III Konferencja Naukowo-Szkoleniowa „Zakażenia Układu Oddechowego” 20-22 października 2006 NOWE METODY DIAGNOSTYKI GRUŹLICY Hanna Grubek-Jaworska Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych Pneumonologii i Alergologii Akademii Medycznej w Warszawie o Około 80% zachorowań na gruźlicę wykrywa się z objawów o Jedynym, niepodważalnym potwierdzeniem wstępnego rozpoznania choroby jest uzyskanie dodatnich wyników diagnostyki mikrobiologicznej. o W 2005 r. wśród nowo zarejestrowanych (9 280) jedynie u 5 409 potwierdzono gruźlicę bakteriologicznie (58,3 %), wśród chorych na gruźlicę płuc 61,2 % Specyfika laboratoryjnej diagnostyki gruźlicy wiąże się z: o niskim tempem namnażania się prątków na pożywkach o koniecznością stosowania wielu technik wykrywania zakażenia mikroskopia techniki hodowlane przyspieszające wzrost techniki molekularne Prawidłowa laboratoryjna diagnostyka gruźlicy obejmuje o bakterioskopię o wyhodowanie prątków o określenie gatunku wyhodowanych prątków o określenie lekowrażliwości o Miarą nowoczesności laboratorium diagnostyki gruźlicy jest spełnienie powyższych wymogów diagnostycznych w maksymalnie krótkim czasie o Docelowo całość diagnostyki nie powinna przekraczać 21- 25 dni Laboratoria prątka gruźlicy I Rzędu: mikroskopia II Rzędu: hodowla identyfikacja M.tuberculosis complex ocena lekowrażliwości na INH,RMP,SM,EMB III Rzędu: identyfikacja ważniejszych gatunków prątków testy lekowrażliwości dla leków drugiej linii testy lekowrażliwości dla prątków atypowych Nowoczesna laboratoryjna diagnostyka gruźlicy o bakterioskopia uzupełniona o metody molekularne o wyhodowanie prątków pożywka L-J pożywki płynne z różnymi systemami detekcji o określenie gatunku wyhodowanych prątków konwencjonalne metody bioch.-mikrobiologiczne metody molekularne analiza kwasów mikolowych techniką HPLC o określenie lekowrażliwości metody fenotypowe metody molekularne? Mycobacterium sp. barwienie metodą Ziehl-Neelsena mikroskopia w świetle widzialnym barwienie auraminą mikroskopia w świetle UV obecność prątków wynik O Prawdopodobnie negatywny (nie wystarczająca liczba prątków dla wykrycia w bekterioskopii) 1-2 / 300 pól widzenia Nie uznawany za pozytywny, konieczność badania dalszych próbek 1-9 / 100 pól widzenia + 1-9 / 10 pól widzenia ++ 1-9 / 1 pole widzenia +++ (średnio liczna) > 9 / 1 pole widzenia ++++ (liczne) */ przy powiększeniu 800 x - 1000x (sporadyczne) (nieliczne) Bakterioskopia (+) (-) Wykrywa chorych silnie prątkujących Nie różnicuje prątków żywych i martwych Czas wykonania około 3 godzin Nie różnicuje gatunku prątków Niska cena badania Czułość w wykrywaniu gruźlicy w plwocinie około 30 % AFB (+) M.Tuberculosis NTM (MOTT) 30 - 40% 60 – 70% Chorzy - mikroskopia dodatnia (n = 217) Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii (1999-2005) mykobakteriozy n=9 (7%) TB n = 82 (38%) NTM n = 135 (62%) NTM środowiskowe lub kolonizacja n = 126 (93%) potwierdenie TB wykluczenie TB testem MTB testem MTB Przy wynikach AFB(+) zalecanym postępowaniem jest wykonanie (możliwie z tej samej próbki klinicznej) badania techniką molekularną, która pozwala