadowe aminokwasy: lizynę i argininę, ale nie wiązania utworzone przez aminokwasy hydrofobowe: tyrozynę i fenyloalaninę, preferowane przez α-chymotrypsynę. Jednak podobny odczynnik, chlorometyloketon tosylolizyny (TLCK), przypominający substrat trypsyny, specyficznie i stechiometrycznie inaktywuje trypsynę. Oba odczynniki są specyficzne względem konkretnego enzymu i reagują tylko z niezdenaturowanymi enzymami. 6.3.5. Oznaczanie liczby reszt istotnych Ilościowe oznaczanie reszt istotnych moŜliwe jest na róŜnych drogach. W przypadkach, gdy obserwowana jest ochrona reszty istotnej przez substrat, skuteczna moŜe okazać się róŜnicowa modyfikacja w obecności i nieobecności substratu i dalsze oznaczenie liczby reszt, które uległy protekcji przez substrat. Jeden z najogólniejszych sposobów oszacowania liczby reszt istotnych opracowany został przez Tsou (1962) i nazywany jest czasem metodą statystyczną. Polega on na badaniu korelacji pomiędzy stopniem inaktywacji białka o stopniem modyfikacji danego rodzaju reszt aminokwasowych w szeregu próbek białka niecałkowicie zinaktywowanego. Większość skutecznych zastosowań tej metody opiera się na najprostszym z przedstawionych przez Tsou modeli inaktywacji, zakładającym, Ŝe n reszt ulegających modyfikacji, wykazujących jednakową reaktywność względem odczynnika modyfikującego, zawiera i reszt istotnych, przy czym modyfikacja dowolnej reszty istotnej prowadzi do całkowitej inaktywacji. 10 Wówczas aktywność resztowa (a), wyraŜona jako frakcja aktywności białka natywnego, jest proporcjonalna do średniej liczby zmodyfikowanych reszt (m) zgodnie z równaniem: a 1/i = (n - m) / n Wartość i określona jest przez tą z szeregu zaleŜności a od m (tzw. wykresów Tsou), dla której otrzymuje się najlepsze dopasowanie linii prostej (tj. najwyŜszą wartość współczynnika korelacji prostoliniowej). Przykład takiej analizy przedstawiono na rys. 6-4. Rysunek 6-4: Zastosowanie statystycznej metody Tsou w celu oszacowania liczby istotnych reszt argininy w białku wiąŜącym ryboflawinę z jaj kurzych (RfBP) w oparciu o wyniki modyfikacji tego białka przy uŜyciu 1,2-cykloheksanodionu. Wykresy Tsou sporządzono na podstawie szeregu próbek zmodyfikowanego RfBP, dla których jednocześnie oznaczono aktywność tj. pojemność wiązania ryboflawiny (wyraŜoną jako frakcja aktywności białka niezmodyfikowanego, a) oraz stopniem modyfikacji (wyraŜonym jako średnia liczba reszt zmodyfikowanych m). Przedstawiono zaleŜności a1/i od m dla i=1 (), i=2 () oraz i=3 (). Do kaŜdej serii punktów dopasowano prostą regresji; odpowiednie współczynniki korelacji wynosiły –0.932, -0.898 oraz –0.891. Wynika stąd, Ŝe tylko jedna reszta argininy jest istotna dla aktywności wiązania ryboflawiny przez RfBP. Postać wykresów Tsou sugeruje, Ŝe część reszt argininy w RfBP, szybko reagujących z odczynnikiem, nie jest istotna dla wiązania. JeŜeli liczbę takich reszt oznaczymy jako s, a liczbę reszt wolniej reagujących, wśród których występują reszty istotne, oznaczymy jako p, to w sytuacji gdy m > s spełniona powinna być zaleŜność a 1/i = (p + s - m) / p. Prosta regresji, najlepiej pasująca do przedstawionych danych doświadczalnych (a = 1,91 – 0,37 m) jest zgodna z tym modelem dla s = 2, p = 3 oraz i = 1. (Zaczerpnięto z literatury źródłowej, pozycja 3). Inna, nieco trudniejsza metoda wyznaczania liczby reszt istotnych, nazywana metodą kinetyczną, zaproponowana została przez Raya i Koshlanda (1961). Opiera się ona na porównaniu krzywych kinetycznych obu procesów, tj. modyfikacji i inaktywacji, z prostymi modelami teoretycznymi. Badania prowadzi się w warunkach pseudo-pierwszorzędowych, realizowanych zwykle przez bardzo duŜy nadmiar odczynnika modyfikującego. Upraszcza to 11 kinetykę i ułatwia interpretację. W najprostszym modelu rozwaŜa się prostą modyfikację istotnych reszt aminokwasowych. ZałóŜmy, Ŝe makrocząsteczka posiada n reszt reaktywnych x1, x2, .... xn, dla których stałe szybkości wynoszą odpowiednio k1, k2, ..., kn. Frakcje poszczególnych reszt, które po czasie t pozostały niezmodyfikowane, określają równania: x1 / (x1)0 = e - k1t .................... xn / (xn)0 = e - knt ZałóŜmy ponadto, Ŝe niektóre z tych reszt aminokwasowych są „istotne“ w tym sensie, Ŝe modyfikacja dowolnej z nich powoduje całkowitą utratę aktywności enzymu. Względna aktywność pozostająca po dowolnym czasie dana jest przez prawdopodobieństwo znalezienia cząsteczki białka, w której wszystkie reszty istotne są nienaruszone. JeŜeli istotne są reszty xi, .... xi+j, zaleŜność aktywności od czasu opisuje równanie: a / a0 = e-kat = (e-kit) (e-ki+1t) ..... (e-ki+jt) A zatem ka jest równe sumie ki, ... ki+j reszt, istotnych dla mierzonej aktywności. JeŜeli n reszt wykazuje tę samą reaktywność, tj. k1 = k2 =...kn = kχ, a i spośród nich jest istotnych, to wtedy: ka = i kχ Metoda kinetyczna pozwala podzielić reszty aminokwasowe białka na odrębne klasy, róŜniące się reaktywnością względem odczynnika modyfikującego. Przykład zastosowania tej metody przedstawiono na rys. 6-5. Rysunek 6-5: Zastosowanie kinetycznej metody Raya i Koshlanda w celu oszacowania liczby istotnych reszt argininy w białku wiąŜącym ryboflawinę z jaj kurzych (RfBP) w oparciu o wyniki modyfikacji tego białka przy uŜyciu 1,2cykloheksanodionu. Pojemność wiązania ryboflawiny (a, ) oraz względną zawartość argininy (χ, ) mierzono w tych samych próbkach w funkcji czasu reakcji. Wykres zaleŜności czasowej dla modyfikacji rozłoŜono graficznie na dwie krzywe pseudopierwszorzędowego zaniku. Pseudo-pierwszorzędowa stała szybkości modyfikacji wolno reagujących reszt argininy jest bardzo zbliŜona do stałej prędkości inaktywacji białka. Wynik ten sugeruje, Ŝe jedna z wolno reagujących reszt argininy jest istotna dla 12 aktywności wiązania ryboflawiny. Do tego samego wniosku doprowadziła analiza tego układu metodą Tsou (rys. 6-4). Cząsteczka RfBP zawiera 5 reszt argininy. (Zaczerpnięto z literatury źródłowej, pozycja 3). Jak juŜ wspomniano, reszty aminokwasowe znajdujące się w centrum aktywnym bardzo często wykazują reaktywność, zdecydowanie róŜną od pozostałych grup tego rodzaju w danym białku. Najczęściej jest to reaktywność bardzo wysoka. Grupy takie stanowią zatem samoistnie wyodrębnioną klasę szybko reagującą z odczynnikiem modyfikującym. Przez odpowiedni dobór warunków reakcji moŜna ograniczyć modyfikację tylko do tych reszt. Odpowiednio zaprojektowane odczynniki, wykorzystujące to zjawisko, mogą być uŜyte do selektywnego oznaczania reszt obecnych w centrum aktywnym. Szczególnie często spotykamy się z hiperreaktywnością grup sulfhydrylowych obecnych w centrach aktywnych róŜnych klas enzymów 6.3.6. Modyfikacja odwracalna Dobry dowód, Ŝe zmiany we własnościach białka są rzeczywiście wynikiem modyfikacji chemicznej tego biopolimeru, moŜna uzyskać usuwając modyfikującą grupę i prezentując powrót oryginalnych własności. Z tych względów jest bardzo poŜądane dysponowanie odczynnikami, które modyfikują reszty aminokwasowe w ten sposób, Ŝe moŜliwe jest późniejsze odtworzenie oryginalnej reszty. Takie odczynniki mogą być równieŜ uŜyteczne w celu tymczasowego zapobiegania reakcji reszt z innymi odczynnikami. Tego rodzaju podejście jest zadziwiająco rzadko stosowane, chociaŜ znanych jest wiele odczynników, których modyfikujące działanie jest potencjalnie odwracalne (patrz dalsze podrozdziały). 6.4. Modyfikacja chemiczna w celu zmiany struktury białka 6.4.1. Zmiany stanu jonizacji oraz konformacji białka Cząsteczki białka są naładowane elektrycznie, gdyŜ zawierają charakterystyczną liczbę zarówno anionowych jak i kationowych grup. Modyfikacja określonego typu naładowanych grup moŜe zmieniać ładunek netto makrocząsteczki, co moŜe powodować zniszczenie jej charakterystycznych własności. Wskutek takich modyfikacji często zachodzić zatem mogą: obniŜenie rozpuszczalności, zmiany konformacji cząsteczki oraz zmiany stopnia agregacji. Drobne zmiany konformacyjne mogą być trudno wykrywalne metodami fizyko-chemicznymi, 13 ale wciąŜ mogą znacząco wpływać na aktywność biologiczną. Natomiast zmiany stopnia agregacji na ogół łatwo stwierdzić. ChociaŜ większość modyfikacji chemicznych białek prowadzi się z nadzieją zminimalizowania takich zmian (określanych ogólnie jako „denaturacja”), w pewnych przypadkach zmiany konformacji lub stopnia agregacji stają się poŜądanym celem. Przykładem odczynnika, stosowanego w tych celach, jest bezwodnik bursztynowy. Bursztynylacja powoduje ulokowanie anionowej grupy –COO- w miejsce kationowej grupy -NH3+, co oznacza zmianę ładunku cząsteczki białka netto o dwie jednostki na kaŜdą zmodyfikowaną grupę. Nowe oddziaływania elektrostatyczne, trochę podobne do tych, jakie występują w białku niezmodyfikowanym w wysokim pH, mogą powodować dysocjację oligomerycznych białek na podjednostki (rys. 6-6). Bursztynylacja symuluje zatem dysocjujący wpływ wysokiego pH ale w warunkach, w których aktywność biologiczna moŜe zostać zachowana. Rysunek 6-6: Schemat ilustrujący wpływ bezwodnika bursztynowego na równowagę dysocjacji oligomerycznego białka na jego podjednostki. Znaczna zmiana ładunku netto cząsteczki białka poddanego bursztynylacji powoduje jej rozpulchnienie, a zarazem często zwiększenie rozpuszczalności. MoŜna zatem próbować tego typu modyfikacji w celu solubilizacji trudno rozpuszczalnych białek. 6.4.2. Redukcja i reoksydacja wiązań disiarczkowych W białkach tylko wiązania disiarczkowe są podatne na łagodną redukcję. Pełna redukcja tych wiązań na ogół wymaga całkowitego zniszczenia struktury trzeciorzędowej białka, np. przez działanie mocznika. Traktowanie takich zredukowanych białek kwasem jodooctowym lub akrylonitrylem moŜna zastosować w celu zablokowania wygenerowanych grup sulfhydrylowych i tym samym zapobiegnięcia odtwarzaniu mostków disiarczkowych po usunięciu czynnika redukującego. Wiele zredukowanych i całkowicie rozwiniętych białek, jeśli nie zostały poddane powyŜszej alkilacji, odzyskuje aktywność biologiczną po powrocie do niedenaturujących warunków i łagodnym utlenianiu na powietrzu. Tego rodzaju badania stały się podstawą hipotezy, Ŝe cała informacja niezbędna dla prawidłowego ufałdowania cząsteczki białka zawarta jest w jego strukturze pierwszorzędowej. 