System Gen-Probe z gatunkowo specyficznymi sondami

Współczesne możliwości szybkiego
diagnozowania gruźlicy
Ewa Augustynowicz-Kopeć
Zakład Mikrobiologii
Instytut Gruźlicy i Chorób Płuc
Warszawa
Czego oczekują klinicyści od laboratoriów prątka ?
1. potwierdzenia metodami mikrobiologicznymi podejrzenia klinicznego
2. wykonania badania w najkrótszym czasie
wstępną diagnostykę
należy zakończyć po 2 dniach (bakterioskopia i badanie genetyczne)
pełną diagnostykę
• 21 dni identyfikacja gatunkowa
• 30 dni test lekooporności
ROZPORZĄDZENIE
MINISTRA ZDROWIA 1)
z dnia 25 marca 2014 r.
w sprawie biologicznych czynników chorobotwórczych podlegających zgłoszeniu,
wzorów formularzy zgłoszeń dodatnich wyników badań w kierunku biologicznych
czynników chorobotwórczych oraz okoliczności dokonywania zgłoszeń
Zał. nr 1 Wykaz czynników chorobotwórczych podlegających
zgłoszeniu
Różna specyficzność i czułość w wykrywaniu
prątkowania chorego
Bakterioskopia
•
•
•
•
10.000 komórek/ 1ml
Jakość próbki plwociny
ilość prątków
wykrywa około połowy wszystkich przypadków czynnej gruźlicy.
mniej przydatny u zakażonych HIV i dzieci
Hodowla (L-J)
Nowoczesne systemy
> 1.000 komórek / 1ml
> 500 komórek / 1ml min 100 kom żywych
Długi czas oczekiwania na wynik
Czas generacji prątków 24 h
Metody genetyczne
w hodowli wykrycie obecność DNA
M. tbc lub innych gatunków prątków
50-100 komórek / 1ml
Rekomendacja 3
Pneumonol. Alergol.81,4 2013
Na podstawie wyniku bakterioskopii nie można ani
potwierdzić ani wykluczyć rozpoznania gruźlicy
w dodatnim rozmazie mogą być obecne prątki
środowiskowe.
przy dodatnim rozmazie należy wykonać badanie
genetyczne
czułość metody około 45%
wg World Health Organization
(2012) Fact Sheet No. 104: Tuberculosis. Geneva: WHO
= TB
Co oznacza wynik rozmazu?
• AFB (-)
•
prątki nie obecne w wystarczającej liczbie , aby być widoczne pod
mikroskopem
•
silne podejrzeniu gruźlicy >niż trzy materiały zbierane i testowane w
różnych dniach
•
nie świadczy o braku prątkowania mała ilość bakterii potwierdzona
hodowlą
•
•
Chorzy HIV + postacie gruźlicy skąpopratkowe
zakażenie spowodowane innym czynnikiem etiologicznym niż prątki
Behr MA, Warren SA, Salamon H, et al. Transmission of Mycobacterium tuberculosis from patients smear-negative for acidfast bacilli. Lancet1999;353:
AFB + wynik 24 h
• Chory z aktywną postacią TB obficie
prątkujący – zalecane wykonanie badania
genetycznego
• pomocne w podejmowaniu decyzji o
włączeniu leczenia choremu
Metody genetyczne:
 mogą znacznie przyspieszyć diagnostykę gruźlicy płuc i postaci
pozapłucnych
 nie powinny nigdy zastępować innych metod powinny być ich
uzupełnieniem
 należy wykonywać je wyłącznie w zamkniętych systemach,
wyposażonych w kontrolę procesów amplifikacji
Gen-Probe
ProbeTec
GeneXpert-
– RNA 4h +opracowanie materiału
DNA 6h +opracowanie materiału
DNA 2h + R- RMP wstępny test
diagnostyczny TB MDR zalecenia WHO
PCR
(home-made ) brakuje kalibracji
nie rekomendowany do gruźlicy
wykrywanie obcego DNA
Testy genetyczne
• Najnowsze testy molekularne są bardzo proste w
•
•
•
•
•
wykonaniu
nie wymagają spełniania kryteriów laboratorium
molekularnego
Czułość zależna o wyniku AFB i Hodowli
Dodatni wynik 95-100% w przypadku pozytywnych
AFB i hodowli
40-60% ww przypadku ujemnych wyników AFB i
hodowli
Khandekar P et al. (1994) Evaluation of PCR based test for the detection of Mycobacterium tuberculosis
in coded sputum specimens. Indian J Med Res 100 167–71
RMP- R jako marker MDR -TB
• wg WHO RMP- R jako marker MDRTB
• Ale wartość predykcyjna wyniku dodatniego
testu przekracza 90% gdy
• częstość występowania RMP R przekracza 15%
co jest rzadkością w skali globalnej
• wynik pozytywnym wymaga testu
potwierdzającego
• mutacje rpoB Leu533Pro, Leu511Pro,
Asp516Tyr i His526Leu -mniej popularne, ich
częstość występowania może osiągnąć jednak
10 do 22%
• Oporność na RMP nie zawsze surogatem
oporność MDR
• Potrzeba szybkich testów na INH
•
Kurbatova EV et all. Rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis: susceptibility
to isoniazid and other anti-tuberculosis drugs. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2012
16:355–357
m2000 RealTime System
testów w kierunku HIV-1
i MTB na tej samej platformie
Abbott Introduces New Molecular Test to Aid in the Diagnosis of Tuberculosis October 08, 2014
Czy wykonując badania molekularnego nadal musimy
używać tradycyjnych metod?