zidentyfikować genom prątków gruźlicy Systemy molekularne dopuszczone do rutynowej diagnostyki gruźlicy o Amplicor (MTB) test (Roche Molecular System,Somerville, New Jersey) rozpoznaje M.tuberculosis complex PCR (6 – 8 godz) o Mycobacterium tuberculosis Direct Test (MTD) (Gen-Probe Inc. San Diego, Ca) rozpoznaje M.tuberculosis complex, M.avium complex, M.avium, M.intracellulare, M.kansasii, M.gordonae, rRNA (2 – 3 godz) o BDProbe Tec ET Mycobacterium tuberculosis complex Direct Detection Assay (SDA - Strand Displacement Amplification) (Becton Dickinson Biosciences, Sparks, Md.) rozpoznaje M.tuberculosis complex, M.avium complex oraz M.kansasii SDA (1,5 godz) Metody biologii molekularnej (+) Czas wykonania badania – kilka / kilkanaście godzin Czułość wykrywania gruźlicy około 70 - 90 % (-) Stosunkowo wysoka cena badania Szkolenie, aparatura Możliwość identyfikacji jedynie 5 gatunków prątków: Swoistość 97-100 % •M.tbc complex, Wykrywanie zakażeń w •M.avium, bardzo wczesnej fazie •M.intracellulare, •M.konsasii, •M.gordonae Jedynie metodą molekularną można w czasie kilku godzin wykryć obecność prątków gruźlicy bezpośrednio w materiale klinicznym Amplicor Próbka kliniczna 103 - 10 4 MTB PCR (Roche) Dekontaminacja Zagęszczanie Izolacja DNA 101 - 10 2 PCR Wykrycie produktów reakcji o W zakresie diagnostyki gruźlicy, czułość i swoistość wymienionycvh systemów molekularnych jest porównywalna o W rutynowej diagnostyce gruźlicy nie należy stosować metod ”domowych” o Próbki kliniczne mogą być przesyłane pocztą (do 5 dni) bez utraty wartości diagnostycznej w zakresie zakażeń prątkowych REKOMENDACJA CDC próbka mikroskopowo dodatnia amplifikacja pozytywna 1x amplifikacja negatywna 2x inhibicja obecna TB badanie następnych próbek brak mykobakterioza ? REKOMENDACJA CDC próbka mikroskopowo ujemna amplifikacja negatywna 2x nie TB amplifikacja pozytywna 2x TB amplifikacja zahamowana ? Chorzy na gruźlicę (1999-2005) metoda i wynik AFB (+) hodowla (+) Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii Akademii Medycznej w Warszawie (1999-2005) liczba chorych 62 AFB (-) hodowla (+) 51 AFB (+) hodowla (-) 20 * AFB (-) hodowla (-) 9* ogółem * dodatni test molekularny (MTB) 142 w próbkach 9 / 51 chorych wynik testu MTD był ujemny czułość mikroskopii 58% czułość hodowli 79% Systemy detekcji wzrostu prątków na pożywkach płynnych o radiometryczny Bactec 460 Tb (Becton Dickinson) (możliwość różnicowania M.Tbc / NTM) o kolorymetryczny system - MB Bac T (Organon Teknika Corporation) (możliwość badania lekooporności na podstawowe leki przeciwgruźlicze, osobne podłoża dla próbek krwawych) o system fluorymetryczny MGIT (Mycobacterial Growth Indicatory Tube) (Beckton Dickinson) (możliwość badania lekooporności na podstawowe leki przeciwgruźlicze) wyhodowane prątki M.Tuberculosis NTM (MOTT) 30 - 40% 60 – 70% Chorzy – hodowle dodatnie (n = 312) (1999-2005) Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Pneumonologii i Alergologii) mykobakteriozy n = 22 (11%) TB n = 113 (36%) potwierdzenie TB testem MTB lub techniką HPLC NTM n = 199 (64%) wykluczenie TB testem MTB, typowanie gatunku HPLC NTM