14 6.4.3. Odczynniki spinające białka (odczynniki dwufunkcyjne) Odczynniki zawierające dwie reaktywne grupy stosuje się w celu wprowadzania do białek wiązań krzyŜowych, zarówno wewnątrzcząsteczkowych jak i międzycząsteczkowych (rys. 67). Zastosowanie tych odczynników spinających (ang. cross-linking reagents) rozwaŜymy w kontekście dwóch typów pochodnych jakie mogą się tworzyć. Rysunek 6-7: Schemat reakcji sieciowania białka przy uŜyciu 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzenu Wewnątrz cząsteczkowe wiązania krzyŜowe wprowadza się przede wszystkim dla stabilizacji struktury trzeciorzędowej oraz szacowania odległości między grupami. Ten ostatni cel osiągnąć moŜna przez oznaczenie konkretnych aminokwasów, które łączą się z „głowami” indywidualnych odczynników dwufunkcyjnych. UŜywając róŜnych odczynników, lub, lepiej, serii homologicznych odczynników, w których „głowy” rozdzielone są łańcuchami o róŜnej długości, moŜna określić względne odległości pomiędzy róŜnymi grupami. Zwykle potrzebne są jeszcze uzupełniające badania z analogicznymi odczynnikami monofunkcyjnymi, aby wykryć „uboczne” zaburzenia, związane z modyfikacją. Międzycząsteczkowe wiązania krzyŜowe mogą łączyć ze sobą cząsteczki tego samego lub róŜnego rodzaju. Otrzymane produkty mogą być wykorzystywane jako modele dla badań oddziaływań białko-białko, jako wielkocząsteczkowe analogi jednego lub obu składowych białkowych, albo jako substancje łączące poŜądane atrybuty oby komponent w jednej cząsteczce. Międzycząsteczkowe wiązania moŜna teŜ zastosować w celu sprzęgnięcia biologicznie aktywnych cząsteczek do nierozpuszczalnych nośników oraz w celu sprzęgnięcia sąsiadujących ze sobą podjednostek białka oligomerycznego jako sposobu określenia ich układu geometrycznego. Warunki reakcji w znacznej mierze decydują o tym, czy przewaŜać będą wiązania wewnątrzczy międzycząsteczkowe. Przy wysokich rozcieńczeniach białka, faworyzowane jest tworzenie wiązań wewnątrzcząsteczkowych. Główne parametry, decydujące o ostatecznym rodzaju produktu, to stęŜenie białka, stosunek odczynnika do białka oraz czynniki takie jak pH czy siła jonowa do tego stopnia, w jakim wpływają one na oddziaływanie białko-białko w trakcie przebiegu modyfikacji. Aktualnie dostępna handlowo jest ogromna liczba odczynników sieciujących baiłka, obejmujących najrozmaitsze kombinacje grup reaktywnych. Dokładne omówienie własności i 15 zakresu zastosowań tych odczynników znaleźć moŜna w literaturze uzupełniającej do niniejszego rozdziału (pozycje 2 i 3). 6.4.4. Sprzęganie białek ze stałymi nośnikami (unieruchamianie) Aktywne biologicznie białka, sprzęgnięte z nierozpuszczalnymi w wodzie nośnikami lub uwięzione w nierozpuszczalnych w wodzie matrycach, mogą budzić zainteresowanie zarówno teoretyczne jak i praktyczne. W celu otrzymania takich materiałów opracowano duŜą liczbę technik, z których szereg pozwala na zachowanie znacznej części aktywności biologicznej „unieruchamianego” białka. Na poziomie teoretycznym, takie białka mogą słuŜyć jako modele białek związanych z błonami. Oddziaływanie unieruchomionych białek z substratami jest interesujące z punktu widzenia kinetyki enzymatycznej, ilustrując wpływ zawad sterycznych oraz ograniczonej dostępności na aktywność enzymu. W odniesieniu do wielkocząsteczkowych substratów, preparaty takie są szczególnie uŜyteczne, umoŜliwiając ograniczanie działania enzymu. Nierozpuszczalność w wodzie pozwala na bardzo wygodne mechaniczne oddzielanie białka od substratu; takie preparaty białkowe moŜna pakować w kolumny, przez które przepływa roztwór rozpuszczalnego substratu. Zmieniając prędkość przepływu przez taką kolumnę, moŜna kontrolować stopień konwersji substratu. Sprzęganie białek do stałych nośników chromatograficznych stanowi podstawę części technik preparatyki biochemicznej, zaliczanych do tzw. chromatografii powinowactwa (patrz rozdział 3.5). Technologia unieruchamiania białek omówiona jest dokładniej w literaturze uzupełniającej do niniejszego rozdziału (pozycja 5). 6.5. Wprowadzanie do białek grup specjalnych 6.5.1. Zmiana podatności na proteolizę Enzymatyczna hydroliza wiązań peptydowych zaleŜy od rozpoznania rozszczepialnego wiązania przez konkretny enzym. Wiele proteolitycznych enzymów, w szczególności te, które są powszechnie stosowane do degradacji łańcuchów polipeptydowych dla celów analizy sekwencji aminokwasów, mają dość wąską specyficzność substratową a zatem rozcinają łańcuch w ograniczonej liczbie miejsc. Przykładowo, trypsyna hydrolizuje wiązania utworzone przez karboksylowe grupy lizyny i argininy. W korzystnych przypadkach taka ograniczona proteoliza prowadzi do powstawania ograniczonej liczby peptydów, które moŜna 16 wyizolować i indywidualnie oczyścić. Jednak aby ułatwić sekwencjonowanie takich peptydów, czasem wskazane jest zmniejszenie albo zwiększenie liczby punktów cięcia. Grupy ε-aminowe lizyny są podatne na takie rodzaje modyfikacji chemicznej, które czynią przyległe wiązania peptydowe odpornymi na hydrolizę przez trypsynę. Dla tych celów uŜyteczna jest zarówno trifluoroacetylacja jak i amidynacja, gdyŜ modyfikujące grupy moŜna później łatwo usunąć, regenerując podatność wiązania na działanie trypsyny. W trakcie trawienia tak zablokowanego łańcucha polipeptydowego, rozcinane są tylko wiązania tuŜ za resztami argininowymi. Frakcjonowanie i oczyszczanie powstałych peptydów, oraz dalsze usunięcie grup blokujących i ponowne traktowanie trypsyną, powoduje rozcinanie wiązań lizylowych. Dość łatwa analiza ostatecznie otrzymanych peptydów znakomicie ułatwia problem sekwencjonowania. Podobnie, modyfikacja grup guanidynowych argininy powoduje ich przekształcenie w reszty nie rozpoznawane przez trypsynę. Przykładowo, traktowanie białka przez 1,2cykloheksanodion pozwala ograniczyć fragmentację łańcucha do wiązań za resztami lizynowymi. Niestety, Ŝadne znane modyfikacje reszt argininowych nie są w pełni odwracalne, co ogranicza ich uŜyteczność w analizach sekwencji. Czasem, na odwrót, potrzebne jest zwiększenie liczby hydrolizowalnych wiązań peptydowych. Dla tych celów opracowano metody modyfikacji reszt cysteinowych przy uŜyciu 2-bromoetyloaminy lub etylenoiminy, prowadzących do utworzenia reszt S-(2-aminoetylo)cyteinylowych. Są one na tyle podobne do reszt lizynowych, Ŝe rozpoznaje je trypsyna, rozcinając występujące za nimi wiązanie peptydowe. 6.5.2. Wzmacnianie immunogenności Często stosowaną techniką immunochemiczną jest modyfikacja chemiczna białek w celu wprowadzenia grup, zdolnych do indukcji wytwarzania przeciwciał po wstrzyknięciu adduktu do zwierzęcia doświadczalnego. Ta zdolność nazywa się immunogennością, a grupy wprowadzane do białek w celu jej wzmocnienia nazywa się haptenami. Same hapteny nie wywołują wytwarzania przeciwciał, jeśli nie są przyłączone do białka. Hapteny są uŜyteczne dla zwiększania immunogenności słabo immunogennych białek oraz dla kierowania produkcji przeciwciał na specyficzne, chemicznie zdefiniowane determinanty. Przyłączanie haptenów do białek realizuje się najczęściej na drodze reakcji z solami diazoniowymi lub z halogenkami arylowymi. ChociaŜ bardzo róŜne związki wykorzystywano w charakterze haptenów, najskuteczniejsze okazywało się stosowanie grup aromatycznych. 17 Przeciwciała skierowane przeciw haptenowi mają zdolność do wiązania się zarówno z immunogennym koniugatem, jak i osobno z częścią białkową oraz częścią haptenową. PoniewaŜ tworzenie kompleksu pomiędzy przeciwciałem a małą cząsteczką jest znacznie mniej skomplikowane niŜ pomiędzy przeciwciałem a duŜym antygenem, badania oddziaływań hapten-przeciwciało znakomicie przyczyniły się do naszego zrozumienia mechanizmów oddziaływania przeciwciało-antygen. Tworzenie kompleksów typu haptenprzeciwciało moŜna traktować tak jak inne oddziaływania białek z małymi ligandami. Stosunkowo proste techniki fizykochemiczne pozwalają wyznaczyć takie parametry jak stałe równowagi kompleksowania, stałe prędkości asocjacji i dysocjacji oraz liczbę miejsc wiąŜących ligand w cząsteczce białka. Dla przykładu, łatwo śledzić moŜna wpływ modyfikacji przeciwciała na zdolność tworzenia kompleksu z haptenem. Badając wiązanie serii spokrewnionych chemicznie haptenów, moŜna wysnuwać wnioski co do wpływu struktury na wiązanie. Badania wiązania haptenów do przeciwciał okazały się waŜnym źródłem informacji o wymaganiach strukturalnych dla reakcji przeciwciało-antygen. 6.5.3. Wprowadzanie do białek sond wraŜliwych na charakter lokalnego otoczenia Grupy, których własności spektralne silnie zaleŜą od środowiska, moŜna przyłączyć do białek i wykorzystać w celu monitorowania róŜnych aspektów białkowego otoczenia. Zmiany konformacji białka czy wszelkie inne zmiany wpływające na te znaczniki znajdują swe odzwierciedlenie w zmianach charakterystyki spektralnej znacznika. PoniewaŜ zwykle interesuje nas białko natywne, wprowadzenie znacznika nie moŜe znacząco zmieniać własności tej formy białka. Stosując rozmaite techniki znakowania skierowanego w konkretne miejsca, moŜna monitorować te miejsca oraz śledzić zmiany, towarzyszące specyficznym oddziaływaniom, takim jak np. wiązanie substratu czy inhibitora. Znaczniki fluorescencyjne Wprowadzanie fluoryzujących znaczników do białek wykorzystywane jest do lokalizowania białek w tkankach, demonstrowania oddziaływań białek z innymi molekułami oraz sondowania struktury białka. Techniki fluorescencyjne są szczególnie przydatne ze względu na ich wysoką czułość. Wiadomo, Ŝe same białka mają właściwości fluorescencyjne dzięki obecności w ich składzie fluoryzujących reszt tryptofanu i tyrozyny. Parametry widma emisji tryptofanu są bardzo wraŜliwe na wpływ otoczenia (polarność, obecność wygaszaczy fluorescencji). Maksimum emisji wolnego tryptofanu w roztworze wodnym występuje przy 353 nm (wzbudzenie przy 295 nm). W białkach maksimum emisji jest przesunięte w kierunku 18 fal krótszych (330-350 nm), wskutek wpływu hydrofobowego otoczenia, w którym znajduje się określona frakcja reszt tryptofanowych. Denaturacja białka powoduje przesunięcie maksimum emisji do 360-355 nm. Wynika stąd, Ŝe połoŜenie maksimum emisji białka jest miarą średniej ekspozycji reszt tryptofanowych do rozpuszczalnika. Niestety, naturalna fluorescencja reszt tryptofanowych białek okazuje się jednak niewystarczająca pod względem intensywności dla wielu typów pomiarów spektrofluorymetrycznych. Dlatego rozwinięto szereg technik, pozwalających na przyłączanie do białek barwników fluroescencyjnych, których własności fluorescencyjne silnie zaleŜą od środowiska. Powszechnie stosowaną sondą fluorescencyjną tego rodzaju jest reszta dansylowa. Wprowadzić ją moŜna do białek np. przez zastosowanie reagującego z grupami aminowymi chlorku dansylu (rys. 6-8). Rysunek 6-8: Wzór chlorku dansylu, znacznika fluorescencyjnego po raz pierwszy zastosowanego w badaniach struktury białek (Weber, 1951). W spisie literatury uzupełniającej do niniejszego rozdział zamieszczono pozycje 4 i 6, umoŜliwiające dokładniejsze zapoznanie się z róŜnymi wersjami spektroskopii fluorescencji z zastosowaniem znaczników fluoryzujących. Chromoforowe grupy „reporterowe” Nazwa „grupy reporterowe” stosowana jest od dawna w odniesieniu do odczynników, wiąŜących się kowalencyjnie z białkami i zawierających chromofor, którego własności spektralne są wraŜliwe na zmiany mikrootoczenia. Widma związanego z białkiem odczynnika zmieniają się wskutek lokalnych zmian pH lub polarności i dzięki temu mogą być uŜyte jako miejscowe monitory struktury białka. Przykładowe związki, za pomocą których wprowadzić moŜna do białek grupy reporterowe z widmami