• bezpośrednio w materiałach wykrywanie obecność M. tuberculosis i
markerów genetycznych lekooporności – RMP
• Potwierdzenie AFB + –chory poddany leczeniu
ALE
• hodowla i/lub AFB -MOTT -test genetyczny ujemny
• hodowla - identyfikacja M.tbc, test lekooporności
• hodowla -epidemiologiczne dochodzenia molekularne, śledzenie
transmisji , badanie kontaktów
Jakie są korzyści z badań molekularnych?
• Szybkość uzyskania wyniku - bezpośrednio z materiału od chorego ,
szybka identyfikacją szczepu prątków
• włączenie natychmiastowego leczenia przeciwprątkowego ,
izolację chorych ,zapobieganie transmisji, badanie kontaktów
•
Informacja w postaciach skąpoprątkowych ( gruźlica pozapłucna , u dzieci ) w
sytuacji kiedy konwencjonalne
•
testy są ujemne –np.z AFB (-) i hodowlą
Umożliwiają diagnostykę chorego z podejrzeniem TB w sytuacji ,
materiał został wysłany tylko na badanie hist pat
RAPORT WHO GRUŹLICA OPORNA NA LEKI 2013
Globalnie, 3,6% chorych TB
nowowykrytych
i 20,2%
wcześniej leczonych
ma
status MDR-TB
Na podstawie danych z 92
krajów zakłada się, że 9,6%
przypadków MDR-TB ma
postać XDR-TB.
Gruźlica lekooporna MDR i XDR na świecie
MDR-TB
XDR-TB
Federacja Rosyjska
Chiny
Indie
TDR TB
Peru
Płd. Afryka
~480.000 nowych przypadków MDR TB (3.6%)
45 000 XDR TB – 9.6 % wśród MDR TB
Raporty z XDR TB 58 krajów (2009r), 77 krajów (2011r) ,92 krajów w 2013
TDR TB – Iran – 15 chorych (2009 r), Indie-4 chorych (2012 r) Indie Hospital in Andheri
Dziecko z TDR (2013)
Koszt leczenia TB
$
500000
450000
554 000 $
400000
124000
zmniejszenie wydajności w
trakcie leczenia
350000
330000
300000
bezpośrednie koszty leczenia z
uwzględnieniem
250000
260 000 $
200000
150000
126000
Leczenie i diagnostyka
134000
Zarządzanie i opieka
100000
50000
Opieka domowa
17 000 $
Hospitalizacja
17000
0
DS-TB
leczenie 6-9 m-cy
MDR-TB
leczenie20-26 m-cy
XDR-TB
leczenie 32 m-ce
http://www.cdc.gov/nchhstp/newsroom 2015
Testy lekooporności
U chorych po raz pierwszy diagnozowanych w kierunku gruźlicy
należy wykonać badanie bakterioskopowe , molekularne, posiew na
pożywkach płynnych i stałych, identyfikację oraz test lekooporności
U chorych ze wznową gruźlicy należy uwzględnić możliwość
wystąpienia lekooporności prątków i poza badaniami wymienionymi
wykonać molekularny test w kierunku lekooporności
Rekomendacja 8
Pneumonol. Alergol.81,4 2013
MDR, XDR
• Testy lekooporności wykonywane na pożywkach
płynnych 5 – 18 dni (mediana 6,8) L-J 28 - 54
(mediana 29,1)
• Szczepy prątków gruźlicy zdiagnozowane w
laboratoriach regionalnych muszą być weryfikowane
w Krajowym Referencyjnym Laboratorium
GenoType
Zestawy do oznaczania lekooporności
 Lekooporności Mycobacterium tuberculosis complex z uzyskanej
hodowli lub próbki klinicznej AFB (+)
 GenoType MTBDRplus (wykrywanie mutacji odpowiedzialnych za oporność na
RMP i INH) Czas badania – 5 godzin
 GenoType MTBDRsl (wykrywanie mutacji odpowiedzialnych za oporność na
fluorochinolony, aminoglikozydy i etambutol) Czas badania – 5 godzin
Wyniki badań molekularnych lekooporności potwierdzone
konwencjonalnymi metodami
Dlaczego??
