Postępy we współczesnej diagnostyce laboratoryjnej gruźlicy
advertisement
diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2011 • Volume 47 • Number 4 • 439-446 Praca poglądowa • Review Article Postępy we współczesnej diagnostyce laboratoryjnej gruźlicy Progress in contemporary tuberculosis laboratory diagnostics Joanna Pendzich1, Wanda Maksymowicz-Mazur2, Jerzy Kozielski3 Katedra i Zakład Biologii Molekularnej Wydziału Farmaceutycznego i Oddziału Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, 2Pracownia Bakteriologii i Genetyki Gruźlicy, Samodzielny Publiczny Szpital Kliniczny nr 3 Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach, 3Katedra i Klinika Chorób Płuc i Gruźlicy, Samodzielny Publiczny Szpital Kliniczny nr 3 Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach 1 Streszczenie U człowieka infekcja Mycobacterium tuberculosis może zostać pokonana przez siły obronne organizmu, ale może też przejść w formę utajoną lub prowadzić do rozwinięcia się aktywnej choroby. Narzędzia diagnostyczne powinny pozwolić na precyzyjne wykrycie w organizmie gospodarza prątków bez względu na formę, jaką przybrała infekcja. W ciągu minionych lat opracowano i wprowadzono do laboratoriów diagnostycznych wiele nowych technik służących diagnostyce gruźlicy: nowe metody mikroskopowe i hodowlane, molekularne, serologiczne czy chromatograficzne. Są to jednak w większości narzędzia diagnostyczne wymagające dużych nakładów finansowych (np. automatyczne platformy do badań molekularnych, chromatografy, automatyczne aparaty hodowlane) oraz wykwalifikowanego personelu. Mimo ogromnego postępu wciąż brakuje szybkiego, precyzyjnego, taniego, dostępnego i łatwego do przeprowadzenia testu diagnostycznego. Summary While the Mycobacterium tuberculosis infection can be defeated by the host response in humans, it can also be retained as a latent infection or progress to active disease. Diagnostic methods have to enable the accurate detection of the tubercle bacilli despite the infection category. Over the past few years, several new diagnostic tools have been developed and introduced to laboratories, e.g., microscopy, culture, molecular, serologic and chromatographic procedures. Unfortunately, these are mostly very expensive diagnostic devices such as automated molecular platforms, chromatographs or automated culture systems. We still lack rapid, accurate, low-cost, accessible test easy-to-perform by low-skilled personnel. Słowa kluczowe:gruźlica utajona, diagnostyka laboratoryjna gruźlicy, Mycobacterium tuberculosis, reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), mikromacierze, test uwalniania interferonu gamma (IGRAs) Key words:latent tuberculosis, tuberculosis laboratory diagnostics, Mycobacterium tuberculosis, polymerase chain reaction (PCR), microarrays, interferon gamma release assays (IGRAs) Wstęp Gruźlica jest uznawana za najstarszą opisaną chorobę infekcyjną. Wg znawców przedmiotu w ciągu minionych 130 lat odnotowano w historii gruźlicy trzy przełomowe wydarzenia [9]: po pierwsze niemiecki badacz Robert Koch po raz pierwszy zobaczył pod mikroskopem prątki gruźlicy pochodzące z materiału pobranego od chorych, a wyniki swoich badań zaprezentował 24 marca 1882 roku w Berlinie przed członkami Towarzystwa Fizjologicznego (francuski lekarz wojskowy Jean-Antoine Villemin wykazał co prawda wcześniej w modelu zwierzęcym, że gruźlica jest chorobą zakaźną, jednak nie udało mu się wyizolować czynnika etiologicznego) [38, 39]; po drugie wprowadzono efektywną chemiotera- pię choroby (w 1949 roku zastosowano pierwszy skuteczny lek przeciw prątkom gruźlicy – streptomycynę [24]); po trzecie opracowano molekularne metody diagnozowania gruźlicy [9]. Oprócz metod diagnostycznych molekularnych, które są uznawane za najszybsze i najbardziej obiecujące, udoskonala się i wprowadza do laboratoriów szereg innych metod diagnozowania gruźlicy (nowe metody mikroskopowe i hodowlane, immunologiczne /w tym serologiczne/ czy chromatograficzne). Zgodnie z zaleceniami WHO stwierdzenie przypadku gruźlicy wymaga w dalszym ciągu mikrobiologicznego potwierdzenia, co wiąże się z koniecznością wyizolowania bakterii 439 Postępy we współczesnej diagnostyce laboratoryjnej gruźlicy grupy Mycobacterium tuberculosis complex z materiału klinicznego, określenia gatunku wyizolowanych drobnoustrojów i oceny ich lekowrażliwości. Z kolei rutynowe diagnostyczne badania molekularne można wykonywać jedynie w oparciu o komercyjne, zamknięte systemy genetyczne [2]. Metody stosowane w diagnostyce mycobacterium tuberculosis. Metody tradycyjne. Materiałami wykorzystywanymi w diagnostyce laboratoryjnej gruźlicy są m.in. próby pochodzące z układu oddechowego (np. plwocina, popłuczyny żołądkowe (gł. u dzieci), popłuczyny oskrzelowe z bronchofiberoskopii, aspirat oskrzelowy), płyny i wydaliny (np. płyn opłucnowy, płyn mózgowo– rdzeniowy, płyn stawowy, mocz), krew lub bioptaty tkanek. Wstępne przygotowanie materiału klinicznego. Materiały nie zanieczyszczone bakteriami (z natury jałowe) należy zagęścić, a następnie posiewać bezpośrednio na podłoża