absorpcyjnymi szczególnie wraŜliwymi na otoczenie, przedstawiono na rys. 6-9. Rysunek 6-9: Odczynniki, pozwalające na wprowadzenie do białek chromoforowych grup reporterowych: 2-bromoacetamido-4-nitrofenol (1), bromek 2-metoksy-5nitrobenzylu (2), bromek 2-hydroksy-5-nitrobenzylu (3). Ilustracją zastosowania tych związków jest modyfikacji α-chymotrypsyny przy uŜyciu 2-bromoacetamido-4-nitrofenolu, który wiąŜe się z resztą metioniny, znajdującą się o trzy reszty przed resztą seryny centrum aktywnego. Oddziaływanie tak zmodyfikowanej 19 chymotrypsyny z róŜnymi substratami oraz ich analogami związane było ze zmianami widma absorpcyjnego grupy reporterowej, świadczącymi o znacznych lokalnych zmianach mikootoczenia wokół chromoforu. Znakowanie spinowe Opracowano szereg technik wprowadzania do białek małych, paramagnetycznych grup nazywanych znacznikami spinowymi. Pozwalają one zastosować spektroskopię elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) w odniesieniu do białek, które normalnie nie są paramagnetyczne. Widma EPR takich koniugatów moŜna wykorzystać do badań cech lokalnego otoczenia białkowego wokół znacznika spinowego. Zmiany konformacyjne białka odzwierciedlają się w zmianach widm EPR, które moŜna interpretować jako wynik konformacyjnych napięć, wywieranych na znacznik spinowy i jego mikrootoczenie. Jedną z zalet zastosowania spektroskopii EPR do tych celów jest wysoka czułość metody. Najczęściej stosowane znaczniki spinowe to nitroksylowe rodniki (rys. 6-10), które zwykle otrzymuje się z odpowiednich amin drugorzędowych przez utlenianie nadtlenkiem wodoru w obecności odpowiedniego katalizatora. Niesparowane elektrony, warunkujące wystąpienie sygnału EPR, są zlokalizowane na wiązaniu N-O. Znacznik zawiera ponadto reaktywną grupę, pozwalającą na przyłączenie do odpowiedniej reszty aminokwasowej białka. Rysunek 6-10: Plan budowy typowego znacznika spinowego Widmo EPR takich związków zawiera trójpasmową strukturę nadsubtelną; dokładna jej postać zaleŜy od rodzaju znacznika oraz jego otoczenia. Odzwierciedla ona swobodę rotacyjną rodnika nitroksylowego i staje się bardzo asymetryczna, gdy następuje ograniczenie swobody rotacji rodnika. Takie ograniczenia rotacji wynikać mogą ze wzrostu lepkości środowiska lub wskutek przyłączenia rodnika do białka. Na względną swobodę rotacyjną wpływa ciasnota dopasowania znacznika do białka oraz prędkość rotacji makrocząsteczki. Zmiany tych własności pozwalają monitorować zmiany konformacyjne białka. TakŜe polarność otoczenia wpływa na widmo EPR, co pozwala na badanie tego aspektu struktury białka w miejscu przyłączenia znacznika. 6.5.4. Podstawienie izomorficzne 20 Dynamiczny rozwój rentgenografii strukturalnej białek stymulował poszukiwania chemicznych metod otrzymywania pochodnych form białek, zawierających atomy metalu cięŜkiego. W większości badań rentgenostrukturalnych niezbędne bywało izomorficzne podstawienie atomu małego duŜym. Prawdziwie izomorficzne podstawienie musi zachodzić bez strukturalnych zmian w cząsteczce białka. CięŜki atom stanowi punkt odniesienia, dookoła którego moŜna lokalizować inne atomy. Upewnienie się, Ŝe w trakcie podstawiania nie nastąpiła zmiana konformacyjna białka, ma pierwszorzędowe znaczenie. W przypadku enzymów, zweryfikować to moŜna w pewnym stopniu przez stwierdzenie zachowania aktywności enzymatycznej przez kryształ zawierający atom cięŜki. W wielu przypadkach otrzymywano uŜyteczne preparaty przez moczenie kryształów białka w roztworach zawierających jony metalu cięŜkiego albo poprzez krystalizację w obecności takich jonów. Metody te są kłopotliwe i niepewne. Alternatywnym podejściem jest kowalencyjne przyłączenie do białka grupy zawierającej atom metalu cięŜkiego lub zdolnej do chelatowania takich atomów (rys. 6-11). Rysunek 6-11: Pochodne białek, zawierające atom metalu cięŜkiego, przydatne do badań struktury białek metodą dyfrakcji promieni X. 6.5.5. Znakowanie w celu wykrywania białek lub ich oznaczania ilościowego Szereg metod modyfikacji chemicznej białek słuŜy znakowaniu tych biopolimerów grupami, które mają własności pozwalające na ich wykrywanie w bardzo niskich stęŜeniach. Większość odczynników, zaprojektowanych do tego typu modyfikacji, zawiera część reaktywną, pozwalającą na przyłączenie do odpowiednich reszt aminokwasowych białka, oraz część znacznikową. Modyfikacja białka prowadzi do trwałego, kowalencyjnego umieszczenia znacznika na białku. Poprzez obserwację unikalnej, wykrywalnej cechy znacznika moŜna bezpośrednio śledzić losy wyznakowanego białka w złoŜonych układach pochodzenia biologicznego oraz jego oddziaływania z innymi biomolekułami. Wykrywanie znacznika odbywa się poprzez pomiar spektofotometryczny, poprzez pomiar radiometrycznych lub sposobem pośrednim, za pośrednictwem innej wyznakowanej substancji. Znaczniki chromogenne i fluoryzujące Znaczniki spektralne, przyłączane do białek w celach analitycznych, mogą być chromogenne lub fluoryzujące. Znaczniki chromogenne są zwykle stosowane do niekowalencyjnego 21 wybarwiania duŜych struktur w obrębie komórek i tkanek. Czułość wykrywania barwników absorbujących światło widzialne często nie jest jednak wystarczająca dla identyfikacji białek w odpowiednio niskich stęŜeniach. Za to znaczniki fluoryzujące pozwalają na osiągnięcie bardzo wysokiej czułości, przeto to one właśnie zyskały najszerszy zakres zastosowań do otrzymywania pochodnych białek uŜywanych do licznych oznaczeń ilościowych in vitro. Przykładowo, wyznakowane fluorescencyjnie przeciwciała moŜna stosować do testowania komórek i tkanek na obecność antygenów i wykrywać je przy uŜyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Dla wykrywania białek i ich oznaczeń stosuje się na ogół odmienne barwniki niŜ te, które wykorzystywane są jako sondy struktury białek (patrz wyŜej). Działanie tych ostatnich opiera się na ich wraŜliwości na cechy mikrootoczenia, a taka zmienność sygnału jest niekorzystna w zastosowaniach analitycznych. Najczęściej wykorzystuje się przeto pochodne fluoresceiny, rodaminy oraz kumaryny, które mają wysoki współczynnik absorpcji i wysoką wydajność kwantową fluroescencji, ale przesunięcie stockesowksie jest niewielkie a parametry fluorescencji w nieznacznym tylko stopniu zaleŜą od polarności rozpuszczalnika (rys. 6-12). Rysunek 6-12: Plan budowy znaczników fluorescencyjnych, zawierających jako fluorofor fluoresceinę (1), rodaminę (2) lub kumarynę (3). Podstawnik R moŜe zawierać róŜne reaktywne grupy, zdolne do modyfikacji konkretnych rodzajów reszt aminokwasowych w białkach. Znaczniki radioaktywne Znakowanie białek przy uŜyciu radioaktywnych odczynników było jednym z pierwszych sposobów kreowania moŜliwości bardzo czułej detekcji. Wiele z odczynników modyfikujących określone reszty aminokwasowe w białkach moŜna wyprodukować w wersjach, zawierających radioaktywne izotopy, najczęściej węgla 14C, trytu 3H, fosforu 32P oraz siarki 35S. Wymienione izotopy emitują promieniowanie β, którego detekcja wymaga zmieszania próbki z płynem scyntylacyjnym. Szczególnie popularne są zastosowania izotopu węgla 14C oraz trytu, wysyłające bardzo miękkie promieniowanie, najmniej niebezpieczne dla zdrowia. Jeśli jednak chcemy osiągnąć maksymalną czułość detekcji, o wiele atrakcyjniejsze są izotopy jodu, 131I oraz 125I, nietrwałe (okresy połowicznego rozpadu odpowiednio 8,1 i 60 dni), emitujące twarde promieniowanie γ, łatwiej mierzalne niŜ promieniowanie β. Intensywność emisji izotopów jodu jest bardzo wysoka. Z wielu względów praktycznych przewaŜa 22 stosowanie 125I, który ma wprawdzie radioaktywność właściwą mniejszą niŜ 131I, ale wciąŜ wielokrotnie wyŜszą niŜ wyliczone wyŜej izotopy „łagodne”. Okazuje się, Ŝe znaczniki zawierające 125I mogą dawać czułość oznaczeń wyŜszą 150 razy od znaczników trytowych oraz 35000 razy wyŜszą od znaczników opartych na 14C. Znakowanie radioaktywnymi izotopami jodu to modyfikacja chemiczna, wprowadzająca do cząsteczki jeden lub więcej atomów radioaktywnego jodu. W wodnym roztworze jod tworzy reaktywny jon H2OI+, zdolny do modyfikowania reszt tyrozyny i histydyny w białkach (rys. 6-13). Rysunek 6-13: Schemat jodowania tyrozyny i histydyny przez jon H2OI+. Współczesne metody jodowania wykorzystują róŜne odczynniki, generujące reaktywną formę jodu i w ten sposób pozwalające na znaczne przyspieszenie reakcji. Zasadniczo jodowanie przeprowadzić moŜna na dwa sposoby: albo przez bezpośrednie znakowanie białka w obecności czynnika utleniającego albo, pośrednio, przez znakowanie najpierw jakiegoś pośredniego związku, który potem stosowany jest do ostatecznej modyfikacji białka. W jodowaniu bezpośrednim jako odczynnik utleniający moŜna zastosować np. chloraminę T (N-chlorotoluenosulfonamid). Obiecującą alternatywą jest uŜycie układu enzymatycznego, złoŜonego z oksydazy glukozy i laktoperoksydazy. W układzie tym, wskutek utlenienia glukozy przez oksydazę glukozy tworzy się nadtlenek wodoru, który w reakcji katalizowanej przez peroksydazę utlenia jon jodkowy do jodu cząsteczkowego, co oznacza generację reaktywnej formy jodu. W znakowaniu metodą pośrednią pierwszy etap polega na jodowaniu odczynnika, zawierającego cześć, łatwo ulegającą tej modyfikacji (aktywowane pierścienie arylowe, takie jak w fenolu czy anilinie) oraz część reaktywną względem określonych rodzajów reszt aminokwasowych białka. Za pośrednictwem tej ostatniej grupy znacznik jest w drugim etapie przyłączany do białka. Związek o takim planie budowy (rys. 6-14) został po raz pierwszy zastosowany przez Boltona i Huntera (1973). Rysunek 6-14: Radiojodowanie grup aminowych za pomocą odczynnika BoltonaHuntera. 23 Biotynylacja Białka oraz inne molekuły moŜna wykrywać dzięki zastosowaniu odczynnika modyfikującego, wykazującego wysokie powinowactwo do innej wyznakowanej cząsteczki. Przykładowo, do białka moŜna przyłączyć biotynę, a utworzony koniugat wykrywać za pomocą białek specyficznie wiąŜących biotynę: awidyny i streptawidyny, oczywiście wyznakowanych jakimś znacznikiem, pozwalającym na ultraczułą detekcję. Ogólny plan budowy odczynnika, słuŜącego do biotynylacji białek przedstawiono na rys. 615. Rysunek 6-15: Plan budowy odczynnika do biotynylacji białek Technologie bioanalityczne i biopreparatywne, oparte na układzie awidyna (streptawidyna) biotyna rozwijają się lawinowo (zobacz np.: pozycja 7 literatury uzupełniającej do niniejszego rozdziału). Powstający w wyniku wiązania biotyny przez te białka kompleks jest jednym z najtrwalszych, jakie zna przyroda (stała asocjacji rzedu 1015 M-1). PoniewaŜ łańcuch kwasu walerianowego w cząsteczce biotyny nie jest istotny dla wiązania z awidyną (streptawidyną), moŜe być wykorzystany w celu przyłączania do innych biomolekuł. Z kolei awidyna (streptawidyna) moŜe być sprzęgnięta z innymi biomolekułami bądź znacznikami. W ten sposób moŜna doprowadzać do ściśle zaplanowanych kontaktów biomolekuł (normalnie nie oddziaływujących ze sobą) za pośrednictwem „przegubu” awidyna-biotyna. PoniewaŜ cząsteczka awidyny (steptawidyny) ma cztery miejsca wiąŜące biotynę, metodę moŜna stosować wielowymiarowo, a w dziedzinie wykrywania związków biologicznych moŜliwa jest amplifikacja generowanych sygnałów. Ogólny schemat zasady tych technologii wraz z listą najwaŜniejszych zastosowań przedstawiono na rys. 6-16. Rysunek 6-16: Schemat oraz typy zastosowań bioanalitycznych i biopreparatywnych układu awidyna-biotyna. (Zaczerpnięto z pozycji 5 literatury uzupełniającej). 