MODYFIKACJA

MODYFIKACJA
FIZYCZNA I
CHEMICZNA
BIAŁEK
Denaturacja
Denaturacją białka możemy przeprowadzić metodami
fizycznymi lub chemicznymi, zmian w strukturze białka,
które prowadza do mniejszej lub większej utraty
aktywności biologicznej białka, przy czym jego struktura
pierwszorzędowa nie zostaje zmieniona. Podczas
denaturacji w dużej mierze zniszczeniu ulegają wiązania
wodorowe, a w obecności odczynników redukcyjnych
rozszczepieniu ulegają wiązania disiarkowego. Często
denaturacja jest odwracalna i po usunięciu czynnika
denaturującego białko wraca do pierwotnej postaci.
Proces ten nazywa się renaturacją. Renaturacja jest też
możliwa w przypadku denaturacji redukcyjnej. Podczas
denaturacji zachodzą takie zmiany jak: zmniejszenie
rozpuszczalności, może się w wyniku wyeksponowania
nowych zjonizowanych grup przesunąć pH punktu
izoelektrycznego. Rozwinięcie łańcucha może prowadzić
do zwiększenia się lepkości, a także absorpcji w
nadfiolecie. Obserwuje się też procesy agregacji i
wytrącania, co jest związane z ze zmianą stopnia
hydratacji i rozpuszczalności białek, a także zmianami w
mostkach disiarkowych.
• Fizycznymi metodami denaturacji białek
są:
Silne mieszanie, ogrzewanie, naświetlanie
promieniami UV, rentgenowskimi lub działanie
ultradźwiękami.
• Denaturacja chemiczna zachodzi pod
wpływem takich związków jak:
Roztwór mocznika (6-8 mol/dm3) lub guanidyny
(4 mol/dm3), na skutek działania kwasów lub
zasad (pH poniżej 3 lub powyżej 9), na skutek
działania detergentów, roztworów soli ciężkich
lub niektórych substancji organicznych takich
jak: aceton, benzen, formaldehyd, benzyna.
Poszczególne białka różnią się zdolnością do
denaturacji.
Hydroliza
• Hydroliza białek polega na depolimeryzacji białek na
poszczególne aminokwasy. Hydrolizę białek można
przeprowadzać na trzy sposoby: pod wpływem kwasu,
zasady lub enzymu.
Hydroliza kwasowa polega na ogrzewaniu białka w
roztworze HCl o stężeniu 2 mol lub roztworze H2SO4 o
stężeniu 4 mol przez 18-24 h. Jednak w warunkach tych
całkowitemu rozkładowi ulega tryptofan.
Podczas hydrolizy zasadowej najczęściej ogrzewa się
białko z NaOH o stężeniu 2 mol. Metoda ta jest
praktycznie nie stosowana, ponieważ zupełnie niszczy
argininę, cysteinę i treoninę.
Najlepszą metodą hydrolizy białek jest hydroliza
enzymatyczna, gdyż zniszczeniu nie ulegają żadne
aminokwasy. Wadą tej metody jest powolność procesu, a
co za tym idzie długi czas depolimeryzacji białka.
Metoda hydrolizy enzymatycznej znalazła zastosowanie
w określaniu sekwencji białek.
Reakcja plasteinowa
Kazeinę enzymatyczną wykorzystuje się do
przekształcania białek w reakcji polegającej na
amidowym wiązaniu pożądanych reszt aminokwasów do
peptydów hydrolizatu białkowego.
Za pomocą reakcji plasteinowej można z białka o
składzie ubogim z reszty aminokwasów niezbędnych
wytworzyć produkt o większej wartości biologicznej.
Można zmniejszyć gorzkość hydrolizatu przez „ukrycie”
hydrofobowych aminokwasów w długich peptydach
plastein. Stosując reakcję plasteinową katalizowaną
papainą wobec dietylowego estru kwasu glutaminowego
można około dwukrotnie zmniejszyć gorzkość hydrolizatu
z krwinek.