hodowlane płynne i stałe. Materiały kliniczne, w których znajduje się flora towarzysząca należy przed posiewem poddać dekontaminacji. Niektóre materiały wymagają dodatkowo ujednolicenia (homogenizacji). Do dekontaminacji i homogenizacji stosuje się metodę Kubicy lub Petrofa [31]. W przypadku wyizolowania mykobakterii należy zbadać ich wrażliwość na leki. Posiew na podłoże stałe. Istotnym problemem w zwalczaniu gruźlicy jest brak szybkiej i dostatecznie swoistej metody diagnostycznej. Za „złoty standard” wciąż uważany jest posiew materiału pobranego od chorego na podłoże hodowlane. Zasadniczą wadą tej metody jest konieczność oczekiwania na uzyskanie widocznych gołym okiem kolonii prątków przez okres 2 do 6 tygodni [19, 33], a czasami nawet znacznie dłużej, bo przez okres od 6 do 10 tygodni [41], a także konieczność prowadzenia hodowli w laboratorium o stopniu bezpieczeństwa BSL 2-3 (BSL, ang. biosafety level) [33]. Wstępnie opracowany materiał kliniczny (osad) posiewa się na podłoże stałe Loewensteina-Jensena. Obserwowana jest szybkość wzrostu kolonii (prątki gruźlicy to bakterie wolnorosnące) oraz ich zdolność do tworzenia pigmentu. Chromogenne są prątki „atypowe”, zwane też prątkami „niegruźliczymi” (NTM, ang. nontuberculous mycobacteria) czyli grupa prątków aktualnie nazywana MOTT (ang. Mycobacteria Other Than Tuberculosis, prątki inne niż gruźlicze). Jeśli kolonie nie wytwarzają pigmentu, czyli w przypadku stwierdzenia obecności prątków niechromogennych, przeprowadza się test niacynowy, służący do odróżnienia M. tuberculosis od pozostałych prątków. Dodatni wynik testu świadczy o obecności prątków gruźlicy. Hodowle prątków dające ujemny wynik testu niacynowego należy wystawić na działanie światła na 5 godzin, a następnie inkubować je przez kolejnych 18 godzin. Pozwoli to na przyporządkowanie bakterii do grupy prątków niechromogennych, fotochromogennych bądź skotochromogennych. Taki model identyfikacji prątków uwzględnia cechy charakterystyczne dla grup Runyona [19, 42]. 440 Pełna diagnostyka mikrobiologiczna gruźlicy metodami konwencjonalnymi (hodowla, identyfikacja gatunku, ocena lekowrażliwości) trwa od 2 do 4 miesięcy. Analiza mikroskopowa. Pierwszym etapem diagnostyki laboratoryjnej gruźlicy poza posiewem - jest analiza mikroskopowa pobranych od pacjenta próbek. Pobrane materiały barwi się zwykle metodą Ziehl–Neelsena i ogląda pod mikroskopem świetlnym w poszukiwaniu komórek kwasoopornych. Odpowiednio przygotowane materiały kliniczne można także wybarwiać auraminą–rodaminą i oglądać w mikroskopie fluorescencyjnym. Obecność komórek kwasoopornych jest wstępnym dowodem zakażenia mykobakteriami [31]. W 2009 roku Strategic and Technical Advisory Group for Tuberculosis (STAG-TB) zarekomendowała w WHO jako alternatywę dla klasycznego mikroskopu świetlnego mikroskop fluorescencyjny [35]. Ostatnio Światowa Organizacja Zdrowia (WHO, World Health Organization) zaleca, by stosować technikę LED (ang. light-emitting diode) i auraminę jako barwnik we wszystkich laboratoriach, w których stosowany jest mikroskop fluorescencyjny [34]. MODYFIKACJE METOD HODOWLANYCH Ciągle poszukuje się szybszych i bardziej wiarygodnych metod wykrywania prątków gruźlicy. Opracowano szereg nowych systemów hodowli prątków nie wymagających specjalnej aparatury: –– Septi-Chek AFB (BD, USA) to komercyjny, prosty i tani sposób hodowli prątków. W 1 butelce umieszcza się 3 różne płytki ze stałymi pożywkami (dla M. tuberculosis, dla prątków MOTT i do detekcji zanieczyszczeń). Dodatkowo hodowla jest prowadzona w drugiej butelce z płynną pożywką. Wzrost prątków może być obserwowany już po 7 dniach inkubacji [40]. –– MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube; BD, USA) to kolejny test komercyjny: hodowla prowadzona jest w pożywce płynnej Middlebrooka 7H9 z odczynnikiem fluorescencyjnym reagującym na obniżanie się poziomu tlenu w pożywce zachodzącym w czasie namnażania się prątków. Odczyt polega na analizie efektu reakcji fluorescencyjnej w transiluminatorze UV lub w lampie Wooda. Wynik uzyskuje się po 7-8 dniach inkubacji. System ten pozwala na ocenę wrażliwości prątków na izoniazyd i rifampicynę [40]. –– MB Redox (Biotest Diagnostics, USA), to test komercyjny, w którym hodowlę prowadzi się w pożywce płynnej Kirchnera z surowicą z dodatkiem soli tetrazolowych. Odczyt wizualny polega na stwierdzaniu tworzenia się barwnego formazanu (od żółtego do czerwonego) poprzez redukcję soli tetrazolowych przez prątki. System umożliwia ocenę lekowrażliwości prątków oraz ich typowanie [40]. Powstały także nowe systemy automatyczne wymagające specjalistycznej aparatury: –– Skrócenie czasu oczekiwania na wynik do 7-8 dni [19] J. Pendzich, W. Maksymowicz-Mazur i J. Kozielski (4-8 dni) przyniósł jeden z pierwszych zautomatyzowanch, komercyjnych systemów hodowli prątków BACTEC (BD, USA). Badanie polega na pomiarze radiometrycznym wydzielonego z hodowli dwutlenku węgla, znakowanego izotopem węgla 14C [19]. –– W systemie 460TB BACTEC można zastosować test TB NAP BACTEC służący do różnicowania kompleksu prątka gruźlicy (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum i M. microti) od innych prątków (MOTT). Badanie trwa 3-5 dni. Test NAP BACTEC umożliwia też szybkie wykrycie obecności M. tuberculosis [3]. System umożliwia również ocenę wrażliwości prątków na izoniazyd, streptomycynę, rifampicynę, etambutol i pirazynamid w ciągu 5-8 dni, a także na określenie przynależności badanego szczepu do jednej z 2 grup: M. tuberculosis complex lub MOTT (5-7 dni od wyhodowania bakterii) [40]. System ten w ciągu ostatnich lat podlegał licznym modyfikacjom. Obecnie ze względu na wycofywanie znaczników izotopowych system BACTEC 460 TB jest zastępowany przez system MGIT 960 (BD, USA), wykorzystujący pomiar fluorescencji w zależności od zużycia przez prątki tlenu w hodowli [19]. –– MB/BacT (BioMērieux, Francja) to komercyjny system kolorymetryczny. Prowadzi się hodowlę w pożywce Middlebrook 7H9 zawierającej zestaw PANTA. Do butelki hodowlanej z pożywką i mieszaniną gazów CO2, N2 i O2 w czasie wzrostu prątków wydzielany jest CO2, którego wzrost powoduje zmianę zabarwienia wskaźnika kolorymetrycznego. Wzrost prątków obserwuje się w okresie od 6-7 dni do 6 tygodni inkubacji. System ten umożliwia ocenę wrażliwości prątków na 5 podstawowych leków przeciwgruźliczych [40]. METODY IMMUNOLOGICZNE Badania nad opracowaniem skutecznego testu immunologicznego pozwalającego na zdiagnozowanie gruźlicy trwają praktycznie od XIX wieku, czyli od zaobserwowania, iż prątki gruźlicy mogą być aglutynowane przez surowicę osób chorych na gruźlicę. Na rynku są dostępne antygeny A60 oraz 38 kDa uzyskane z M. bovis BCG. Odpowiedź organizmu człowieka na podane antygeny bada się techniką immunoenzymatyczną ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay). Wykorzystywane są również proste, komercyjne testy paskowe lub płytkowe zawierające antygen A60. Przeprowadzenie takiego testu nie wymaga specjalnej aparatury i spełniać może pomocniczą rolę w diagnostyce gruźlicy [40, 42]. Do najnowszych osiągnięć należy niewątpliwie zaliczyć opracowanie dwóch rodzajów komercyjnych testów IGRA (ang. interferon gamma release assays) różniących się sposobem przeprowadzenia: /1/ Quantiferon-TB Gold (Cellestis Ltd, Australia) - testu polegającego na ocenie ilości uwalnianego interferonu w krótkotrwałych hodowlach komórek pełnej krwi obwodowej stymulowanych antygenami prątka oraz /2/ T-spot-TB (Oxford, Immunotec, Wielka Brytania) - testu polegającego na ustaleniu liczby komórek wytwarzających interferon w wyniku ekspozycji na antygeny prątka. Do konstrukcji obu rodzajów testu IGRA zastosowano wczesne antygeny prątka gruźlicy ESAT-6 (ang, Mycobacterium tuberculosis-early secreted antigenic target 6kDa) i CFP-10 (ang. culture filtrated protein). Wymienione dwa antygeny są wydzielane w ilościach 1:1 w krótkotrwałych hodowlach prątków. Antygeny ESAT-6 oraz CFP-10 są kodowane przez geny regionu RD-1. Region ten nie występuje we wszystkich podtypach szczepu BCG oraz u większości prątków niegruźliczych (za wyjątkiem M. szulgai, M. marinum i M. kansasi). Homolog antygenu ESAT-6 obserwuje się u prątków trądu (M. leprae). Antygeny ESAT-6 i CFP-10 są preferencyjnie rozpoznawane oraz są głównymi stymulatorami produkcji interferonu gamma we wczesnych fazach eksperymentalnego zakażenia prątkiem. Odpowiedź na ESAT-6 i CFP-10 jest komplementarna, dlatego wskazana jest ocena odpowiedzi na oba antygeny. Wprowadzenie testów IGRA opartych na antygenach, które nie występują u szczepu BCG umożliwia odróżnienie odczynowości poszczepiennej od wywołanej utajonym zakażeniem gruźlicą. Test ten stwarza unikalną możliwość określenia w sposób bezpośredni obecności zakażenia M. tuberculosis w populacji, w której szczepienie przeciwko gruźlicy jest powszechnie stosowane [11]. Testy komercyjne QuantiFERON-TB Gold In Tube (Celestis, Australia) i T-SPOT.TB (Oxford Immunotec, Wielka Brytania) wymagają dobrego wyposażenia laboratorium. Wymienione narzędzia diagnostyczne są jednak mało czułe w przypadku pacjentów z HIV. Służą one głównie do wykrywania latentnej (utajonej) postaci gruźlicy [33]. Wyniki porównań dostępnych testów: Efthimiou P. i wsp. [14] z powodzeniem wykrywali gruźlicę utajoną przy pomocy testu QuantiFERON TB-Gold (QFT-G) u osób z reumatoidalnym zapaleniem stawów i ujemnym wynikiem tuberkulinowego testu skórnego (TST). Dinnes J. i wsp. [13] dokonali przeglądu i oceny szybkich testów stosowanych w diagnostyce gruźlicy aktywnej i utajonej. Wśród testów wykrywających formę utajoną gruźlicy wyróżnili testy oparte o antygeny kodowane przez region RD-1 (antygeny ESAT-6 i CFP-10), których wyniki lepiej korelowały z intensywnością ekspozycji i były bardziej niezależne od szczepienia BCG oraz infekcji HIV, niż inne analizowane testy tej grupy. Podstawowe testy komercyjne to testy oparte na technikach immunoenzymatycznych ELISA (ang. whole blood interferon enzyme-linked immunosorbent assay) i ELISPOT (ang. enzyme-linked immunospot assay). Przydatność szybkich testów serologicznych/immunologicznych służących do diagnostyki aktywnej gruźlicy wymaga dalszych badań. Z kolei Steingardt i wsp. dokonali przeglądu dostępnych