24 6.6. Podstawowe reakcje modyfikacji reszt aminokwasowych białek 6.6.1. Modyfikacja grup aminowych Amidynacja przy uŜyciu imidoestrów NH. HCl R NH2 + C2H5O C NH.HCl R' R NH C R' + C2H5OH (reakcja 1) Reakcja ta zachodzi w łagodnych warunkach, w środowisku nieznacznie alkalicznym. Powstająca amidyna ma dodatni ładunek elektryczny, tak jak wyjściowa grupa aminowa. Nie następuje zatem zaburzenie oddziaływań elektrostatycznych w makrocząsteczce białka, co ogranicza niebezpieczeństwo niepoŜądanych zmian konformacyjnych, które mogłyby towarzyszyć modyfikacji i prowadzić do denaturacji białka czy zmian w jego rozpuszczalności. Przykładowy przepis: Białko (10 mg/ml) rozpuszcza się w 0, 2 M roztworze chlorowodorku trietanoloaminy pH 8,5 w temperaturze pokojowej. Bezpośrednio przed uŜyciem rozpuszcza się w tym samym buforze chlorowodorek imidooctanu etylu do stęŜenia 0,4 M i doprowadza się pH do wartości 8,5. Równe objętości obu roztworów miesza się i pozostawia mieszaninę na 2 h. Zmodyfikowane białko izoluje się przez dializę i ewentualną liofilizację. Reakcję amidynacji moŜna prowadzić w obecności 6 M chlorowodorku guanidyny. W trakcie hydrolizy kwasowej (dla celów analizy składu aminokwasowego) zamidynowanego białka zachodzi częściowa regeneracja grup aminowych. Dlatego najlepszym sposobem oszacowania stopnia modyfikacji jest oznaczanie pozostałych reszt aminowych przez miareczkowanie kwasem trinitrobenzenosulfonowym (patrz niŜej) albo zastosowanie do modyfikacji odczynnika wyznakowanego radioizotopem. 25 Nie są znane wystarczająco łagodne sposoby "odwrócenia" amidynacji, tj. usunięcia grup amidynowych połączonego z regeneracją grup aminowych w warunkach, niedestrukcyjnych dla struktury białka. Ugrupowanie imidoestrowe umieszczono w wielu odczynnikach dwufunkcyjnych, stosowanych do wytwarzania wiązań krzyŜowych w białkach. Innym specjalistycznym zastosowaniem imidoestrów były próby wykorzystania ich własności chelatowania metali do wytwarzania izomorficznych pochodnych zawierających metal cięŜki dla celów badań metodą dyfrakcji promieni X. Guanidynacja przy uŜyciu O-metyloizomocznika NH2+ R NH2 + H2N NH2+ pH>9,5 R NH C C + CH3OH NH2 OCH3 (reakcja 2) W wyniku tej reakcji reszty lizynowe ulegają przekształceniu w reszty homoargininy, zachowujące dodatni ładunek. Modyfikację prowadzi się w środowisku alkalicznym, przy pH powyŜej 9,5. Stopień modyfikacji oznaczyć moŜna poprzez analizę aminokwasową kwaśnego hydrolizatu białka, gdyŜ homoarginina jest stabilna w warunkach standardowej kwaśnej hydrolizy. Grupy α-aminowe ulegają tej modyfikacji trudniej niŜ grupy ε-aminowe lizyny. JeŜeli białko zawiera grupy cysteinowe, ulegają one metylacji pod wpływem Ometyloizomocznika z prędkością porównywalną z reakcją grup aminowych. Przykładowy przepis: Wodny roztwór białka (10 mg/ml) miesza się w temperaturze 4 °C z równą objętością 1 M roztworu O-metyloizomocznika doprowadzonego do pH 9,5 za pomocą NaOH. Modyfikację prowadzi się przez 4-5 dni w temperaturze 4 °C po czym próbkę dializuje się względem wychłodzonej wody. Jeśli modyfikacja reszt lizyny okazuje się niekompletna, w kolejnych próbach trzeba podnieść temperaturę inkubacji (np. do 25 °C) lub pH (np. do 10,5-11 przy 4 °C). 26 Redukcyjna metylacja przy uŜyciu formaldehydu i borowodorku sodu R NH2 + _HO 2 HCHO R + H2O N CH2 NaBH4 R NH CH3 (reakcja 3) _HO 2 R NH CH3 + R HCHO + H2O + N CH2 NaBH4 R N(CH3)2 CH3 (reakcja 4) Ta selektywna alkilacja grup aminowych zachodzi w środowisku alkalicznym. Modyfikacji ulegają zarówno grupy α-aminowe jak i ε-aminowe. Ładunek cząsteczki białka zostaje zachowany a własności fizyczne białka zmodyfikowanego są na ogół bardzo podobne do własności białka natywnego. Przykładowy przepis: Białko (ok. 3 mg/ml) rozpuszcza się w 0,2 M buforze boranowym pH 9,0. Do 2 ml tego roztworu, w temperaturze 0 °C dodaje się 50 µl świeŜo sporządzonego roztworu NaBH4 (40 mg/ml). Następnie dodaje się w pięciominutowych odstępach pięć kolejnych porcji po 1 µl 18 % wodnego roztworu formaldehydu. Na koniec, tj. po 30 minutach, próbkę dializuje się względem wody w temperaturze 4 °C i ewentualnie liofilizuje. Jeśli analiza składu aminokwasowego dowodzi niekompletnej modyfikacji reszt lizyny, zmodyfikowane białko ponownie rozpuszcza się w buforze pH 9,0 i powtarza procedurę. Aby osiągnąć maksymalną modyfikację grup aminowych w białku natywnym, konieczne jest czasem przeprowadzenie kilku takich cykli. Jeśli zachowanie natywnej struktury nie jest konieczne, reakcję moŜna prowadzić w obecności 6 M chlorowodorku guanidyny. Do modyfikacji moŜna zastosować formaldehyd znakowany trytem lub izotopem węgla 14C, co ułatwi późniejszą analizę produktu. 27 Karbamylacja przy uŜyciu cyjanianu R O H2N CH C O pH>6 + HNCO H2N R C NH CH CO (reakcja 5) Podobnie jak cztery następne rodzaje modyfikacji, reakcja ta prowadzi do otrzymania z dodatnich grup aminowych ich pochodnych pozbawionych ładunku elektrycznego. MoŜe to powodować zmiany w strukturze białka wskutek zaburzenia normalnych oddziaływań elektrostatycznych. Cyjanian reaguje z grupami α-aminowymi i ε-aminowymi, a ponadto z grupami sulfhydrylowymi, imidazolowymi i fenolowymi. Jednak tylko pochodne grup aminowych są trwałe w środowisku alkalicznym. Przykładowy przepis: Białko (10 mg/ml) rozpuszcza się w 0,5 M buforze boranowym pH 8,8 (ewentualnie zawierającym 4 M chlorowodorek guanidyny). Dodaje się stały KCNO do stęŜenia 0,5 M, a następnie mieszaninę przetrzymuje się w temperaturze 30 °C przez 24 h. Próbkę dializuje się względem 0,005 M NH4HCO3, po czym liofilizuje. Stopień modyfikacji określić moŜna albo stosując do modyfikacji [14C]cyjanian albo, dla analizy modyfikacji reszt lizynowych, przez oznaczenie zawartości homocytruliny w kwaśnym hydrolizacie białka. PoniewaŜ w trakcie hydrolizy kwasowej homocytrulina powoli przekształca się w lizynę, karbamylowane białko trzeba hydrolizować przez róŜny czas (np. 24 h i 48 h) i ekstrapolować wyniki oznaczeń do czasu zerowego. Modyfikacja cyjanianami jest jedną ze standardowych metod analizy grup N-końcowych w białkach. Łatwo zachodząca karbamylacja reszt tyrozyny (reakcja 6) moŜe być monitorowana spektrofotometrycznie przy 278 nm (∆ε=1145 M-1cm-1). 28 O _ O O C NH2 HNCO _ + H2O CH2 OH CH2 NH CH CO NH CH CO (reakcja 6) Regeneracja tyrozyny następuje powoli w roztworach wodnych, z prędkością rosnącą wraz ze wzrostem pH. Karbamylowana tyrozyna szybko rozkłada się w środowisku o odczynie obojętnym oraz w obecności 1 M hydroksyloaminy. Acetylacja przy uŜyciu bezwodnika octowego O C R CH3 NH2 + O C O pH>7 R NH C CH3 + CH3COO- + H+ CH3 O (reakcja 7) Reakcja bezwodnika octowego z białkami w roztworze w połowie wysyconym octanem sodu jest stosunkowo specyficzna wobec grup aminowych. Wprawdzie grupy fenolowe tyrozyny teŜ ulegają acetylacji, ale w warunkach alkalicznych O-acetylotyrozyna szybko hydrolizuje. Ponadto tyrozynę łatwo zregenerować przez krótkie działanie hydroksyloaminą. W umiarkowanie alkalicznym pH względna reaktywność homologicznych amin zaleŜy od stopnia ich protonacji. Wysoka wartość pKa warunkuje niŜszą prędkość reakcji. ObniŜanie pH faworyzuje przeto reakcję grup o niŜszej wartości pKa i daje w wyniku niŜszy ogólny stopień modyfikacji. Oczywiście stopień modyfikacji zaleŜy od ilości dodanego odczynnika i moŜe być zwiększany przez dodawanie jego nadmiaru. Przykładowy przepis: Roztwór białka (najlepiej, choć nie koniecznie, w wysokim stęŜeniu 2 – 10 %) miesza się z równą objętością nasyconego roztworu octanu sodu. Mieszaninę schładza się na 29 łaźni lodowej i traktuje bezwodnikiem octowym w całkowitej ilości w przybliŜeniu równej masie uŜytego białka. Ilość tę dodaje się w 3-6 porcjach w ciągu 1 h w temperaturze 0 °C. Przykładowo, na 10 mg białka w 0,1 ml wody dodaje się 0,1 ml nasyconego octanu sodu, a następnie pięć razy po 2 µl bezwodnika octowego. Zmodyfikowane białko oczyszcza się przez dializę lub filtrację Ŝelową. Acylacja przy uŜyciu estrów N-hydroksybursztynoimidu O O O O R NH2 + C R' C N R' O O R + N OH NH O (reakcja 8) N-hydroksybursztynoimid (NHS) jest powszechnie stosowany do aktywacji grup karboksylowych, a zatem do otrzymywania reaktywnych odczynników acylujących. Kwas karboksylowy poddaje się estryfikacji NHS w środowisku niewodnym w obecności nierozpuszczalnych w wodzie karbodiimidów, takich jak np. dicykloheksylokarbodiimid. Estry NHS reagują z nukleofilami dając zacylowany produkt i uwalniając resztę NHS. Reakcja estrów NHS z grupami sulfhydrylowymi lub hydroksylowymi nie daje trwałych koniugatów, gdyŜ utworzone wiązania tioestrowe i estrowe hydrolizują w środowisku wodnym. Jeszcze szybciej hydrolizuje zacylowana histydyna. Natomiast pierwszorzędowe i drugorzędowe aminy dają bardzo trwałe produkty o charakterze amidów lub imin. Estry NHS mają czas połowicznego rozkładu rzędu kilku godzin w warunkach fizjologicznych. Jednak prędkość hydrolizy, tak jak i reaktywność grup aminowych, wzrasta z podwyŜszeniem pH. W temperaturze 0 °C i w pH 7 czas półtrwania estru NHS wynosi 4-5 h, w 25 °C i pH 8,0 spada do 1 h, a w 4 °C i pH 8,6 wynosi juŜ tylko 10 minut. Prędkość hydrolizy moŜna monitorować, mierząc wzrost absorbancji przy 260 nm (∆ε = 8200 M-1cm-1). 