fenotyp lekooporności niewykrywany przez testy
molekularne
•
nie wszystkie mutacje powodujące oporność wykrywane w testach
•
mutacja na zewnątrz regionu badanego inne nieznane mechanizmy
oporności
•
niektóre mutacje powodują tzw niskie miano oporności np. chinolony lek
może być stosowany w wyższych dawkach
•
Sekwencjonowanie całego genomu -porównanie genomu szczepów
lekoopornych i wrażliwych wykrycie nowych mutacji
Zastosowanie testów molekularnych w diagnostyce TB
Wykrywanie
Lekooporność
Identyfikacja
Wykrycie obecności prątków
gruźlicy w badanym materiale
Wykrycie oporności na leki
przeciwprątkowe, np. INH, RMP
Identyfikacja gatunkowa prątków
Celem jest wykrycie sekwencji
specyficznych dla
M. tuberculosis complex
Celem jest wykrycie mutacji
odpowiedzialnej za oporność na
lek, np. mutacje w rpoB oporność
na RMP
Amplifikacja specyficznych
sekwencji dla danego gatunku
prątków
Pozytywny wynik testu świadczy o
obecności prątków M. tuberculosis
complex w materiale klinicznym
Wykrycie mutacji w danym genie
świadczy o oporności prątków na
badany lek
Identyfikacja do gatunku prątków
MOTT oraz w obrębie
M. tuberculosis complex
Bezpośrednio z materiałów
klinicznych lub hodowli
Bezpośrednio z materiałów
klinicznych lub hodowli
Bezpośrednio z materiałów
klinicznych lub hodowli
National Institute for Materials Science. "A rapid, paper-based diagnostic test for tuberculosis." ScienceDaily. ScienceDaily, 3 October 2013
Spoligotypowanie = metoda przesiewowa
1
2
3
4
■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■
■■□■■■■■□■■■■■■□■■■■■■□■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□
■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□□□□□■■□□□□■■■■■■■
■□□□□■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□□□□□■■□□□□■■■■■■■
1
2
3
4
■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□□□□□■■□□□□■■■■■■■
■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□□□□□■■□□□□■■■■■■■
■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□□□□□■■□□□□■■■■■■■
■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□□□□□■■□□□□■■■■■■■
SZCZEPY RÓŻNE
SZCZEPY IDENTYCZNE
Zastosowanie metody bardziej różnicującej
Szczepy różne
Szczepy różne
Szczepy takie same
Wzór molekularny Beiging
leczenie gruźlicy mniej skuteczne wobec szczepów
genotypu Beinging nie związane z lekooporności.
J Infect Dis. (2010) 201 (4): 553-557.
W Europie >80% MDR
Konferencja TB PAN-NET Mediolan czerwiec 2014
Dlaczego świat boi się prątków Beijing?
Szybko nabywają oporności na leki
Większa patogenność
Łatwo transmitowane
Oporne na działanie mechanizmów obronnych
człowieka
Namnażają się w makrofagach i monocytach
Nieprzewidywalna odpowiedź na leczenie
Analiza 106 szczepów Beijing
wyizolowanych od chorych w Polsce
w latach 2000-2014
Liczba szczepów
Obcokrajowcy
(%)
Polacy
Ogółem
(%)
(%)
42 (40)
64 (60)
106 (100)
Mężczyźni
31 (29)
55 (53)
86 (82)
Kobiety
11 (10)
9 (8)
20 (18)
Dorośli
38 (36)
62 (58)
100 (94)
Dzieci (0-14) (troje 0-3 lat)
4 (4)
2 (2)
6 (6)
Szczepy lekowrażliwe
11(10)
11(10)
22 (20)
Szczepy lekooporne
30 (28)
54 (52)
84 (80)
Liczba szczepów MDR
18 (17)
53 (50)
71 (67)
pre-XDR
4 (4)
14 (13)
18 (20)
XDR
2 (2)
6 (6)
8 (8)
Płeć
Wiek
Wśród MDR
W Polsce w populacji chorych na gruźlicę typu Beijing dominuje
postać oporna na leki p/prątkowe (80%)
MDR-TB – 42%
Pre-XDR-TB - 20%
XDR-TB – 8%
Wszystkie szczepy lekooporne
izolowane od chorych na gruźlicę w Polsce
należy weryfikować metodami genotypowania
w celu określenia ich przynależności do rodziny molekularnej Beijing.