testów serologicznych, służących do wykrywania prątków. Wyniki analizy wskazują, że w przypadku gruźlicy płuc testy te są mało przydatne, bądź też w ogóle nieprzydatne. Czułość testów jest wyższa w przypadku pacjentów z pozytywnym wynikiem badania rozmazu, w porównaniu do pacjentów 441 Postępy we współczesnej diagnostyce laboratoryjnej gruźlicy z negatywnym wynikiem badania rozmazu. Etap diagnostyki polegający na badaniu rozmazu nie może zostać zastąpiony przez testy serologiczne. Konieczne jest poszukiwanie nowych antygenów o potencjale immunodiagnostycznym [30]. W Korei przeprowadzono badania antygenów zrekombinowanych (rESAT-6, rHSP-X, rCFP-10) oraz natywnych (Ag85 i PstS1) o potencjalnym znaczeniu dla serodiagnostyki gruźlicy. Antygen HSP-X okazał się najbardziej przydatny, gdy w teście wykorzystano tylko jeden antygen. Test wykazał najwyższą specyficzność i czułość, gdy zastosowano równocześnie wszystkie 5 badanych antygenów. Test z zastosowaniem wszystkich 5 badanych antygenów (coctail ELISA) okazał się dostatecznie użyteczny do wykrywania aktywnej gruźlicy [29]. Bradshaw L. i wsp. (2011) [6] wykorzystali w swoich badaniach test komercyjny QuantiFERON-TB Gold In-Tube (Cellestis Ltd, Carnegie, Australia) i stwierdzili, że jego wynik dodatni wskazuje na wcześniejszy kontakt z prątkami gruźlicy, a nie na obecność aktywnej choroby. METODY CHROMATOGRAFICZNE Metody chromatograficzne zostały wprowadzone do identyfikacji prątków w latach 90-tych i stosowano je do badań naukowych. Służą one do analizy składu ilościowego i jakościowego kwasów mykolowych prątków, co umożliwia identyfikację gatunków i podgatunków tych bakterii. Najbardziej przydatna okazała się technika cieczowej chromatografii wysokosprawnej (HPLC, ang. High Performance Liquid Chromatography). Czas jednej analizy to kilka minut. Technika ta wymaga jednak specjalistycznej aparatury, dobrze wyszkolonego personelu oraz uprzedniego wyhodowania bakterii [40]. Zastosowanie metod chromatograficznych w diagnostyce gruźlicy ogranicza się praktycznie do laboratoriów referencyjnych prątka [42]. Metody chromatograficzne w połączeniu z molekularnymi znajdują również zastosowanie w ocenie oporności prątków gruźlicy na leki (szczegóły w podrozdziale Wykrywanie lekooporności prątków gruźlicy z zastosowaniem metod molekularnych) [15]. METODY MOLEKULARNE Rozwój biologii molekularnej umożliwił wykrywanie obecności prątków w badanym materiale w ciągu 1-2 dni, a nawet w ciągu kilku godzin, zależnie od zastosowanej techniki diagnostycznej. Zdaniem części badaczy testy genetyczne mogą co prawda znacznie przyspieszyć postawienie diagnozy, ale należy je stosować jedynie jako uzupełnienie innych metod diagnostycznych (nie powinny one zastępować metod nie-genetycznych) [2]. Jest to zresztą zgodne ze stanowiskiem WHO, wg której za przypadek gruźlicy uważa się przypadek potwierdzony bakteriologicznie [42]. Wśród metod molekularnych wyróżnia się następujące grupy: Sondy genetyczne: technika identyfikacji mikroorganizmów polega na hybrydyzacji kwasów nukleinowych danego mi442 kroorganizmu z komplementarną, wyznakowaną sondą genetyczną. Dawniej znakowano sondy izotopami 32P i 125J. Aktualnie sondy znakowane są barwnikami fluorescencyjnymi. Wykorzystywane są sondy do rozpoznawania DNA i RNA. –– Sondy systemu komercyjnego AccuProbe (Gen-Probe, USA) znakowane są estrami akrydyny. –– W technice SNAP stosowane są sondy znakowane alkaliczną fosfatazą. Dwuniciowe hybrydy wykrywa się metodami chemiluminescencji (test komercyjny AccuProbe) lub w formie reakcji barwnej (SNAP: po dodaniu substratu dla alkalicznej fosfatazy; test komercyjny Syngene System, USA). Są to metody wymagające uprzedniej hodowli badanego materiału klinicznego. Dostępne są sondy dla 5 gatunków prątków, w tym dla Mycobacterium tuberculosis [40]. Amplifikacja kwasów nukleinowych: szybki rozwój technik biologii molekularnej stworzył nowe możliwości w diagnostyce gruźlicy. Znalazła tu zastosowanie metoda łańcuchowej reakcji polimerazy (ang. polymerase chain reaction, PCR) pozwalająca na amplifikację wybranego fragmentu DNA, rRNA lub mRNA (RT-PCR, ang. reverse transcriptase-PCR, odwrotna transkrypcja-PCR) [19, 20], który wykrywa się następnie przy pomocy sondy genetycznej lub elektroforezy. W metodzie tej czas oczekiwania na wynik wynosi zaledwie kilka godzin [19]. Dostępnych jest wiele testów służących do wykrywania w próbach klinicznych DNA sekwencji insercyjnej IS6110 [26], specyficznej dla M. tuberculosis complex. Testy te pozwalają na diagnostykę gruźlicy z dokładnością co najmniej dorównującą tradycyjnym metodom hodowlanym w próbach klinicznych pochodzących z układu oddechowego i większą w materiałach skąpoprątkowych, takich jak płyn mózgowo– rdzeniowy czy płyn opłucnowy [9]. PCR –– Test komercyjny MTDT (ang. Mycobacterium tuberculosis Direct Test; Gen-Probe, USA) to test bezpośredni służący do wykrywania obecności Mycobacterium tuberculosis. Jest to test stosunkowo nowy. Istotą testu jest amplifikacja 16S rRNA prątków należących do grupy Mycobacterium tuberculosis complex. Czułość testu wynosi 