30 Trifluoroacetylacja O R NH2 + F3C C O pH 10 S C2H5 R NH C CF3 + C2H5SH (reakcja 9) Jest to odwracalne blokowanie grup aminowych, które znalazło zastosowanie w celu ograniczania hydrolizy łańcuchów polipeptydowych przez trypsynę wyłącznie do wiązań peptydowych utworzonych przez argininę. Reakcja z kwasem 2,4,6-trinitrobenenosulfonowym _ SO3 R NH2 + O2N R NH pH>7 O2N NO2 NO2 + _ HSO3 NO2 NO2 (reakcja 10) Kwas 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowy (TNBS) jest wygodnym odczynnikiem, pozwalającym na oznaczenie grup aminowych w peptydach i białkach. TNBS reaguje zarówno z grupami αaminowymi jak i ε-aminowymi, a ponadto z grupami sulfhydrylowymi. W warunkach alkalicznych pochodna grup tiolowych jest nietrwała. Jeśli białko nie zawiera grup tiolowych, albo moŜna je odpowiednio zablokować, spektrofotometryczne badanie kinetyki reakcji z TNBS dostarcza informacji o liczbie grup aminowych oraz o ich reaktywności. PoniewaŜ trinitrofenylowe pochodne są trwałe w warunkach hydrolizy kwasowej, wyniki modyfikacji moŜna dodatkowo sprawdzić na drodze standardowej analizy składu aminokwasowego. TNBS tworzy addukty z siarczynem, drugim produktem arylacji (rys. 6-17). Rysunek 6-17: Przyłączanie siarczynu do TNBS. Tworzenie tych kompleksów wpływa na widmo absorpcyjne trinitrofenylowych pochodnych aminokwasów. Opisana poniŜej procedura oznaczania grup aminowych polega na pomiarze 31 przy 367 nm (ε = 11000 M-1cm-1), w izozbestycznym punkcie trinitrofenylolizyny i jej siarczynowego kompleksu. Inna wersja metody wykorzystuje wyŜszy współczynnik absorpcji kompleksu siarczynowego przy 420 nm. Przykładowy przepis: Białko ( 2mg/ml) rozpuszcza się w buforze boranowym (0,05 M Na2B4O7 doprowadzonym do pH 9,5 za pomocą 0,05 M NaOH). Sporządza się teŜ świeŜy roztwór TNBS (7,2 mg/ml w wodzie, ok. 0,02 M). Do kuwety spektrofotometrycznej, stanowiącej odniesienie, odmierza się 1 ml buforu boranowego, a do drugiej kuwety – 1 ml roztworu białka w buforze. Do kaŜdej kuwety dodaje się po 100 µl roztworu TNBS. RóŜnicę pomiędzy absorbancją (przy 367 nm) obu kuwet rejestruje się w funkcji czasu, przez 1-4 h. Stopień modyfikacji oblicza się w oparciu o molowy współczynnik absorbancji ε = 11000 M-1cm-1. Precyzyjny pomiar kinetyczny wymaga termostatowania kuwet. Uwaga: Niektóre handlowe preparaty TNBS nie są zadowalające pod względem czystości. Dlatego trzeba je rekrystalizować przez zawieszenie stałego preparatu w równej objętości wody i rozpuszczenie przez ogrzewanie. Następnie dodaje się HCl do stęŜenia 5 M i schładza roztwór. Wypadające białe kryształy przemywa się na filtrze zimnym 1 M HCl i suszy pod próŜnią nad pięciotlenkiem fosforu. Produkt, o temperaturze topnienia 189-192 °C, jest trihydratem. Niektóre z reszt aminowych białek natywnych nie reagują z TNBS w opisanych wyŜej warunkach. Całkowitą trinitrofenylację moŜna na ogół w takich przypadkach osiągnąć, prowadząc reakcję w obecności 4-6 M chlorowodorku guanidyny. Bursztynylacja O O O _ pH>7 R NH2 + R NH C CH2 CH2 C O O (reakcja 11) 32 O + H+ Reakcja grup aminowych białek z bezwodnikiem bursztynowym, podobnie jak z innymi bezwodnikami kwasów dikarboksylowych, prowadzi do otrzymania pochodnych karboksylowych, naładowanych ujemnie. Tym samym na kaŜdą zmodyfikowaną grupę przypada zmiana ładunku elektrycznego o dwie jednostki. Prowadzi to do zasadniczych zmian w globalnych oddziaływaniach elektrostatycznych w makrocząsteczce, co pociągać za sobą moŜe znaczne zmiany konformacyjne. Reakcja z bezwodnikiem bursztynowym zachodzi w umiarkowanie alkalicznym środowisku. Oprócz grup α-aminowych i ε-aminowych, z bezwodnikiem bursztynowym reagują reszty tyrozyny, histydyny, cysteiny, seryny i treoniny. Pochodna tyrozyny hydrolizuje spontanicznie w środowisku alkalicznym, a w roztworze o odczynie neutralnym jest szybko rozkładana przez hydroksyloaminę. Pochodna histydyny jest prawdopodobnie bardzo nietrwała. WraŜliwość wszystkich pochodnych o charakterze estrów na działanie hydroksyloaminy przy pH 10,0 umoŜliwia uzyskiwanie preparatów białek, których modyfikacja praktycznie ograniczona jest do grup α-aminowych i ε-aminowych. Jeśli poŜądana jest całkowicie selektywna modyfikacja grup aminowych, naleŜy wcześniej przeprowadzić grupy sulfhydrylowe oraz mostki disiarczkowe w stabilne pochodne. W przeciwnym razie będą one naraŜone na reakcje utleniania oraz wymiany tiol-disiarczek w warunkach, stosowanych do rozszczepiania estrów bursztynylowych. Przykładowy przepis: Do intensywnie mieszanego roztworu białka lub jego odpowiedniej pochodnej (ewentualnie zawierającego 5 M chlorowodorek guanidyny) o pH 8,0 dodaje się w małych porcjach stały bezwodnik bursztynowy w ilości 50 moli na 1 mol grup aminowych. Cały czas utrzymuje się pH wokół wartości 8,0 przez dodawanie 1 M NaOH. Po dodaniu całkowitej ilości bezwodnika, do mieszaniny dodaje się stały chlorowodorek hydroksyloaminy do stęŜenia 1 M, doprowadza się pH do wartości 10,0 i odstawia próbkę na 1 h w temperaturze pokojowej. Zmodyfikowane białko oczyszcza się przez dializę lub filtrację Ŝelową. Przykładowa analiza stopnia modyfikacji reszt lizynowych moŜe opierać się na dinitrofenylacji niezmodyfikowanych reszt i ich oznaczeniu po całkowitej kwaśnej hydrolizie białka. 33 Reakcja z bezwodnikiem bursztynowym wykorzystywana była do dysocjacji oligomerycznych białek na podjednostki, do solubilizacji białek oraz do ograniczania zakresu hydrolizy łańcuchów polipeptydowych przez trypsynę. Maleilacja i pokrewne typy modyfikacji O O _ R NH2 + O OH R NH C _ O C O CH CH H+ _ R NH3+ + H2O O C CH O C CH _ O O O _ OH H2O (reakcja 12) Bezwodnik maleinowy reaguje z białkami w sposób zasadniczo podobny jak bezwodnik bursztynowy. Jednak produkty reakcji róŜnią się od pochodnych bursztynylowych o wiele większą podatnością na hydrolizę. Produkt reakcji bezwodnika maleinowego z grupami aminowymi jest trwały w neutralnym pH ale szybko hydrolizuje po zakwaszeniu do pH 3,5. Czas połowicznej hydrolizy ε-maleilolizyny wynosi około 11 h w tym pH w temperaturze 37 °C . Jest to zatem wygodny sposób odwracalnej modyfikacji grup aminowych. Jednak oprócz tych grup z bezwodnikiem maleinowym reagują jeszcze inne reszty aminokwasowe. Produkty reakcji z grupami imidazolowymi histydyny oraz grupami fenolowymi tyrozyny są bardzo nietrwałe i łatwo rozpadają się z regeneracją grup oryginalnych. Jedynie produkty modyfikacji grup tiolowych cysteiny oraz grup hydroksylowych seryny i treoniny są trwałe. Reszty seryny i treoniny moŜna odblokować przez działanie 0,5 M hydroksyloaminą pH 8,3-8,4 przez 18 h. W tych warunkach grupy Nmaleilowe są trwałe. NaleŜy jednak pamiętać o reakcjach samej hydroksyloaminy z pewnymi białkami (np. rozszczepianiu wiązań Asn-Gly). Reakcja bezwodnika maleinowego z grupami sulfhydrylowymi przebiega podobnie do znanej reakcji tych grup z N-etylomaleimidem (patrz niŜej). Powstaje S-bursztynylocysteina, która jest trwała w warunkach kwaśnej hydrolizy, stosowanej w celu analizy składu aminokwasowego białka. Jeśli zatem badane białko zawiera grupy sulfhydrylowe, trzeba je odwracalnie zablokować w celu osiągnięcia swoistości maleilacji grup aminowych. 34 Przykładowy przepis: Białko rozpuszcza się w odpowiednim, niereaktywnym buforze (np. 0,2 M fosforanie pH 9,0) do stęŜenia 5-10 mg/ml. Jeśli wymagana jest kompletna reakcja wszystkich grup aminowych, moŜe okazać się konieczne dodanie czynnika denaturującego: 8 M mocznika lub 6 M chlorowodorku guanidyny. Roztwór schładza się do 0-2°C na łaźni lodowej i utrzymuje się tę temperaturę przez cały czas prowadzenia modyfikacji. Stały bezwodnik maleinowy (najlepiej oczyszczony przez sublimację lub przez rekrystalizację z chloroformu) dodaje się w małych ilościach do roztworu białka, który miesza się w sposób ciągły i utrzymuje jego pH w zakresie 8,5-9,0 przez dodawanie 4 M NaOH (lub stałego węglanu sodu, jeśli rozcieńczanie roztworu jest niepoŜądane). W tych warunkach bezwodnik maleinowy rozpuszcza się powoli, przeto prędkość dodawania porcji stałego odczynnika określona jest przez prędkość ich roztwarzania w mieszaninie reakcyjnej. Końcowe stęŜenie odczynnika zasadniczo powinno mieścić się w zakresie 0,03 M do 0,1 M, choć właściwie naleŜy przeprowadzić wstępne badanie minimalnej ilości odczynnika, która pozwala osiągnąć poŜądany stopień modyfikacji (pozwoli to zminimalizować niepoŜądaną reakcję odczynnika z grupami serylowymi i treoninowymi). Gdy brak konsumpcji zasady sodowej wskaŜe na koniec reakcji (zwykle 5 minut po ostatnim dodatku odczynnika), białko poddaje się ewentualnej procedurze usuwania grup O-maleilowych z reszt seryny i treoniny (0,5 M chlorowodorek hydroksyloaminy pH 8,3-8,4; 18 h w temperaturze pokojowej) a następnie dializie względem buforu obojętnego lub lekko alkalicznego w celu dalszych studiów nad zmodyfikowanym białkiem, lub demaleilacji w buforze kwaśnym. W tym ostatnim celu białko moŜna przedializować względem buforu o pH 3-3,5 (np. 0,01-0,1 M pirydyna doprowadzona do pH kwasem octowym) w temperaturze 37 °C przez co najmniej 11 godzin, albo zakwasić lodowatym kwasem octowym do pH 3-3,5 i mieszać przez równie długi czas w temperaturze 37 °C. Całkowitą liczbę reszt maleilowych wprowadzonych do białka moŜna najwygodniej oznaczyć, jeśli stosuje się odczynnik podstawiony radioaktywnym izotopem. W przeciwnym razie moŜna zastosować oznaczenie spektrofotometryczne, wykorzystując fakt, Ŝe Nmaleilacji towarzyszy wzrost absorbancji przy 250 nm (∆ε = 3360 M-1cm-1 w 0,1 M NaOH). W przypadku tworzenia estrów seryny i treoniny wzrost ten jest niŜszy. 35 Odwracalna modyfikacja grup aminowych bezwodnikiem maleinowym lub spokrewnionymi odczynnikami (patrz niŜej) jest szeroko stosowany w celach: (a) ograniczania zakresu trawienia łańcuchów polipeptydowych przez trypsynę, (b) badań nad efektami strukturalnymi obniŜania lub podwyŜszania ładunku białek, (c) dysocjacji oligomerycznych białek na podjednostki, (d) solubilizacji białek lub peptydów o ograniczonej rozpuszczalności oraz (e) ochrony grup aminowych przed modyfikacją przez inne odczynniki. Bursztynylacja białek moŜe być korzystniejsza od maleilacji, jeśli odblokowywanie grup aminowych nie jest planowane. Szereg innych bezwodników kwasów dikarboksylowych z mniejszym lub większym powodzeniem stosowano do odwracalnej modyfikacji grup aminowych, zwykle biorąc pod uwagę korzystnie warunki regeneracji grup aminowych. Wzory strukturalne niektórych z nich przedstawiono na rys. 6-18. Rysunek 6-18: Wzory strukturalne bezwodników kwasów dikarboksylowych, stosowanych do odwracalnej modyfikacji grup aminowych w białkach. Modyfikacji przy uŜyciu tych odczynników ulegają zarówno grupy α- jak i ε-aminowe. Acylowe pochodne tyrozyny spontanicznie hydrolizują w łagodnych alkalicznych warunkach. Powstają niewielkie ilości stabilnych acylowych pochodnych seryny i treoniny. MoŜna je ilościowo rozłoŜyć przez działanie 1 M NH2OH w pH 8,2 w temperaturze 25 °C przez 2 h. Olefinowe odczynniki alkilują grupy sulfhydrylowe, dając trwałe pochodne. Szczególne cechy reakcji tych bezwodników z grupami aminowymi i jej odwracalności podano w tabeli 6-2. 36 Tabela 6-2: Charakterystyka reakcji grup aminowych z niektórymi bezwodnikami kwasów dikarboksylowych. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------Bezwodnik Charakterystyka reakcji ------------------------------------------------------------------------------------------------------------Tworzą się dwie izomeryczne ε-acylowe pochodne lizyny, 2-Metylomaleinowy róŜniące się pKa. Czas ich rozpadu w pH 2 i w temperaturze 20°C wynosi 20 minut. 2,3-Dimetylomaleinowy Czas rozpadu ε-acylowych pochodnych lizyny w pH 3,5 i w temperaturze 20 °C jest krótszy niŜ 3 minuty. Ekso-cis-3,6-endokso-∆4Dwie izomeryczne ε-acylowe pochodne lizyny tworzą się z tą tetrahydroftalowy samą prędkością. Czas ich rozpadu w pH 3 w temperaturze 25°C wynosi 4-5 h. Ekso-cis-3,6-endokso-∆4Taki sam czas rozpadu ε-acylowych pochodnych lizyny. heksahydroftalowy Odczynnik ten nie alkiluje grup sulfhydrylowych! Tetrafluorobursztynowy ε-Acylowa pochodna lizyny szybko hydrolizuje w pH 9,5 w temperaturze 0 °C. ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 6.6.2. Modyfikacja grup karboksylowych Sprzęganie z nukleofilami za pośrednictwem karbodiimidów Grupy karboksylowe moŜna przekształcić w amidy lub inne pochodne przez dwustopniową reakcję z udziałem rozpuszczalnych w wodzie karbodiimidów. W pierwszym etapie tworzy się bardzo reaktywny związek pośredni: O-acyloizomocznik (reakcja 13). O R C O _ + + H3N R' R" N C N O R"' R pH~5 (reakcja 13) 37 C NH R' R' O R N C O C _ H N + O + H+ R + NH R' C O C NH R" R" (reakcja 14) O R + NH R' C O O + HX C R C NH R' + O X NH R" + H+ C NH R" (reakcja 15) O R O + NH R' C O R C C O + H+ NR" C NH R" NH R' (reakcja 16) W roztworze wodnym ta aktywna pochodna grupy karboksylowej ulegać moŜe róŜnym reakcjom: powolnej hydrolizie, kondensacji z aminą z utworzeniem amidu (reakcja 14), kondensacji z innymi nukleofilami z utworzeniem róŜnych pochodnych grupy karboksylowej (reakcja 15) lub przekształceniu w trwały N-acylomocznik (reakcja 16). Ilościowe względem grup kaboksylowych przyłączenie aminy (lub innego nukelofilu) następuje tylko w obecności jej (jego) duŜego nadmiaru w mieszaninie reakcyjnej. W razie nieobecności aminy (nukleofilu), powstaje N-acylomocznik oraz inne słabo zdefiniowane pochodne grupy karboksylowej. Mogą się nawet tworzyć wewnątrzcząsteczkowe mostki pomiędzy grupami karboksylowymi i aminowymi. Karbodiimidy reagują teŜ grupami fenolowymi tyrozyny oraz grupami sulfhydrylowymi cysteiny. Tyrozynę moŜna zregenerować przez działanie 0,5 M hydroksyloaminą w pH 7 i 38 temperaturze 25 °C przez 5 h. Nie znaleziono natomiast zadowalającej metody regeneracji grup sulfhydrylowych. Najczęściej stosowanym do modyfikacji białek rozpuszczalnym w wodzie karbodiimidem jest chlorowodorek 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (EDC). Przykładowy przepis: Białko (10 mg/ml) i chlorowodorek glicynamidu (jako przykładowy nukleofil) rozpuszcza się w wodzie (ewentualnie z 6 M chlorowodorkiem guanidyny) w temperaturze pokojowej i doprowadza pH roztworu do wartości 4,75 za pomocą 1 M HCl. Dodaje się EDC w postaci stałej tak, aby osiągnąć jego końcowe stęŜenie 0,1 M. reakcje prowadzi się przez 1 h, utrzymując pH przez dodawanie 1 M HCl. Na koniec dodaje się równą objętość 1 M buforu octanowo-sodowego pH 4,75 w celu zablokowanie nadmiaru karbodiimidu. Białko oczyszcza się przez staranną dializę. Przy odpowiednim doborze nukleofilu i zastosowaniu jego nadmiaru, modyfikacja pozwala na łatwe oznaczenie liczby grup karboksylowych, które uległy reakcji, a jeśli w mieszaninie reakcyjnej obecny był denaturant – właściwie całkowitej liczby grup karboksylowych w białku. W podanym powyŜej przykładzie białko poddaje się kwaśnej hydrolizie i oznacza zawartość glicyny na drodze standardowej analizy składu aminokwasowego. RóŜnica pomiędzy otrzymanym wynikiem a zawartością glicyny w białku natywnym określa liczbę zmodyfikowanych grup karboksylowych. Analiza jest znacznie łatwiejsza, jeśli uŜyje się do modyfikacji nukleofil znakowany radioizotopem, np. 14C. Reakcję amidacji grup karboksylowych w obecności karbodiimidów moŜna teŜ przeprowadzić w buforze MES o pH 5-6. Jeszcze inną wersją jest dodatek do mieszaniny reakcyjnej N-hydroksybursztynoimidu (NHS). Bardzo reaktywny ester kwasu karboksylowego z NHS, który moŜna uwaŜać za zaktywowaną formę grupy karboksylowej, tworzy się in situ i natychmiast reaguje z nukelofilem. NHS pełni zatem w tym przypadku funkcję efektywnego katalizatora całej reakcji. 6.6.3. Modyfikacja grup sulfhydrylowych Alkilacja przy uŜyciu kwasu jodooctowego i pokrewnych związków Kwasy chlorowcooctowe oraz ich amidy reagują w róŜnych warunkach z grupami sulfhydrylowymi (reakcja 17), imidazolowymi (reakcja 18), tioeterowymi (reakcja 19) oraz aminowymi (reakcja 20). W tych reakcjach nukleofilowego podstawienia reaktywność maleje 39 R _ S + ICH2COO _ pH>7 _ R S CH2COO + I _ (reakcja 17) _ CH2COO N R + ICH2COO _ N pH>5,5 + I R _ + H+ N N H (reakcja 18) _ R S + ICH2COO _ pH 2-8,5 R + S CH2COO + I _ CH3 CH3 (reakcja 19) R NH2 + ICH2COO _ pH>8,5 _ R NH CH2COO _ + I + H+ (reakcja 20) w szeregu I > Br > Cl >> F. Do modyfikacji białek nadają się kwasy jodooctowy i bromooctowy. Ich amidy wykazują niekiedy wyŜszą reaktywność względem białek niŜ wolne kwasy, na ogół jednak oba te typy odczynnika stosować moŜna wymiennie. Pamiętać przy tym naleŜy o moŜliwych konsekwencjach zmiany oddziaływań elektrostatycznych w cząsteczce białka wskutek wprowadzenia dodatkowych grup ujemnych w przypadku uŜycia wolnego kwasu. WaŜną reakcją konkurencyjną względem modyfikacji białka jest hydroliza odczynnika. Spośród grup nukleofilowych, występujących w białkach i zdolnych do reakcji z kwasem jodooctowym i bromooctowym, grupy sulfhydrylowe są zdecydowanie najbardziej reaktywne. Prędkość reakcji rośnie ze wzrostem pH, gdyŜ reaktywną formą grupy jest anion. NaleŜy jednak unikać zbyt wysokiego pH, aby uniknąć niepoŜądanej reakcji z grupami aminowymi. Dlatego najlepiej prowadzić reakcje w środowisku o pH w pobliŜu obojętnego. 40 Zarówno modyfikacja białka jak i jego izolacja z mieszaniny reakcyjnej, powinny być prowadzone w ciemności, w celu uniknięcia powstawania jodu, który mógłby modyfikować reszty tyrozyny i histydyny. W warunkach denaturujących, reaktywność grup sulfhydrylowych w białkach jest podobna do reaktywności drobnocząsteczkowych tioli. Natomiast w natywnych białkach obserwuje się zmienną reaktywność grup sulfhydrylowych, w zaleŜności od ich mikrootoczenia, np. wpływu sąsiednich grup. Często obserwuje się hiperreaktywność grup tiolowych w centrach aktywnych enzymów. S-Karboksymetylocysteina jest stabilna w warunkach konwencjonalnej kwaśnej hydrolizy stosowanej w celu analizy składu aminokwasowego białek. Oznaczenie stopnia modyfikacji upraszcza się w razie zastosowania kwasu [14C]jodooctowego. Karboksymetylacja za pomocą kwasu jodooctowego lub karboksyamidometylacja przy uŜyciu jodoacetamidu, po wcześniejszej redukcji mostków disiarczkowych nadmiarem odpowiedniego tiolu, to powszechnie stosowana metoda przekształcania wszystkich obecnych w białku reszt „pół-cystyny” w trwałe pochodne, przydane dla rozmaitych celów analitycznych. Reakcja prowadzona jest w łagodnych warunkach (pH około 8). Aby nie dopuścić do reakcji z innymi nukleofilowymi grupami, naleŜy dodać stechiometryczną ilość czynnika alkilującego lub co najwyŜej jego nieznaczny (np. 10 %) nadmiar. Jeśli nie oddziela się odczynnika redukującego przed dodaniem jodoacetamidu, zasada ta odnosi się do ilości grup sulfhydrylowych reduktora. Przykładowy przepis: W szklanej, zamykanej probówce wirówkowej, przedmuchiwanej azotem, umieszcza się 5-100 mg liofilizowanego białka, 3,61 g dejonizowanego, krystalicznego mocznika, 0,3 ml roztworu EDTA (50 mg soli dwusodowej EDTA na 1 ml), 3 ml buforu Tris-HCl pH 8,6 (5,23 g Tris i 9 ml 1 M HCl rozcieńczone do 30 ml wodą) i na koniec 0,1 ml merkaptoetanolu. Roztwór rozcieńcza się do 7,5 ml i odpowietrza strumieniem azotu przez kilka minut. Probówkę zamyka się i odstawia na 4 h w temperaturze pokojowej (22-25 °C). Następnie dodaje się świeŜo sporządzony roztwór 0,268 g rekrystalizowanego kwasu jodooctowego w 1 ml 1 M NaOH. Ilość jodooctanu powinna być prawie równa ilości merkaptoetanolu (molowo). Zarówno reakcję alkilacji jak i izolację zmodyfikowanego białka prowadzić naleŜy w ciemności. Białko izoluje się przez intensywną dializę lub filtrację Ŝelową, oraz końcową liofilizację. 41 Reakcja z N-etylomaleimidem H O R SH + NC2H5 O H pH>5 NC2H5 R O S H O (reakcja 21) N-Etylomaleimid (NEM) jest jednym z najczęściej uŜywanych odczynników do modyfikacji grup sulfhydrylowych białek. Stosuje się go do badania wpływu modyfikacji na aktywność a takŜe do oznaczania liczby grup sulfhydrylowych w białku. Oprócz grup sulfhydrylowych, z odczynnikiem tym reagują równieŜ grupy aminowe. NEM na szerokie pasmo absorpcyjne z maksimum przy 300-305 nm (ε = 620 M-1cm-1), które wykorzystać moŜna do oznaczania grup sulfhydrylwyoch w stęŜeniach powyŜej 0,1 mM. Typowe warunki reakcji w tego typu zastosowaniach to obojętny lub lekko alkaliczny bufor (0,1 M bufor fosforanowo-sodowy pH 7,0 lub 0,1 M trietanolamina pH 7,7) ewentualnie zawierający czynnik denaturujący (5 M chlorowodorek guanidyny lub 2 % dodecylosiarczan sodu) oraz 1 mM NEM. Rejestruje się spadek absorbancji, zachodzący wskutek konsumpcji NEM przez grupy sulfhydrylowe białka. PoniewaŜ w tej reakcji addycji do podwójnego wiązania NEM najaktywniejszą formą jest anion tiolanowy, prędkość reakcji wzrasta przy podwyŜszaniu pH. NEM jest specyficzny względem grup sulfhydrylowych w pH poniŜej 7. W pH 7 jego reakcja z prostymi tiolami jest 1000-krotnie szybsza niŜ z odpowiednimi aminami. W wyŜszym pH reakcja z aminami staje się znacząca. Drugorzędowe grupy aminowe proliny reagują z NEM szybciej niŜ grupy pierwszorzędowe. Grupy imidazolowe histydyny reagują wolno z NEM, ale tylko w stosunkowo drastycznych warunkach. W środowisku alkalicznym NEM powoli hydrolizuje do kwasu N-etylomaleinowego, ale w pH 7,0 ta reakcja jest zbyt wolna, aby mogła przeszkadzać w reakcji z grupami sulfhydrylowymi. W kwaśnej hydrolizie, stosowanej dla celów analizy składu aminokwasowego białka, zmodyfikowana NEM cysteina przekształca się w S-(2-bursztynylo)cysteinę , a zmodyfikowana lizyna w ε,N-(2-bursztynylo)lizynę. Obie mogą być oznaczone przez standardowy analizator aminokwasowy. 