Hist - Pat
Ziarniniaki nie są strukturą swoistą dla gruźlicy i mogą
występować w innych chorobach jak:
•
•
•
•
•
•
•
•
mykobakterioza
sarkoidoza,
chłoniaki
bruceloza
choroba kociego pazura
grzybice
ziarniniakowatości Wegenera
odczyny na ciało obce
Znalezienie ziarniniaków nawet z martwicą nie upoważnia do his-pat
rozpoznania tbc
Diagnostyka TB
Materiały płucne
Materiały pozapłucne
Płyn mózgowo-rdzeniowy
Płyn z opłucnej
Płyn z otrzewnej
Płyn z osierdzia
Węzły chłonne
Tkanki
Biopsje
Mocz
Plwocina
Wydzielina oskrzelowa
Popłuczyny oskrzelowe
BAL
Popłuczyny żołądkowe
Hodowla
Badania genetyczne
Materiały
histopatologiczne
51,3% (39) mat.
76 materiałów
utrwalonych w
parafinie badanych
metodą genetyczną
(+) bad. gen.
48,7% (37) mat.
(-) bad. Gen.
Wyniki badań 37 mat. hist.-pat. z barwieniem
Z-N
37 mat.
14 mat.
Z-N (+)
23 mat.
Z-N (-)
5 (22%) mat.
18 (78%) mat.
10 (72%) mat.
4 (28%) mat.t
Bad. gen.(+)
Bad.gen. (-)
bad.gen. (+)
bad.gen. (-)
Testy IGRA
(Interferon-Gamma Release Assay)
T-SPOT.TB (Oxford Immunotec,
Abingdon, Wielka Brytania)
Quanti FERON-TB GOLD (Cellestis,
Carnegie, Australia)
Zasada działania testów IGRA
 ocena produkcji interferonu γ wydzielanego przez limfocyty T krwi obwodowej po
stymulacji swoistymi antygenami ESAT-6 (early secretory antigen target 6) i CFP
10 (culture filtrate protein 10) kodowanymi w regionie RD1 (Region of Difference 1)
genomu M.tuberculosis
 brak go w genomie prątków BCG i w większości prątków środowiskowych z
wyjątkiem: M. kansasii, M. szulgai, M. marinum
Możliwość zastosowania testu IGRA T-SPOT.TB do
identyfikacji aktywnej postaci gruźlicy
• z materiałów klinicznych:
• BALf do diagnostyki gruźlicy płuc
• płyn z opłucnej postaci pozapłucnej
•
T-SPOT.TB w diagnostyce gruźlicy płuc i postaci pozapłucnej
 W literaturze ukazały się publikacje dotyczące wykorzystania testu IGRA z
płynów do diagnostyki gruźlicy
Jafari C. i wsp.
(BALf)/ 3 rozmazy plwociny
negatywne
Losi M. i wsp. (pł.z
opłucnej)/czułość 95% i
swoistość 76%
Trajman i wsp. czułość 89% i
swoistość 97%
Test IGRA T-SPOT.TB
71 chorych w IGiChP w latach 2012–13
 71 chorych z krwi obwodowej wykrycie LTBI
•
BALf (55) , płynów z opłucnej (16) aktywnej gruźlicy
•
Ilość limfocytów T wydzielających interferon gamma w płynie opłucnowym i BALf
oznaczano metodą ELISpot (T-SPOT.TB).
•
Równolegle mat. poddano rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej
•
Podstawę rozpoznania TB stanowiły wynik hodowli
płynu z opłucnej lub BALf.