75–100%, specyficzność 95–100%, pozytywna wartość prognostyczna 78–100%, a negatywna wartość prognostyczna 95-100%. Metoda ta pozwala na szybką identyfikację Mycobacterium tuberculosis w próbach klinicznych, w których wykryto prątki techniką rozmazu [20]. Test ten pozwala na wykrycie w badanym materiale nawet 1 komórki prątka. Badanie trwa jeden dzień. –– W testach, w których amplifikowane są fragmenty IS 6110 (wstawka insercyjna) wykrywa się 10-100 komórek prątka w badanym materiale. –– Wykrycie prątków gruźlicy możliwe jest także, gdy amplifikacji poddawane są fragmenty IS 986, geny kodujące antygeny HPB 70 i HPB 64 [40], a także geny kodujące białka 65 kDa [26, 40] i 38 kDa [26]. J. Pendzich, W. Maksymowicz-Mazur i J. Kozielski –– Test komercyjny Xpert MTB/RIF (Cepheid Inc., USA) umożliwia równoczesne wykrywanie bakterii M. tuberculosis oraz ich oporności na rifampicynę poprzez amplifikację pięciu zachodzących na siebie sond (Becton-Dickinson, USA), które są komplementarne do całkowitego fragmentu 81 par zasad determinującego oporność na rifampicynę u M. tuberculosis w obrębie genu rpoB [5, 33]. –– GTMD (GenoType Mycobacteria Direct) to stosunkowo nowy komercyjny test molekularny firmy Hain Lifescience GMBH (Nehren, Niemcy) służący do wykrywania mykobakterii grupy Mycobacterium tuberculosis complex, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii i M. malmoense bezpośrednio w próbach klinicznych (metoda nie wymaga wcześniejszego wyhodowania kolonii prątków). Stwierdzono, że czułość, specyficzność oraz wartości prognostyczne pozytywna i negatywna wynoszą, odpowiednio 92, 100, 100 i 77% [16]. –– Safianowska i wsp [2009] badali przydatność komercyjnego testu GenoType system (HAIN Lifescience, Niemcy) do wykrywania prątków gruźlicy i innych prątków. System ten składa się z 5 niezależnych testów, które można zastosować w bezpośrednim badaniu prób klinicznych lub w badaniu wyizolowanych z hodowli szczepów bakterii. Metoda umożliwia również ocenę lekowrażliwości prątków na rifampicynę i izoniazyd (test komercyjny GenoType MTBDRplus; Hain Lifescience GMBH, Nehren, Niemcy). Stwierdzono, że test ten może zastąpić technikę chromatograficzną HPLC w rutynowej diagnostyce gruźlicy. Wprowadzenie tego testu do rutynowej diagnostyki gruźlicy może znacznie przyspieszyć wykrywanie prątków wielolekoopornych [27]. –– Amplicor Mycobacterium Kit (Roche Diagnostics, Japonia) jest najczęściej stosowanym komercyjnym zestawem do diagnostyki zakażeń prątkami, zwłaszcza wywołanymi przez M. tuberculosis complex, M. avium i M. intracellulare. Stwierdzono, że jest to wiarygodna i szybka metoda diagnostyczna [22]. W USA, w diagnostyce gruźlicy standardowo stosowane są metody molekularne oparte na amplifikacji kwasów nukleinowych [33]. FDA akceptuje do wykrywania prątków w materiałach pochodzących z dróg oddechowych real-time COBAS TaqMan MTB (Roche Molecular Systems, USA) bez względu na wynik badania rozmazu (pozytywny lub negatywny) oraz AMPLIFIED M. Tuberculosis Direct Test w wersji podstawowej i unowocześnionej (Gen-Probe, USA) do badania próbek, w których wykryto prątki w rozmazie [33]. Inne stosowane zestawy komercyjne to Roche LightCycler Mycobacterium detection kit (Roche Applied Science, IN, USA), Seeplex TB detection kit (Seegene, Korea) i ProbeTec Direct oraz pólautomatyczny system ProbeTec ET (BD, USA). Badania z wykorzystaniem innych metod diagnostycznych opartych na PCR: Opracowano i przetestowano nowy eksperymentalny ze- staw diagnostyczny służący do wykrywania M. tuberculosis w materiałach klinicznych, w którym zastosowano technikę F-PCR (fluorescencyjny PCR). Charakteryzuje się czułością 89,2%, specyficznością 98,8% i wydajnością 93,6% [8]. Amplifikację DNA przeprowadza się również w aparacie LightCycler PCR (LCxPCR). Jedna z eksperymentalnych technik, w której zastosowano trzy sondy oligonukleotydowe specyficzne dla genu kodującego 16S rRNA, pozwala na odróżnienie gatunków należących do M. tuberculosis complex i M. avium oraz mykobakterii nie wywołujących gruźlicy. Metodą tą można wykryć w badanym materiale nawet pięć kopii genu kodującego 16S rRNA. Metoda ta jest jak dotąd najszybszą metodą pozwalającą na rozróżnienie mykobakterii w hodowli [25]. Podjęto także próbę wykrycia prątków w pochodzących od pacjentów z podejrzeniem gruźlicy w skrawkach parafinowych i utrwalonych w formalinie. Zastosowano trzy różne metody PCR oraz Southern blotting. Stwierdzono, że PCR jest czułą, specyficzną i szybką metodą diagnostyczną [17]. W latach 1976-1994 zastosowano metodę PCR do wykrywania fragmentu IS6110 DNA M. tuberculosis complex w parafinowych skrawkach bioptatów skóry z histopatologicznie zdiagnozowanym zapaleniem tkanki podskórnej. Obecność prątków stwierdzono w 77% prób klinicznych. Dopiero wprowadzenie technik biologii molekularnej umożliwiło prawidłową diagnostykę choroby [4]. Opracowano metodę multiplex PCR z wykorzystaniem trzech par starterów, służącą do wykrywania M. tuberculosis w materiałach klinicznych. Metoda ta umożliwia wykrywanie prątków gruźlicy w czasie krótszym niż jeden dzień [10]. Opracowano