42 [14C]NEM stosowany jest do znakowania białek oraz w celu uproszczenia oznaczania stopnia modyfikacji. Aminoetylacja przy uŜyciu etylenoiminy R SH + CH2 pH 8,9 R NH S CH2CH2NH2 CH2 (reakcja 22) Etylenoimina (azyrydyna) reaguje z grupami sulfhydrylowymi, przekształcając reszty cysteiny w S-(2-aminoetylo)cysteinę. W łagodnych warunkach, które normalnie stosuje się w celu przeprowadzenia tej reakcji, nie reagują Ŝadne inne grupy występujące w białkach. W środowisku kwaśnym powoli reagują reszty metioniny, dając jon S-(2-aminoetylo)metioninosulfoniowy. Aminoetylocysteina przypomina budową lizynę. Dlatego reakcja ta jest powszechnie stosowana w celu wprowadzania do białek nowych punktów trawienia przez trypsynę. Aminoetylocysteinę moŜna oznaczyć na drodze standardowej analizy aminokwasowej kwaśnego hydrolizatu białka. Przekształcenie grup sulfhydrylowych w pochodne S-sulfenylotiosiarczanowe R SH + S4O6= R S S _ SO3 + S2O3= + H+ (reakcja 23) Wysoka reaktywność grup sulfhydrylowych jest powaŜną przeszkoda przy próbach selektywnej modyfikacji innych reszt aminokwasowych w białkach, które zawierają grupy tiolowe. Jednym z moŜliwych rozwiązań tych problemów moŜe być odwracalne blokowanie grup sulfhydrylwych w natywnych białkach przy uŜyciu tetrationianu (reakcja 19). Grupy sulfhydrylowe regeneruje się przez redukcję. Przykładowy przepis: Białko (1 µmol) rozpuszcza się w 5 ml 0,02 M buforu fosforanowo-sodowego pH 7,0 zawierającego 0,001 M EDTA i 35 mg tetrationianu sodu (Na2S4O6·2H2O). Po 60 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej próbkę przepuszcza się przez kolumnę 43 z Ŝelem Sephadex G-25 (ok. 1,5 x 40 cm) zrównowaŜoną 0,02 M buforem fosforanowym z EDTA (pH 7) w celu usunięcia nadmiaru odczynnika. Grupy tiolowe regeneruje się doprowadzając pH próbki do 7,6, dodając 2-merkaptoetanol do stęŜenia 0,1 M i inkubując w temperaturze 37 °C przez 15 minut. S-Sulfenylotiosiarczanowa pochodna białka moŜe być przechowywana przez czas dłuŜszy w obecności 0,001 M tetrationianu sodu. Zaznaczyć naleŜy, Ŝe omawiana reakcja zachodzi w białkach natywnych. Z wolnej cysteiny pod wpływem nadmiaru tetrationianu tworzy się S-sulfocysteina. Modyfikacja przy uŜyciu odczynnika Ellmana R R _ S + ON 2 S S S S NO2 _ OOC NO2 _ COO + _ COO _ S NO2 _ COO (reakcja 24) Kwas 5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoesowy) (DTNB) został wprowadzony przez Ellmana (1959) w celu spektrofotometrycznego oznaczania grup sulfhydrylowych w białkach. Metoda ta zyskała wielką popularność. Ciągły pomiar kinetyki narastania absorbancji przy 412 nm (ε = 13 600 M-1cm-1) pozwala na wykrywanie róŜnic we względnej reaktywności grup sulfhydrylowych w białku. Produkt reakcji, o charakterze mieszanego disiarczku, moŜna teŜ wykorzystać jako związek pośredni do otrzymywania innych uŜytecznych pochodnych cysteiny. Modyfikacja przy uŜyciu disiarczku 2,2’-dipirydylu N R SH + N S S S S R + S N N H (reakcja 25) 44 Odczynnik ten reaguje w sposób analogiczny do reakcji odczynnika Ellmana. Uwalniana grupa, pirydyno-2-tion, ma silne pasmo absorpcyjne z maksimum przy 343 nm (∆ε = 8080 M-1cm-1), co pozwala na ciągłe monitorowanie reakcji modyfikacji grup sulfhydrylowych. Disiarczek 2,2’-dipirydylu jest współcześnie szeroko stosowany do odwracalnego blokowania grup sulfhydrylowych w białkach, a takŜe do aktywacji grup sulfhydrylowych w celu dalszego sprzęgania z innymi tiolami. Mieszany disiarczek, utworzony w wyniku modyfikacji, moŜna rozszczepić nadmiarem odczynnika redukującego, takiego jak ditiotreitol lub 2-merkaptoetanol. isiarczek 2,2’-dipirydylu jest słabo rozpuszczalny w wodzie, dlatego jego roztwory trzeba sporządzać w rozpuszczalnikach organicznych (np. w acetonie) i dodawać do roztworu białka w objętości, jeszcze nie powodującej denaturacji. Reakcja ze związkami rtęci HgCl R R S Hg SH + + HCl COOH COOH (reakcja 26) Związki rtęci, w tym organiczne takie jak kwas p-chlorortęciobezoesowy (PCMB), reagują z grupami sulfhydrylowymi białek szybko i specyficznie. W normalnych warunkach reakcji (pH ok. 5) zwykle Ŝadne inne grupy białka nie ulegają modyfikacji pod wpływem tych odczynników. Reakcje te są szeroko stosowane do oznaczania grup sulfhydrylowych białek, do badania wpływu modyfikacji reszt cysteiny na aktywność biologiczną oraz do otrzymywania izomorficznych kryształów pochodnych białek z wbudowaną rtęcią dla celów analizy rentgenostrukturalnej. Organiczne związki rtęci silnie absorbują ultrafiolet. Jon PMB ma współczynnik molowy absorpcji 17 000 M-1cm-1 przy 223 nm, który wzrasta do 22 000 M-1cm-1 po utworzeniu adduktu z grupą tiolową. Największa róŜnica współczynników absorpcji występuje jednak przy 250-255 nm (∆ε = 7600 M-1cm-1). Oznaczenie wykonuje się zwykle przez miareczkowanie. Jeśli roztwór PCM miareczkuje się roztworem badanego białka, obserwuje się liniowy przyrost absorbancji przy 255 nm aŜ do momentu, w którym cały odczynnik został skonsumowany wskutek reakcji z grupami sulfhydrylowymi baiłka. Od tego punktu 45 absorbancja utrzymuje się na stałym poziomie. Jeśli dysponujemy ograniczoną ilością białka, miareczkowanie wykonuje się w sposób odwrotny. W obu przypadkach absorbancję mierzyć naleŜy względem odpowiedniej kuwety odnośnikowej (w pierwszej z wymienionych metod oznacza to kontrolne miareczkowanie białkiem samego buforu). 6.6.4. Modyfikacja reszt argininy Modyfikacja przy uŜyciu 1,2-cykloheksanodionu H O NH R NH C R + NH2 N 0,2 M NaOH N O + H2O N O H (reakcja 27) 1,2-Cyklohekasondion specyficznie modyfikuje reszty argininy w środowisku silnie alkalicznym (0,2 M NaOH), dając jeden produkt (reakcja 27). Przy nieco niŜszym stęŜeniu wodorotlenku sodu (0,05-0,1 M) powstają dwa dodatkowe produkty. Te warunki reakcji są jednak zbyt drastyczne dla większości białek. W mniej alkalicznych warunkach (pH 11-12) 1,2-cykloheksanodion reaguje zarówno z grupami guanidynowymi jak i aminowymi. NiepoŜądaną reakcję z grupami aminowymi moŜna łatwo śledzić, obserwując Ŝółknięcie mieszaniny reakcyjnej (maksimum absorbancji przy 440 nm), choć warunkujący tę barwę chromofor nie został jeszcze zidentyfikowany. Reakcja grup guanidynowych z 1,2cykloheksanodionem biegnie efektywnie w jeszcze niŜszym pH, w obecności buforu boranowego. Typowe warunki tej wersji modyfikacji białka to 0,2 M bufor boranowo-sodowy pH 8,0, 0,15 M 1,2-cykloheksanodion, inkubacja w temperaturze 37 °C, w ciemności, przez kilkanaście godzin. Obecność boranu w środowisku reakcyjnym zapewnia powstawanie pojedynczego produktu reakcji oraz moŜliwość regeneracji reszt argininy przez inkubację z 1 M hydroksylaminą pH 7,0 w temperaturze 37 °C, w ciemności, przez 12 h. Stopień modyfikacji ocenić moŜna przez oznaczenie reszt argininowych w białku na drodze standardowej analizy aminokwasowej, po kwaśnej hydrolizie białka (6 M HCl, 110 °C, 24 h) w obecności kwasu merkaptooctowego (20 µl na mg białka). Modyfikację przy uŜyciu 1,2-cykloheksanodionu moŜna zastosować do blokowania reszt argininy w peptydach w celu ograniczenia ich trawienia przez trypsynę do wiązań przy resztach lizyny. 46 Modyfikacja przy uŜyciu trimeru 2,3-butanodionu 2,3-butanedion (diacetyl) w słabo alkalicznych roztworach wodnych kondensuje dając trimer, który moŜna otrzymać w postaci krystalicznej (rys. 6-19). Rysunek 6-19: Trimeryzacja diacetylu. Odczynnik ten modyfikuje reszty argininy białek w roztworach o obojętnym pH. Natura powstającego produktu nie została dokładnie zbadana. O wiele wolniejsza reakcja grup aminowych z tym związkiem objawia się występowaniem silnej barwy (maksimum przy około 530 nm). W trakcie kwaśnej hydrolizy, poprzedzającej analizę aminokwasową białka, arginina nie jest regenerowana, dlatego ubytek zawartości argininy jest miarą stopnia modyfikacji. Modyfikacja przy uŜyciu fenyloglioksalu NH R NH C O + NH2 2 C O pH 7-8 C 25oC H H N R NH C O CH C NH O + H2O O (reakcja 28) W obojętnym pH fenyloglioksal reaguje z grupami guanidynowymi białek, dając produkt zawierający dwie reszty fenyloglioksalu na jedną resztę argininy. Dokładna struktura produktu nie jest znana; na schemacie reakcji 28 przedstawiono jedną z sugestii co do tej struktury. Czymkolwiek jest ta pochodna, jest trwała w lekko kwaśnym roztworze (poniŜej pH 4), co pozwala na izolację tak wyznakowanych peptydów po chemicznym lub enzymatycznym rozszczepianiu długich łańcuchów polipeptydowych. Pochodna powoli 47 rozkłada się w obojętnym lub lekko alkalicznym roztworze. Inkubacja zmodyfikowanego białka w takim roztworze (np. pH 8,0; 25 °C; 48 h) w nieobecności nadmiaru fenyloglioksalu pozwala na zregenerowanie większości reszt argininowych. Ta potencjalnie odwracalna modyfikacja reszt argininowych jest zarazem dość specyficzna. Stwierdzono, Ŝe w trakcie inkubacji białek z fenyloglioksalem zachodzi dodatkowo deaminacja grup N-terminalnych. Intensywne traktowanie tym odczynnikiem moŜe pociągnąć za sobą równieŜ reakcję reszt lizynowych. 6.6.5. Modyfikacja reszt tyrozyny Acetylacja przy uŜyciu N-acetyloimidazolu O C R CH3 N _ O + H+ + pH 7,5 N O R O C N CH3 + N H (reakcja 29) Podobnie jak bezwodnik octowy (patrz podrozdział 6.6.1), N-acetyloimidazol reaguje zarówno z grupami aminowymi jak i fenolowymi, jest jednak nieco bardziej selektywny wobec tyrozyny. W roztworze wodnym odczynnik łatwo hydrolizuje, zarówno w środowisku kwaśnym jak i zasadowym. Dlatego normalnie stosuje się go w pH około 7,5, w których to warunkach jest trwały. Typowe warunki reakcji to bufor boranowy (0,05 M) lub weronalowy (0,02 M) o tym pH i 60-krotny nadmiar molowy N-acetyloimidazolu względem białka. Acetylacji towarzyszy zmiana absorbancji przy 278 nm (∆ε = 1160 M-1cm-1), co pozwala na wygodne monitorowanie postępu reakcji oraz oszacowanie ostatecznego stopnia modyfikacji. O-Acetylotyrozyna hydrolizuje w umiarkowanie alkalicznym roztworze lub w obecności hydroksyloaminy . Przebieg deacylacji śledzić moŜna spektrofotometrycznie przy 278 nm. Specyficzność N-acetyloimidazolu, łagodne warunki reakcji, jej odwracalność oraz moŜliwość jej ciągłego monitorowania spektrofotometrycznego decydują o szerokim 48 zastosowaniu tego odczynnika do badania dystrybucji „ukrytych” i „wyeksponowanych” reszt tyrozyny w białkach. Nitrowanie R _ O + C(NO2)4 _ O R _ + C(NO2)3 + H+ NO2 (reakcja 30) Nitrowanie tyrozyny pod wpływem tetranitrometanu (TNM) zachodzi w łagodnych warunkach i jest stosunkowo specyficzne. Mechanizm reakcji zilustrowano na rys. 6-20. Rysunek 6-20: Mechanizm reakcji tetranitrometanu z grupami fenolowymi. Utleniające warunki reakcji powodują szybkie utlenianie grup sulfhydrylwoych, które na ogół moŜna jednak zregenerować przez działanie nadmiarem drobnocząsteczkowego tiolu. W niektórych białkach obserwowano utlenianie reszt metioniny pod wpływem TNM, chociaŜ reakcja taka nie zachodziła z wolną metioniną. TNM reaguje równieŜ z resztami tryptofanowymi oraz histydynowymi. Ostatnie trzy z wymienionych reakcji „ubocznych” zachodzić mogą przy wysokich stęŜeniach TNM i/lub w pH powyŜej 8. WaŜną komplikacją modyfikacji białek przy uŜyciu TNM jest wewnątrz- i międzycząsteczkowe sieciowanie. Jest to zrozumiałe w świetle wolnorodnikowego mechanizmu reakcji (rys. 6-20). Przykładowy przepis: Białko (2-4 mg/ml) rozpuszcza się w 0,1 M buforze fosforanowo-potasowym pH 7, zawierającym 1 mM EDTA. Przygotowuje się 0,15 M roztwór TNM w 95 % etanolu i dodaje się do roztworu białka do końcowego stęŜenia TNM 0,003 M (20 µl na 1 ml próbki białka). Po 60 minutach reakcję kończy się przez dodanie 50 µl 1 M 2-merkaptoetanolu, po czym natychmiast dializuje się próbkę wobec 1 % NH4HCO3 w temperaturze 4 °C. Na koniec białko liofilizuje się. 49 W roztworze alkalicznym 3-nitrotyrozyna ma silne pasmo absorpcyjne z maksimum przy 428 nm (ε = 4100 M-1cm-1), które po zakwaszeniu przesuwa się do 360 nm (ε = 2790 M-1cm-1). Punkt izozbestyczny przypada na 381 nm (ε = 2200 M-1cm-1). Te spektralne własności 3nitrotyrozyny pozwalają na oznaczanie stopnia modyfikacji białka pod wpływem TNM. Przed takimi pomiarami naleŜy jednak usunąć (np. przez dializę) silnie zabarwiony jon nitromrówczanowy, który tworzy się w trakcie reakcji. Pojawianie się tego jonu w trakcie modyfikacji uniemoŜliwia niestety ciągłe spektrofotometryczne monitorowanie jej przebiegu. 