środowiskowe lub kolonizacja n = 170 (89%) M.xenopi n = 57 M.kansasii n = 42 M.gordonae n = 33 M.avium n =10 M.abscseus n=9 M.fortuitum n=8 M.flavescens n=1 M.scrofulaceum n=1 M.neoaurum n=1 M.nonchromogenicum n = 1 unidentified sp. n=9 0,17 HPLC (high pressure liquid chromatography) M.tuberculosis Wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa 0,12 0,07 LMW HMW 0,02 3 4 5 6 7 8 9 10 Analiza składu kwasów mykolowych: -0,03 M.avium 0,17 0,12 0,02 3 Hydroliza 2. Ekstrakcja chloroformem 3. Przekształcenie kwasów mykolowych w bromofenacylowe pochodne 4. Rozdział na kolumnie w fazie odwróconej 5. Wzór elucyjny badanej próby 6. Analiza porównawcza z biblioteką zgromadzonych wzorów elucyjnych szczepów wzoprcowych z ATCC HMW LMW 0,07 1. 4 5 6 7 8 9 10 -0,03 0,1 M.interjectum 0,08 0,06 LMW 0,04 HMW 0,02 0 3 -0,02 4 5 6 7 8 9 10 Porównanie czułości i czasochłonności metod laboratoryjnych w wykrywaniu gruźlicy czułość czasochłonność (%) metody molekularne hodowla mikroskopia 70 – 90 70 33 – 50 1 dzień kilka dni - 8 tyg 3 - 4 godz próbka kliniczna (po wstępnym opracowaniu) metoda molekularna bakterioskopia hodowla Tbc ujemna nie Tbc bk - bk+ wynik 24 h dodatnia test niacynowy lub metody HPLC molekularne wynik •MAC •kilkadziesiąt gatunków prątków •M.kansasii •M.tuberculosis •M.tuberculosis lekooporność met. hodowlane lub met. molekularne kilkanaście dni do 10 tyg. wynik kilka godzin do 40 dni Ujemne wyniki badań laboratoryjnych nie wykluczają rozwoju choroby bowiem żadna z metod laboratoryjnych nie charakteryzuje się 100% czułością Najczęstsze błędy laboratoryjne i interpretacyjne lub zaniechania w mikrobiologicznej diagnostyce gruźlicy I Jednoznaczna interpretacja mikroskopii AFB (+) jako gruźlicy, AFB (+) może wskazywać o o o o gruźlicę saprofit środowiskowy – (NTM / MOTT) mykobakterioza w przypadku materiałów bronchoskopowych zanieczyszczenie instrumentarium II Brak typowania do gatunku wyrośniętych szczepów prątków - poprzestanie na wykonaniu testu niacynowego różnicujacego jedynie M.tbc oraz MOTT nie pozwala to na: o diagnozowanie mykobakterioz o wykrywanie systematycznych zanieczyszczeń prątkami środowiskowymi III Zaniechanie wzywania na dodatkowe badania mikrobiologiczne chorych ze wskazaniami klinicznymi, u których wyhodowano prątki niegruźlicze Z tej grupy rekrutują się chorzy na mykobakeriozy IV Brak systematycznej oceny mikrobiologicznej czystości sprzętu endoskopowego Immunologiczna diagnostyka zakażenia M.tuberculosis w warunkach in vitro Diagnostyka uśpionych zakażeń M.tbc Latent Tuberculosis Infection - LTBI Odpowiedź na zakażenie M.tuberculosis nasilenie odpowiedzi cell mediated immunity przeciwciała replikacja prątków L a t e n t TB I n f e c t i o n czas zakażenie choroba Zjawisko, które było podstawą współcześnie stosowanego testu tuberkulinowego opisał w 1890 roku Robert Koch, kontynuatorami jego pracy byli Charles Mantoux i Clemens von Pirquet skórny test tuberkulinowy (tuberculin skin test -TST) stosowany jest od 1907 roku. test skórny pomiar testu tuberkulinowego IFN-γ stymulacja IL- 8 TNF- komórka prezentująca antygen komórka pamięci