Schemat technologiczny otrzymywanie plastein.
Reakcje katalizowane
transglutaminazą
Transglutaminaza katalizuje reakcję przeniesienia acylu, w której donorem
jest grupa karboksyamidowa reszty glutaminy, a akceptorami mogą być
pierwszorzędowe grupy aminowe w różnych związkach.
Białko – (CH2)2 – CONH2 + H2N – R→transglutaminaza→ Białko – (CH2)2
– CONHR + NH3
Białko – (CH2)2 – CONH2 + H2N – (CH2)4 – Białko→transglutaminaza→
Białko – (CH2)2 – CONH(CH2)4 – Białko + NH3
Białko – (CH2)2 – CONH2 + H2O →transglutaminaza→ Białko – (CH2)2 –
COOH + NH3
Jeśli akceptorem jest wolny aminokwas, następuje wzbogacenie białka o ten
aminokwas, natomiast reakcja z grupą aminową reszty lizyny związanej w
białku powoduje sieciowanie. Istnieje również możliwość deaminacji reszt
glutaminowych, jeśli w nieobecności wolnych grup aminowych acylu jest
woda.
Alkilowanie
Reakcje z grupami karbonylowymi wykorzystuje się do
modyfikowania białek. Aldehydy glutarowy i mrówkowy
służą do wiązania enzymów na nośnikach. Traktowanie
aldehydem mrówkowym zapobiega nadmiernej hydrolizie
i deaminacji białek.
W reakcjach z innymi związkami karbonylowymi
wytwarzanie w swerze przez bakterie kwasu mlekowego
tworzą się inne pochodne. W kąpielach do utwardzania
włókien przy teksturowaniu biełek roślinnych stosuje się
róne aldehydy, np. skrobię dialdehydową.
Reakcje z aldehydami i cukrami redukującymi, w
warunkach redukujących wykorzystuje się do alkilowania
białek.
Do alkilowania grup aminowych, hydroksylowych,
imidazolowych, tiulowych i tioeterowych w resztach
aminokwasów służą również reakcje z kwasami
chlorowcooctowymi lub chlorowcoacetamidami.
Reakcje z polisacharydami
Kowalencyjne wiązanie z odpowiednim polisacharydem
może znacznie polepszyć właściwości funkcjonalne
białek. Produkt reakcji Maillarda miedzy aminowymi
grupami reszt lizyny i redukującą grupą polisacharydu
otrzymywany podczas 2-tygodniowego inkubowania
mieszaniny suszonej albuminy jaj z galaktomannanem
ma właściwości jako emulgator niż wyjściowe białko.
W kompleksach z agarem, furcelaranem, karageniną,
kwasami alginowymi i karboksymetylocelulozą występują
wiązania jonowe, natomiast obojętne polisacharydy
tworzą z białkami wiązania wodorowe i hydrofobowe.
Reakcje białek z polisacharydami wykorzystuje się do
modyfikowania właściwości wielu przetworów
żywnościowych, frakcjonowania i strącania białek z
roztworów oraz do osadzania enzymów na nośnikach.
Acylowanie grup
nukleofilowych w bialkach
Szybkość acylowania zależy od własności czynnika acylującego i
grupy nukleofilowej, od pH środowiska, konformacji
acylowanego białka oraz od obecności inhibitorów. Najłatwiej
acylują się pierwszorzędowe grupy aminowe, zwłaszcza
aminowe grupy reszty lizyny, grupa fenolowa trozyny.
Jako czynnik acylujący stosuje się bezwodniki kwasowe w słabo
zasadowym środowisku lub inne pochodne dobrane do
charakteru wprowadzanej grupy. Przy wyborze czynnika
acylującego uwzględnia się szybkość i wydajność reakcji
głównej.