także nową metodę amplifikacji w warunkach izotermicznych DNA wyizolowanego z komórek M. tuberculosis (ICAN, ang. isothermal DNA amplification method). W metodzie tej wykorzystywane są startery i sonda hybrydyzacyjna komplematrne do sekwencji insercyjnej IS6110. Metodą tą można wykryć nawet jedną kopię DNA M. tuberculosis w ciągu około 3,5 godziny [28]. Hershkovitz i wsp. przedstawili wyniki badań molekularnych kobiety i noworodka pochowanych razem w Atlit-Yam (Izrael, Dystrykt Hajfy), na wschodnim wybrzeżu Morza Śródziemnego około 9250-8160 lat temu. Metodą PCR wykryto DNA Mycobacterium tuberculosis w próbkach kości zawierających typowe zmiany obserwowane w przebiegu gruźlicy. Wyniki badań zweryfikowano techniką HPLC (ang. high performance liquid chromatography), którą wykryto bezpośrednio kwasy mykolowe charakterystyczne dla Mycobacterium tuberculosis complex [21]. Technika PCR, chociaż coraz powszechniej stosowana w diagnostyce gruźlicy, ma pewne ograniczenia. Podstawowe z nich polega na tym, że techniką tą wykrywa się zarówno żywe, jak i martwe prątki. Poza tym reakcja amplifikacji może być hamowana przez inhibitory znajdujące się w badanych próbkach, co wiąże się z ryzykiem uzyskania fałszywie ujemnych wyników [40]. 443 Postępy we współczesnej diagnostyce laboratoryjnej gruźlicy RT-PCR Metody biologii molekularnej, takie jak PCR są szeroko stosowane do wykrywania DNA mikroorganizmów powodujących infekcje. Metody polegające na wykrywaniu DNA nie pozwalają jednak na stwierdzenie czy w badanym materiale obecne są żywe komórki bakterii wywołujących infekcje. Rozwiązaniem tego niezwykle istotnego problemu jest opracowanie technik, w których materiałem wyjściowym jest bakteryjny mRNA. Bakteryjny mRNA ma bardzo krótki okres półtrwania, wynoszący średnio kilka minut. Stosując technikę RT-PCR można stwierdzić obecność żywych komórek w badanym materiale. Metodę tę zastosowano m. in. do eksperymentalnego wykrywania mRNA genu kodującego antygen 85B M. tuberculosis [26]. Opracowano również metodę STN RT–PCR (ang. single–tube nested RT–PCR - jednostopniowy gniazdowy RT-PCR) wykorzystywaną w badaniach naukowych do wykrywania mRNA genu kodującego antygen 85B M. tuberculosis. Specyficzność metody wynosiła 100%, a w materiale klinicznym (plwocina) wykrywano nawet 12 CFU (ang. colony forming unit - jednostka tworząca kolonię) [20]. Technika mikromacierzy (chipów): Technika mikromacierzy może być stosowana do wykrywania prątków, ich identyfikacji do gatunku [18, 23], a także do oceny ich oporności na leki [12]. Opracowano metodę szybkiego wykrywania prątków gruźlicy bezpośrednio w materiałach klinicznych metodą mikromacierzy (ang. gene chip, array, microarray). Skonstruowano macierz membranową wykorzystując sekwencje fragmentów 13 genów prątków gruźlicy. Poziom wykrywalności prątków gruźlicy w 80 próbkach plwociny, z których uzyskano wzrost prątków w hodowli wynosił 85% i był wyższy, niż w przypadku użycia metody PCR-RFLP (62.5%) i techniki barwienia prątków kwasoopornych (70%) [7]. Zhu i wsp. opracowali metodę macierzy (ang. biochip) pozwalającą na równoczesną identyfikację 17 pospolitych gatunków prątków wykorzystując różnice w obrębie ich 16S rRNA. Badaniu można poddać bezpośrednio próbki kliniczne (plwocina) lub wyizolowane kolonie bakterii. Całkowity czas trwania badania wynosi 6 godzin [37]. Dotąd nie opracowano komercyjnego testu wykrywania prątków gruźlicy techniką mikromacierzy. Wykrywanie lekooporności prątków gruźlicy z zastosowaniem metod molekularnych: Od około 20 lat metody biologii molekularnej stosowane są do wykrywania oporności na podstawowe leki przeciwgruźlicze. Jest to nowy i wielce obiecujący kierunek badań. Ze względu na rozprzestrzenianie się szczepów wielolekoopornych i niedostatek leków pierwszej linii, ten kierunek badań cieszy się szczególnym zainteresowaniem [9]. W Hiszpanii, w ciągu 7 lat zbadano fenotyp lekowrażliwości w 964 izolatach M. tuberculosis. 3.9% izolatów było opornych na rifampicynę, 8,2% na izoniazyd, a 3,2% wykazywało oporność przynajmniej na dwa wymienione chemioterapeutyki (szczepy wielolekooporne). W badaniach zastosowano 444 3 metody molekularne: SSCP (ang. single strand conformation polymorphism - polimorfizm konformacji pojedynczych łańcuchów), RFLP (ang. restriction fragment length polymorphisms - polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych) oraz analizę sekwencyjną. Stwierdzono obecność kilku różnych mutacji w genach rpoB, katG oraz inhA. W obrębie promotora genu ahpC nie znaleziono mutacji [32]. Testy komercyjne gMTBDR(+), INNO-LiPA Rif.TB (INNO-LiPA; Innogenetics, Belgia), a także analizę RLFP oraz bezpośrednie sekwencjonowanie genów katG, rpoB i rpsL prątków gruźlicy przeprowadzali też w celu wykrycia szczepów wielolekoopornych Al-Mutairi i wsp. [1]. Zatwierdzone przez WHO metody molekularne to metody komercyjne wykorzystujące sondy (LPAs, ang., molecular line probe assays) do wykrywania prątków lekoopornych, takie jak MDR-TB GenoType MTBDRplus (Hain Lifescience, Nehren, Niemcy) i INNO-LiPA Rif TB (Innogenetics, Belgia) [33]. Evans i