3-Nitrotyrozyna jest trwała w warunkach kwaśnej hydrolizy, stosowanej w celu oznaczania składu aminokwasowego białek. Widmo absorpcyjne 3-nitrotyrozyny jest wraŜliwe na polarność mikrootoczenia, a takŜe wykazuje znaczącą aktywność optyczną w długofalowym pasmie absorpcyjnym. Tym samym reszty nitrotyorzyny moŜna wykorzystać jako sondy zmian konformacyjnych białka oraz jego oddziaływań z innymi biomolekułami. Dowolna perturbacja wartości pKa reszty 3nitrotyrozyny moŜe być łatwo wykryta spektrofotometrycznie. 3-Nitrotyrozyna ma pKa 6,8-7,0, a zatem w rozwtorze obojętnym jest nieco silniej zjonizowana niŜ tyrozyna. 3-Nitrotyrozynę moŜna łatwo zredukować do 3-aminotyrozyny przy uŜyciu niskich stęŜeń wodorosiarczynu sodu (Na2S2O4). W pochodnej tej pKa grupy fenolowej (10,1) jest podobne jak w tyrozynie, a pKa grupy aminowej wynosi tylko 4,7. Pozwala to na przeprowadzenie szeregu dodatkowych modyfikacji, opartych na własnościach chemicznych aryloamin, a moŜliwych do przeprowadzenia w pH niŜszym niŜ to, w których naturalne grupy aminowe są reaktywne. 3-Aminotyrozyna jest trwała w warunkach kwaśnej hydrolizy i moŜe być oznaczana przez automatyczny analizator aminokwasów. Jodowanie Jodowanie jest jednym z najpopularniejszych sposobów modyfikacji reszt tyrozyny w białkach. Prowadzone w łagodnych warunkach stosowane było z powodzeniem do detekcji reszt zlokalizowanych w aktywnych centrach enzymów, badań zróŜnicowanej reaktywności reszt tyrozyny w białkach, wprowadzania cięŜkiego atomu do białek dla celów badań strukturalnych prowadzonych metodami dyfrakcji promieni X oraz do znakowania białek radioizotopami jodu. Ten ostatni rodzaj zastosowań omawiany był poprzednio (podrozdział 6.5.5). Schemat reakcji jodowania, uwzględniający powstawanie reaktywnej formy jodu oraz jej reakcję z resztami tyrozyny oraz histydyny przedstawiono na rys. 6-13. Tworzą się zarówno 50 mono- jak i dijodopochodne tych aminokwasów. Ponadto w normalnych warunkach jodowania modyfikacji ulegają grupy sulfhydrylowe z utworzeniem „trwałych” jodków sulfenylu (RSI). Wymienione reakcje są typu substytucji. Ponadto zachodzą reakcje typu utleniania, z udziałem reszt metioninowych, cysteinowych i tryprofanowych. Reakcje substytucji przewaŜają w roztworach alkalicznych, reakcje utleniania – w roztworach kwaśnych. 6.6.6. Modyfikacja reszt tryptofanu Utlenianie przy uŜyciu N-bromobursztynoimidu Utlenianie białek N-bromobursztynoimidem (NBS) powoduje rozszczepienie łańcucha polipeptydowego przy resztach tryptofanu i tyrozyny (rys. 6-21). Rysunek 6-21: Rozszczepianie łańcucha polipeptydowego pod wpływem Nbromobursztynoimidu. Reakcja z resztami tyrozyny biegnie wolniej niŜ z resztami tryptofanu, a analogiczna reakcja z resztami histydyny juŜ bardzo wolno. Jako efektywny czynnik utleniający, NBS utlenia grupy sulfhydrylowe z prędkością znacznie przekraczającą prędkość reakcji z tryptofanem. Reszty metioniny i cystyny równieŜ mogą ulegać utlenianiu. Modyfikację białek przy uŜyciu NBS prowadzi się w kwaśnym środowisku, zwykle w buforze octanowym lub mrówczanowym pH 4,0. W małych peptydach zuŜywanych jest tylko1,5 równowaŜnika NBS na rozszczepione wiązanie, ale w białkach, wskutek reakcji bocznych, potrzeba aŜ 3-6 równowaŜników. Reakcji towarzyszy spadek absorbancji przy 280 nm i o wiele mocniejszy wzrost absorbancji przy 261 nm. Te zmiany absorbancji wykorzystywano do oznaczania liczby reszt tryptofanu w białkach. Reakcję z NBS stosowano równieŜ do badań nad dostępnością i reaktywnością reszt tryptofanu w białkach. Alkilacja przy uŜyciu bromku 2-hydroksy-5-nitrobenzylu 51 O2N R pH<7,5 O2N CH2Br + R + HBr NH O NH H OH (reakcja 31) Bromek 2-hydroksy-5-nitrobenzylu (HNBB), zwany teŜ odczynnikiem Koshlanda I, reaguje w roztworze obojętnym i kwaśnym z resztami tryptofanowymi białek. W tych warunkach biegnie teŜ reakcja z resztami cysteinowymi, ale z prędkością pięć razy niŜszą. W alkalicznych warunkach odczynnik ten moŜe takŜe reagować z resztami tyrozyny. Wysoka reaktywność HNBB wynika z rezonansowej stabilizacji powstającego z dysocjacji tego odczynnika jonu karboniowego (rys. 6-22). Reakcja HNBB z N-acetylotryptofanem daje trzy produkty (rys. 6-23). Rysunek 6-22: Reaktywna forma odczynnika Koshlanda I. Rysunek 6-23: Produkty reakcji odczynnika Koshlanda I z N-acetylotrypofanem. Przykładowy przepis: HNBB rozpuszcza się w acetonie lub dioksanie do stęŜenia 0,2 M i szybko miesza się z wodnym roztworem białka. Końcowe stęŜenie acetonu lub dioksanu ma wynosić 5 % a stęŜenie HNBB 0,01 M. Daje to układ jednofazowy, nie denaturujący większości białek. Odczynnik naleŜy rozpuścić w rozpuszczalniku organicznym bezpośrednio przed uŜyciem. W czasie reakcji pH spada, przeto powinno być utrzymywane przez dodatki zasady. Początkowa niska wartość pH jest korzystna, ale nie niezbędna dla reakcji (wyŜsze pH sprzyja reakcjom reszt cysteiny i tyrozyny). Zalecana wartość pH wynosi 3-5. Liczba zmodyfikowanych reszt tryptofanowych w danym białku moŜe być jednak zmienna nawet w tak wąskich granicach. Zmodyfikowane białko izoluje się z mieszaniny reakcyjnej przez dializę lub filtrację Ŝelową. Reakcję z HNBB moŜna wykorzystać do ilościowego oznaczenia tryptofanu w białkach. Procedura jest bardzo prosta i polega na mierzeniu absorbancji przy 410 nm po modyfikacji białka za pomocą HNBB i oddzieleniu zhydrolizowanego odczynnika. Dla roztworów o pH 52 powyŜej 10 naleŜy zastosować molowy współczynnik absorbancji 18 000 M-1cm-1. Reszt cysteiny nie przeszkadzają w tym oznaczeniu. HNBB okazał się ponadto uŜyteczny w oznaczaniu względnej dostępności reszt tryptofanu w białkach oraz w badaniach nad wpływem modyfikacji tych reszt na aktywność biologiczną białek. MoŜe ponadto być zastosowany jako sonda struktury białka, gdyŜ jego widmo jest wraŜliwe na zmiany cech lokalnego otoczenia, zwłaszcza pH. Pokrewny związek. bromek 2-metoksy-5-nitrobenzylu (odczynnik Koshlanda II) jest znacznie mniej reaktywny. Reaguje z tryptofanem, cysteiną i metioniną w roztworach o odczynie obojętnym lub kwaśnym, lecz z mniejszą prędkością niŜ HNBB. Jego własności spektralne są bardzo wraŜliwe na zmiany polarności mikrootoczenia, ale nie jego pH. Był stosowany jako niewraŜliwa na zmiany pH „grupa reporterowa” do śledzenia zmian konformacyjnych białek. 6.6.7. Modyfikacja reszt histydyny Acylacja przy uŜyciu dietylopirowęglanu Dietylopirowęglan, czyli bezwodnik kwasu etoksymrówkowego, hydrolizuje w wodzie (w pH 6,0 czas półtrwania wynosi 7 minut), dając po dwa równowaŜniki etanolu i jonu wodorowęglanowego. W pH 6-7 reaguje zasadniczo tylko z grupami imidazolowymi (reakcja 32) oraz aminowymi (reakcja 33). H O N R N C N + O CH2 CH3 O C pH 4-7 O R N C OCH2CH3 + CH3CH2OH + CO2 O CH2 CH3 O (reakcja 32) O C R NH2 + O CH2 CH3 O pH 4-7 R NH C O C O CH2 CH3 O (reakcja 33) 53 OCH2CH3 + CH3CH2OH + CO2 Nie stwierdzono reakcji z grupami sulfhydrylowymi ani alifatycznymi grupami hydroksylowymi. Znacząca acylacja reszt tyrozynowych moŜe zachodzić dopiero w pH powyŜej 7. Reakcji dietylopirowęglanu z grupami imidazolowymi białek towarzyszy wzrost absorbancji przy 230-240 nm, co moŜna wykorzystać do spektrofotometrycznego oznaczania stopnia modyfikacji (∆ε = 3200 M-1cm-1 przy 242 nm). Modyfikacja jest zasadniczo odwracalna, gdyŜ produkt reakcji moŜna rozłoŜyć z odtworzeniem reszt histydyny inkubując białko z 0,5 M hydroksyloaminą pH 7,5 przez co najmniej 3 h. Alkilacja przy uŜyciu kwasu jodooctowego Jeśli białko nie zawiera grup sulfhydrylowych, to jednym z najlepszych sposobów specyficznej modyfikacji jego reszt histydynowych jest acylacja za pomocą kwasów chlorowcooctowych lub ich amidów, najlepiej kwasem jodooctowym (reakcja 18) lub jodoacetamidem. Reakcja zachodzi począwszy od pH 5,5, ale w pH powyŜej 7 do głosu dojść moŜe konkurencyjna reakcja z grupami aminowymi. W wyniku reakcji powstają pochodne pojedynczo podstawione przy atomie N-1 lub N-3 pierścienia imidazolowego oraz pochodna podstawiona podwójnie, przy obu atomach azotu (rys. 6-24). Rysunek 6-24: Produkty acylacji histydyny pod wpływem kwasu jodooctowego. 6.6.8. Modyfikacja reszt metioniny Alkilacja pod wpływem kwasy jodooctowego lub jodoacetamidu Alkilacja reszt metioniny przez kwas jodooctowy (reakcja 19) lub jodoacetamid nie zaleŜy od pH, w odróŜnieniu od reakcji tych odczynników z grupami nukleofilowymi, które wykazują silną zaleŜność od pH, gdyŜ prędkość reakcji uwarunkowana jest stęŜeniem niesprotonowanej formy nukleofilu. Przy niskim pH, poniŜej 4,0, gdy inne nukleofile są sprotonowane, modyfikacja kwasem jodooctowym (jodoacetamidem) moŜe być całkiem specyficzna wobec metioniny. Produkt reakcji, kation S-karboksymetylometionylo-sulfoniowy, ulega rozkładowi w trakcie standardowej kwaśnej hydrolizy dla celów analizy aminokwasowej, ale trzy produkty tego rozkładu: S-karboksymetylohomocysteina, lakton homoseryny oraz metionina są łatwo oznaczalne tą metodą. 54 6.7. Literatura 6.7.1. Literatura źródłowa 1. Glazer, A. N., Delange R. J., Sigman D. S.: Chemical modification of proteins. Selected methods and analytical procedures, North-Holland Publishing Company, Amsterdam, 1975. 2. Imoto T., Yamada H.: Chemical modification. W: Protein function. A practical approach, red: Creighton T. E., str. 279-316, IRL Press, Oxford, 1997. 3. Kozik A., Guevara I., śak Z.: 1,2-Cyclohexanedione modification of arginine residues in egg-white riboflavin-binding protein. Int. J. Biochem. 20, 707-711 (1988). 4. Means G. E., Feeney, R. E.: Chemical modification of proteins. Holden-Day, San Francisco, 1971. 5. Ray W. J. Jr., Koshland D. E. Jr.: A method for characterizing the type and numbers of groups involved in enzyme action. J. Biol. Chem. 236, 1973-1979 (1961). 6. Tsou C.-L.: Relation between modification of functional groups of proteins and their biological activity. I. A graphical method for the determination of the number and type of essential groups. Sci Sin. 11, 1535-1558 (1962). 6.7.2. Literatura uzupełniająca 1. Colman R. F.: Affinity labeling. W: Protein function. A practical approach. Red.: T.E. Creighton. str. 155-183, IRL Press, Oxford, 1997. 2. Hermanson G. T.: Bioconjugate techniques, Academic Press, San Diego, 1996. 3. Kluger R.: Chemical cross-linking and protein function. W: Protein function. A practical approach. Red.: T.E. Creighton. str. 185-213, IRL Press, Oxford, 1997. 4. Kozik A., Rapała-Kozik M., Guevara-Lora I.: Analiza instrumentalna w biochemii. Wybrane problemy i metody instrumentalnej biochemii analitycznej, rozdz. 3: Spektroskopia fluorescencji (spektrofluorymetria), Seria Wydawnicza IBM UJ, Kraków, 2001. 5. Kozik A.: Zastosowania immobilizowanych białek w biotechnologii i biochemii analitycznej. Seria Wydawnicza IBM UJ, Kraków, 1999. 6. Lakowicz j. R.: Principles of fluorescence spectroscopy, Wyd. 2, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, 1999. 7. Avidin-biotin technology. Methods in Enzymology, Tom 184. Red.: M. Wilchek i E.A. Bayer. Academic Press, San Diego, 1997. 55 56