71
(71 krwi, 55 BALf i
16 płynów z
opłucnej)
Aktywna
TB
LTBI
10
10
+ T-SPOT.TB z
płynów
ustrojowych
+ T-SPOT.TB z krwi
1
+ T-SPOT.TB z pł. z
opłucnej
1 potwierdzony
mikrobiologicznie
wyhodowano
szczep M. tbc
9
+ T-SPOT.TB z BALf
4 potwierdzone
mikrobiologicznie
wyhodowano
szczep M. tbc
Spoligotypowanie = metoda przesiewowa
1
2
3
4
■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■
■■□■■■■■□■■■■■■□■■■■■■□■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□
■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□□□□□■■□□□□■■■■■■■
■□□□□■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□□□□□■■□□□□■■■■■■■
1
2
3
4
■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□□□□□■■□□□□■■■■■■■
■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□□□□□■■□□□□■■■■■■■
■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□□□□□■■□□□□■■■■■■■
■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□□□□□■■□□□□■■■■■■■
SZCZEPY RÓŻNE
SZCZEPY IDENTYCZNE
Zastosowanie metody bardziej różnicującej
Szczepy różne
Szczepy różne
Szczepy takie same
Kontaminacja bronchoskopu –
PACJENTKA 1
PACJENTKA 2
Obraz kliniczny
Zmiany wskazujące na
proces gruźliczy
Brak zmian
Data bronchoskopii
13.05.08
15.05.08
AFB
+++
-
Sonda genetyczna
+
+
Hodowla
+
+
Lekooporność
INHRSMR
INHRSMR
Analiza molekularna wykazała identyczne wzory molekularne
szczepów od obu pacjentek
Zakażenia krzyżowe w laboratorium
Wyniki genotypowania szczepów
Nr próbki/
pacjenta
A
B
C
D
3774
3776
4892*
4893*
4894
7511
7512
562B
571
573
Spoligotyping
■■■■■■■■■■■■■■■■■■□■■■□□■■■■■■■■□□□□■□□■■■■
■■■■■■■■■■■■■■■■■■□■■■□□■■■■■■■■□□□□■□□■■■■
■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□■□□□□■■■■■■■
■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□■□□□□■■■■■■■
■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□■□□□□■■■■■■■
■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■□■■■
■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■□■■■
■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■
■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■
■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■
MIRU-VNTR
T4_CEU1 39
T4_CEU1 39
H1 47
H1 47
H1 47
T2 52
T2 52
T1 53
T1 53
T1 53
352633232433335
352633232433335
323634233232425
323634233232425
323634233232425
353625232433538
353625232433538
333634242232125
333634242232125
333634242232125
Częstość występowania kontaminacji krzyżowych
w Laboratorium Prątka
w latach 2011 - czerwiec 2014
Liczba materiałów klinicznych od chorych z podejrzeniem gruźlicy
28.308
Liczba wyhodowanych szczepów / liczba chorych z potwierdzeniem TB
598 szczepów / 408 chorych
Liczba przypadków podejrzanych o zakażenie krzyżowe / liczba szczepów
12 przypadków / 26 szczepów
Liczba przypadków potwierdzonych / liczba szczepów fałszywych
4 przypadki potwierdzonej kontaminacji / 5 szczepów
0.8%
4 przypadki potwierdzonej kontaminacji krzyżowej
Przypadek
A
B
Nr badania
3774
plwocina
3776
p.oskrzelowe
4892
plwocina
4894
Plwocina
Data
posiewu
7512
p.oskrzelowe
D
573
p.oskrzelowe
+++
+++/15 dni
NW
352633232433335
Źródło kontaminacji
-
+/13dni
NW
352633232433335
Materiał
skontaminowany
++
++/18dni
+/7dni
323634233232425
Źródło kontaminacji
-
+/79dni
NW
323634233232425
Materiał
skontaminowany
-
+/18dni
+/12dni
353625232433538
Źródło kontaminacji
-
+/46dni
+/19dni
353625232433538
Materiał
skontaminowany
+++
+/18 dni
+18dni
333634242232125
Źródło kontaminacji
-
Brak wzrostu
+/19dni
333634242232125
Materiał
skontaminowany
-
Brak wzrostu
+/26dni
333634242232125
Materiał
skontaminowany
Wzór DNA
szczepu
02.08.2012
Wynik analizy
15.11.2013
562B
Plwocina
571
p.oskrzelowe
Czas wzrostu
na pożywce
płynnej
27.05.2011
7511
p.oskrzelowe
C
AFB
Obfitość/czas
wzrostu na
pożywce stałej
23.01.2014
Podsumowanie
Znalezienie czynnika sprawczego gruźlicy i procesem trudnym i
wymaga ścisłej współpracy mikrobiologów z klinicystami
Wiarygodność mikrobiologicznej diagnostyki gruźlicy wymaga
zastosowania najnowszych metod diagnostycznych i powinna
być wykonywana w laboratoriach prątka o najwyższym
poziomie referencyjności
czas wykonania badania !!!!!!
Podsumowanie
• W ostatniej dekadzie metody szybkiej
diagnostyki TB w tym testy oporności
umożliwiły wczesne wykrycie chorego z TB i
identyfikację lekoopornej gruźlicy
• Problemem pozostaje czułość wykrywania
gruźlicy u dzieci, zakażonych HIV i postaci
pozapłucnych