Poprzez acylowanie można zwiększyć lub zmniejszyć
hydrofobowność białka, zmienić pI, wzbogacić cząsteczkę w
reaktywne grupy funkcyjne lub pożądane reszty aminokwasowe
włańcuchach bocznych, spowodować dodatkowe usieciowanie i
zwiększyć zdolność wiązania jonów metali.
Reakcje z fosforanami
Fosforany w różnych warunkach środowiska
mogą reagować z białkami albo wpływać na
właściwości białek przez oddziaływanie na inne
składniki żywności. Maja duże zastosowanie jako
dodatki do żywności, mogą służyć jako dodatek
buforujący, podwyższający lub obniżający pH,
wiążące jony metali, zwiększyć zdolność białek
do emulgowania lipidów, stabilizujące białka w
roztworach lub koagulujące, zwiększyć
wodochłonność produktów mięsnych.
Fosforany, zwłaszcza polifosforany, wiążą się
elektrostatycznie z dodatnio naładowanymi
resztami aminokwasów. Grupy hydroksylowe,
dzięki wiązaniom wodorowym z cząsteczkami
wody, tworzą warstwę hydratacyjną
zapobiegającą koagulacji białek.
Modyfikacje potranslacyjne
I.
Obróbka proteolityczna odbywa się przy pomocy
enzymów zwanych peptydazami, które są
odpowiedzialne za cięcie łańcuchów
polipeptydowych na końcu łańcucha
(egzopeptydazy) lub w jego środku
(endopeptydazy). Większość tych enzymów jest
bardzo specyficzna - rozpoznają one miejsce
cięcia na podstawie sekwencji aminokwasowej.
Dobrym przykładem może posłużyć proinsulina,
której pierwotny łańcuch polipeptydowy jest
przecinany w określonych miejscach, następnie
dwa produkty są łączone za pomocą "mostków"
dwusiarczkowych.
Istnieje kilka innych przykładów obróbek
proteolitycznych:
• - aktywacja białka, poprzez wycięcie
niepotrzebnego fragmentu łańcucha
polipeptydowego
• - usunięcie sekwencji liderowych (fragmentów
łańcucha, które kierują białko do odpowiedniego
przedziału komórkowego)
• - w przypadku poliprotein płaszcza niektórych
wirusów - pocięcie na fragmenty, aktywuje każdy
z otrzymanych fragmentów
• - rzadko występujący splicing polipeptydowy
(podobnie jak obróbka preRNA) - wycinanie
fragmentów ze środka łańcucha
polipeptydowego
• - usuwanie pierwszego podstawnika (metioniny
lub formylometioniny) występujące u prawie
50% wszystkich białek
II.
N-acetylacja , N-formylacja, Nmetylacja są rodzajami modyfikacji
potranslacyjnych białek, w których
następuje przyłączenie do N-końca
łańcucha polipeptydowego grup
acetylowych (acetylacja), metylowych
(metylacja) lub metioniny (formylacja).
III.
Glikozylacja - w tym procesie następuje dołączenie
reszt cukrowcowych do białek (Np.: białek błonowych).
IV.
Hydroksylacja - w przypadku aminokwasów
proliny i lizyny - dołączenie grupy -OH
V.
Poli (ADP)-rybozylacja - dołączanie reszt
adeninowych.
VI.
Fosforylacja - aktywacja białka poprzez
dołączenie reszty fosforanowej przez specyficzne
enzymy - kinazy. Bardzo powszechnie
występujące wśród białek (Np.: czynniki
transkrypcyjne).
VII.
Defosforylacja - deaktywacja białka przez
usunięcie reszty fosforanowej przez specyficzne
enzymy - fosfatazy.
VII.
Ubikwitynacja - (u organizmów
Eukariotycznych) dołączenie innego białka ubikwityny powoduje, że białko jest
przeznaczone do degradacji. W procesie
ubikwitynacji są usuwane (degradowane) białka
źle sfałdowane, wadliwe oraz takie których
"życie" dobiegło końca. Czas półtrwania białka
jest zależny od rodzajów aminokwasów
występujących na jego N-końcu.