wsp. wykorzystali metodę dHPLC (ang. denaturating HPLC – denaturujący HPLC) do wykrywania mutacji w DNA prątków związanych z opornością na rifampicynę. Najpierw metodą PCR amplifikowano fragment genu rpoB o długości 400 par zasad, a następnie, wykorzystując fragmenty DNA o znanej sekwencji uzyskiwano heterodupleksy, które analizowano metodą dHPLC. Stwierdzono, że metoda jest czuła i specyficzna, i może być wprowadzona rutynowej diagnostyki laboratoryjnej gruźlicy [15]. Do wykrywania gruźlicy wielolekoopornej zastosowano również mikromacierze umożliwiające wykrywanie mutacji w genie rpoB związanej z opornością na rifampicynę oraz mutacji w genach katG i inhA, odpowiedzialnych za oporność na izoniazyd. Stwierdzono, że metoda mikromacierzy to metoda szybka, wydajna, specyficzna i czuła, i można ją z powodzeniem zastosować w diagnostyce gruźlicy wielolekoopornej [36]. Gruźlica, chociaż jest chorobą wyleczalną, w dalszym ciągu pozostaje ważną, infekcyjną przyczyną śmierci ludzi na całym świecie. Mimo inwestycji i ogromnego postępu w diagnostyce (co opisano pokrótce w niniejszej pracy) oraz terapii (np. program terapii nadzorowanej DOTS (ang. directly observed therapy), niedostateczna liczba wykrywanych przypadków gruźlicy jest głównym problemem w globalnej kontroli tej choroby. Jak dotąd, nie nastąpił przełomowy, zdecydowany krok w kierunku eliminacji gruźlicy. Co niezwykle ważne, w ciągu minionej dekady opracowano wiele obiecujących technik diagnostycznych. Jednak, poza nowoczesnymi, czułymi, drogimi automatycznymi platformami molekularnymi do wykrywania prątków gruźlicy i oceny ich wrażliwości na leki, brakuje w dalszym ciągu prostego, niedrogiego, szybkiego testu diagnostycznego, umożliwiającego wykrywanie prątków gruźlicy w warunkach terenowych, w krajach biednych, których nie stać na inwestycje w drogą aparaturę do diagnostyki molekularnej oraz przeszkolenie i utrzymywanie wyspecjalizowanej w badaniach molekularnych kadry medycznej [34]. J. Pendzich, W. Maksymowicz-Mazur i J. Kozielski Piśmiennictwo 1. Al-Mutairi NM, Ahmad S, Mokaddas E. Performance comparison of four methods for detecting multidrug-resistant Mycobacterium tubrculosis strains. Int J Tuberc Lung Dis 2011; 15: 110-115. 2. Augustynowicz-Kopeć E, Zwolska Z. Postępy w diagnostyce i epidemiologii molekularnej Mycobacterium tuberculosis. Post Mikrobiol 2010; 49: 151-156. 3. BACTEC NAP TB Differentiation Test Kit: Becton, Dickinson and Company, 7 Loveton Circle Sparks, MD 21152 USA 800-6388663 www.bd.com/ds (stan na lipiec 2011). 4. Balsega E, Margall N, Barnadas M i wsp. Detection of Mycobacterium tuberculosis DNA in Lobular Granulomatous Panniculitis (Erythema Induratum – Nodular Vasculitis). Arch Dermatol 1997; 133: 457 – 462. 5. Boehme CC, Nabeta P, Hillemann D i wsp. Rapid Molecular Detection of Tuberculosis and Rifampin Resistance. N Engl J Med 2010; 363: 1005–1015. 6. Bradshaw L, Davies E, Devine M i wsp. The role of the Interferon Gamma Release Assay in Assessing Recent Tuberculosis Transmission in a Hospital Incident. PloS One 2011; 6: 6. 7. Chang HJ, Huang MY, Yeh CS i wsp. Rapid diagnosis of tuberculosis directly from clinical specimens using a gene chip. Clin Microbiol Infect 2010, 16: 1090-1096. 8. Cheng G, He YS, Zhou XY i wsp. Development and clinical trial of fluorescence PCR diagnostic kit to detect Mycobacterium tuberculosis. Di Yi Jun Yi Da Xue Bao 2002; 22: 533 – 535. 9. Collazos J. Molecular Biology Applied to Tuberculosis: The Third Landmark. Chest 1996; 110: 1381 – 1382. 10. Cormican M, Glennon M, Riain UN i wsp. Multiplex PCR for identifying mycobacterial isolates. J Clin Pathol 1995; 48: 203 – 205. 11. Demkow U. Testy uwalniania interferonu gamma nowym narzędziem do wykrywania ukrytego zakażenia prątkiem gruźlicy. Pneumonol Alergol Pol 2011; 79: 261–263. 12. Deng JY, Zhang XE, Lun HB i wsp. Multiplex detection of mutations in clinical isolates of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis by short oligonucleotide ligaton assay on DNA chips. J Clin Microbiol 2004; 42: 4850-4852. 13. Dinnes J, Deeks J, Kunst H i wsp. A systematic review of rapid diagnostic tests for the detection of tuberculosis Infection. Health Technol Assess 2007; 11: 1-196. 14. Efthimiou P, Sood S. Quantiferon TB gold test: The new standard for screening of latent tuberculosis in patients with rheumatoid arthriti? Ann Rheum Dis 2007; 66: 276. 15. Evans JT, Parveen A, Smith GE i wsp. Application of denaturing HPLC to rapidly identify rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis in low- and high-prevalence areas. J Antimicrobial Chemotherapy 2009; 63: 295–301. 16. Franco-Alvarez de Luna F, Ruiz P, Gutierrez J i wsp. Evaluation of the GenoType Mycobacteria Direct Assay for Detection of Mycobacterium tuberculosis Complex and Four Atypical Mycobacterial Species in Clinical Samples. J Clin Microbiol 2006; 44: 1095-1137. 17. Frevel T, Schäfer KL, Böcker W, Dockhorn – Dworniczak B. PCR based detection of mycobacteria in paraffin wax embedded material routinely processed for morphological examination. Mol Pathol 1999; 52: 283 – 288. 