IFN-γ TNF- krew - test in vitro pomiar produkcji IFN-γ IL- 8 Czynniki negatywizujące TST: o Zależne od osoby badanej infekcje (wirusowe, bakteryjne, grzybicze) zaburzenia metaboliczne niedożywienie choroby narządów limfatycznych(np..białaczka, sarkoidoza) leki (glikokortykoidy, leki immunosupresyjne) wiek o Zależne od preparatu tuberkulinowego nieodpowieednie rozcieńczenie chemiczna denaturacja adsorpcja na szkle kontaminacja o Zła technika szczepienia o Zła technika odczytu ekspozycja na M.tbc zakażenie 95 % zakażanie uśpione 95 % nie dochodzi do rozwoju choroby 90% brak dowodów zakażenia 5% gruźlica gruźlica 5% 5 -10 % wg E.Tortoli 2005 o Postępy immunologii i genomiki ostatnich lat stworzyły test alternatywny dla skórnego testu tuberkulinowego o Jest to test in vitro nowej generacji mierzący poziom odporności komórkowej o Podstawą testu jest oddziaływanie na komórki w warunkach in vitro wysoko swoistych dla M.tuberculosis antygenów ESAT-6 oraz CP-10 stymulujących wydzielanie IFN-gamma ESAT-6 - early secretory antigenic target 6 CP-10 - culture filtrate protein Antygen ESAT-6 M tuberculosis BCG moreau pasteur tokyo danish glaxo montreal niskocząsteczkowe białka swoiste dla M.tuberculosis NTM CFP-10 CFP-10 + + - - Antygen M abscessus M avium M branderi M celatum M chelonae M fortuitum M gordonae M intracellulare M kansasii M malmoense M marinum M genavense M scrofulaceum M smegmatis M szulgai M terrae M vaccae M xenopi + + + - ESAT-6 + + + - QuantiFERON-TB Gold Maj 2005 – test uzyskał aprobatę FDA U.S. Badanie polega na wykrywaniu IFN-gamma w hodowlach limfocytów heparynizowanej, pełnej krwi stymulowanych syntetycznymi peptydami: ESAT-6 (early secretory antigenic target-6) CFP-10 (culture filtrate protein-10) swoistymi dla M.tuberculosis oraz patogennych szczepów M.bovis. Białek ESAT-6 oraz CFP-10 nie stwierdza się w BCG oraz w większości gatunków prątków środowiskowych z wyjątkami M.kansasii, M.szulgai, M.marinum Test jest rekomendowany przez CDC w każdej sytuacji, w której wykonuje się TST włączając gruźlicę oraz kontakty z TB (Latent Tuberculosis Infection -LTBI) CDC MMWR Recomendations and Reports Dec16, 2005/54 (RR 15;49-55) Quantiferon metoda probówkowa 1 krew inkubacja 16 - 24h w 37°C kontrola ujemna ESAT6 + CFP10 mitogen wirowanie kolor badanie plazmy w teście ELISA wykrywającym IFN-γ DO 450nm 2 dodanie substratu – pomiar kolorymetryczny IFN-g IU/ml odczytanie stężenia z krzywej standardowej I etap – inkubacja leukocytów z antygenem, zebranie nadsączu krew + antygen kontrole: krew bez Ag krew + mitogen Inkubacja w 37 16-24 godz. wirowanie,2000g przez 5-10 min pobranie 200 μl plazmy ELISA – IFN-γ konjugat + badana plazma lub standard inkubacja min płukanie, 120 dodanie substratu dodanie roztworu stopującego odczytanie stężenia z krzywej standard. Quantiferon – metoda płytkowa K pobranie krwi ESAT-6 CFP-10 mitogen krew + antygeny inkubacja 24h , wydzielenie IFN-γ DO 450nm KOLOR IFN-g IU/ml ‘sandwich’ ELISA, (incubacja 120 min) dodanie substratu, reakcja barwna odczyt stężenia IFNγ z krzywej standardowej QuantiFERONTB Gold – interpretacja wyników miogen – K ESAT 6 – K i / lub CFP 10 – K 0,5 0,35 pozytywny zakażenie prawdopodobne < 0,5 0,35 pozytywny zakażenie prawdopodobne 0,5 < 0,35 negatywny zakażenie nieprawdopodobne < 0,5 < 0,35 nieokreślony brak wyniku IU IFN- γ /ml wynik interpretacja T SPOT- TB assay metoda ocena liczby komórek syntetyzujących IFN-γ kontrola pobranie krwi separacja leukocytów jednojądrzastych ESAT-6 CFP-10 mitogen inkubacja komórek stymulowanych antygenami w naczyniach opłaszczonych przeciwciałem anty IFN-γ kOLOR inkubacja 24 h w 37oC ‘sandwich’ ELISA, (Inkubacja 120 min) ocena liczby barwnych plamek T SPOT- TB assay 1 Zawiesinę leukocytów krwi (250 000/ml) nawarstwia się na płytkę opłaszczoną przeciwciałem anty IFN-γ, dodaje antygeny swoiste dla TB uwalniany IFN-γ wychwytywany jest przez przeciwciała 2 Po odpłukaniu dodaje się wtórne przeciwciało znakowane enzymem, a nstępnie substrat, co wizualizuje test plamki barwne (1 plamka = 1 komórka T) Jeżeli w kontroli negatywnej.>10 lub kontroli pozytywnej <20 test nie może być interpretowany Korelacja IFN-γ / Mantoux czułość swoistość IFN-γ Mantoux 89.0% 65.7% (105/118) (50/76; 5 mm) 98.2% 35.4% (213/217) (73/113; 10 mm) Mori et al Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2004 FIG. 1. Individual IFN- response to PPD and either of the RD1 antigens ESAT-6 or CFP-10 (E6/C10) (for each patient the highest IFN- responses) are shown. In the left panel, the responses of the TB suspect population (n = 73); and in the right panel, the responses for the healthy control population (n = 39). The cutoff value for a positive response was set at 0.35 IU/ml for ESAT-6 and CFP-10 and arbitrarily at 1.5 IU/ml for PPD. The dotted lines represent the cutoff for the specific antigens and PPD. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, April 2005, p. 491-496, Vol. 12, No. 4 cutoff of 0.35 IU/ml for IFN- γ T. Mori i wsp. Am J of Respir Crit Care Med Vol 170. pp. 59-64, (2004) Ograniczenia metodyczne Quantiferonu- TB Gold (błędy techniczne) o użycie innych antykoagulantów niż heparyna o nieodpowiedni transport krwi o zbyt wysoke stężenie IFN-gamma we krwi o czas > 12 godzin po pobrania krwi Ograniczenia merytoryczne Quantiferonu- TB Gold o test nie powinien być stosowany w przypadkach zaniżonej liczby limfocytów o w przypadkach upośledzonej reaktywności immunologicznej (HIV, AIDS, transplantacje, immunosupresja polekowa) o u kobiet w ciąży o u osób poniżej 17 r.ż. kierunki badań: o QFT-G u dzieci, szczególnie <5 r.ż. o QFT-G u osób z zaburzeniami układu odpornościowego o czułość testuw gruźlicy pozapłucnej o przypadki TB w następstwie wykluczenia lub potwierdzenia LTBI przez QFT-G o czas po ekspozycji na M.tbc niezbędny dla pozytywizacji QFT-G o analiza ekonomiczna stosowania TST vs QFT-G o zmiany QFT-G u chorych leczonych z powodu LTBI oraz TB – monitorowanie terapii W diagnostyce rutynowej wiele spośród wspomnianych nowszych technik mogą stosować jedynie wybrane laboratoria Techniki te stanowią w wielu przypadkach jedynie uzupełnienie metod konwencjonalnych Zaleca się łączenie nowych technik z diagnostyką tradycyjną dziękuję za uwagę