18. Fukushima M, Kakinuma K, Hayashi H i wsp. Detection and identification of Mycobacterium tuberculosis Species Isolates by DNA Microarray. J Clin Microbiol 2003; 41: 2605-2615. 19. Garbacz K, Piechowicz L, Galiński J i wsp. Zastosowanie metody PCR do wykrywania Mycobacterium tuberculosis – complex w różnych materiałach klinicznych. Diagn lab 2001; 37: 493 – 498. 20. Gladwin MT, Plorde JJ, Martin TR. Clinical Application of the Mycobacterium tuberculosis Direct Test: Case Report, Literature Review, and Proposed Clinical Algorithm. Chest 1998; 114: 317 – 323. 21. Hershkovitz I, Donoghue HD, Minnikin DE i wsp. Detection and Molecular Characterization of 9000-Year-Old Mycobacterium tuberculosis from a Neolithic Settlement in the Eastern Mediterranean. PLoS ONE 2008; 3: 1-6. 22. Higurashi Y, Miyake K, Okuzumi K i wsp. Reliability of Amplicor Mycobacteria Kit for detection of M. tuberculosis complex and M. Intracellulare: results of cooperative study among 331 laboratories in 2000. Kekkaku 2002; 77: 449 – 455. 23. Kostić T, Weilharter A, Rubino S i wsp. A microbial diagnostic microarray technique for the sensitive detection and identification of pathogenic bacteria in a background of nonpathogens. Anal Biochem 2007; 360: 244-254. 24. Kuś J. Leczenie gruźlicy. W: Rowińska-Zakrzewska E. (red.) Gruźlica w praktyce lekarskiej. Wyd. 1. Warszawa: Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 2000. 25. Lachnik J, Ackerman B, Bohrssen A i wsp. Rapid – cycle PCR and fluorimetry for detection of mycobacteria. J Clin Microbiol 2002; 40: 3364 – 3373. 26. Negi SS, Anand R, Pasha ST, Gupta S, Basir SF, Khare S, Lal S. Diagnostic potential of IS6110, 38kDa, 65kDa and 85B sequence-based polymerase chain reaction in the diagnosis of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples. Indian J Med Microbiol 2007; 25: 43-49. 27. Safianowska A, Walkiewicz R, Nejman-Gryz P i wsp. Diagnostic utility of the molecular assay GenoType MTBC (HAIN Lifescience, Germany) for identification of tuberculous mycobacteria. Pneumonol Alergol Pol 2009; 77: 517–520. 28. Shimada M, Hino F, Sagawa H i wsp. Development of the detection system for Mycobacterium tuberculosis DNA by using the isothermal DNA amplification method ICAN. Rinsho Byori 2002; 50: 528 – 532. 29. Shin AR, Shin SJ, Lee KS i wsp. Improved Sensitivity of Diagnosis of Tuberculosis in Patients in Korea via a Cocktail EnzymeLinked Immunosorbent Assay Containing the Abundantly Expressed Antigens of the K Strain of Mycobacterium tuberculosis. Clin Vacc Immunol 2008; 15: 1788–1795. 30. Steingart KR, Henry M, Laal S i wsp. Commercial Serological Antibody Detection Tests for the Diagnosis of Pulmonary Tuberculosis: A Systematic Review PloS Medicine 2007; 4: 10411060. 31. Szarapińska-Kwaszewska J. Diagnostyka gruźlicy i mykobakterioz. W: Szewczyk EM. Diagnostyka bakteriologiczna. PWN Warszawa 2005; 269-279. 32. Torres MJ, Criado A, Gonzalez N i wsp. Rifampin and isoniazid resistance associated mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates in Seville, Spain. Int J Tuberc Lung Dis. 2002; 6: 160-163. 33. Van Rie A, Page-Shipp L, Scott L i wsp. Xpert® MTB/RIF for point-of-care diagnosis of TB in high-HIV burden, resource-limited countries: hype or hope? Expert Rev Mol Diagn 2010; 10: 937–946. 34. Wallis RS, Pai M, Menzies D i wsp. Tuberculosis 4. Biomarkers and diagnostics for tuberculosis: progress, needs, and translation into practice. Lancet 2010; 375: 1920–37. 35. WHO. Strategic and Technical Advisory for Tuberculosis. Report of the Ninth Meeting. 9–11 November 2009. WHO, Geneva, Switzerland, 2009. 36. Yao C, Zhu T, Li Y i wsp. Detection of rpoB, katG and inhA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Chongqing as determined by microarray. Clin Microbiol Infect 2010; 16: 1639–1643. 37. Zhu L, Jiang G, Wang S i wsp. Biochip System for Rapid and Accurate Identification of Mycobacterial Species from Isolates and Sputum. J Clin Microbiol 2010; 48: 3654–3660. 38. Zwolska Z. Robert Koch-twórca bakteriologii chorób zakaźnych. VIA MEDICA Gdańsk 2006. 445 Postępy we współczesnej diagnostyce laboratoryjnej gruźlicy 39. Zwolska Z. Koch i jego dokonania-rys historyczny. Post Mikrobiol 2010; 3: 139-150. 40. Zwolska Z. Mikrobiologia gruźlicy. W: Rowińska-Zakrzewska E. (red. nacz.) Gruźlica w praktyce lekarskiej. PZWL Warszawa 2000: 13-30. 41. Zwolska Z. Współczesne problemy diagnostyki mikrobiologicznej gruźlicy. Medycyna po Dyplomie. Wydanie Specjalne: Mikrobiologiczna diagnostyka gruźlicy. Luty 2005; 49-55. 42. Zwolska Z, Augustynowicz-Kopeć E, Lange J i wsp. Przewlekłe zakażenia układu oddechowego. W: Materiały z kursu pt. Wybrane zagadnienia mikrobiologicznej diagnostyki gruźlicy. Kierownik naukowy: prof. dr hab. Z. Zwolska. Zakład Mikrobiologii IGiCHP. Marzec 2008; 237-272. Zaakceptowano do publikacji: 22.09.2011 Adres do korespondencji: Katedra i Zakład Biologii Molekularnej Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Śląski Uniwersytet Medyczny 41-200 Sosnowiec, ul. Narcyzów 1 tel. (32) 364 10 21, fax (32) 364 10 20 e-mail: [email protected] 446
