specyfikacja etapów usługi badawczej

Załącznik nr 1 do zapytania ofertowego nr 1/2016
SPECYFIKACJA ETAPÓW USŁUGI BADAWCZEJ
ETAP I
Ekspresje genowe – faza I
Analiza ekspresji genetycznej genów predefiniowanych w próbkach biologicznych pacjentów z
endometriozą
Etap składający się z dwóch rodzajów analiz:
A. Analiza ekspresji genów metodologią qPCR.
Analiza ekspresji genów za pomocą standardowej metodologii qPCR dla grupy genów za pomocą sond
do pośredniego pomiaru względnej ilości cząsteczek RNA. Do przeprowadzenia badań i analiz
niezbędne jest posługiwanie się sprzętem z certyfikatem CE IVD. Próbki do analizy będą dostarczane
przez Zamawiającego w postaci RNA i / lub komplementarnego DNA (cDNA) otrzymanych z
wyizolowanego RNA. Wszystkie cechy jakości każdej próbki RNA (dane o koncentracji i czystości) będą
dostarczane wraz z próbkami, jak również dla każdej próbki będą wyspecyfikowane rodzaje genów
niezbędne do zbadania.
Testowana liczba genów: 250 w trzech powtórzeniach (tryplet)
Minimalna objętość reakcji qPCR: 20 µl
Minimalne objętości primery i sondy: 1 µl
Minimalna pojemność cDNA dla 1 qPCR reakcji: 3 µl
Forma przekazanych danych: Threshold definition
Baseline definition
Threshold cycle - raw data
Analiza danych: do raportowania ilości RNA powinno być wykorzystywane specjalistyczne
oprogramowanie do przetwarzania i analizy danych qPCR.
Na zakończenie wymagane będzie dostarczenie raportów.
Projekt współfinansowany w ramach Działania 1.2 „Innowacyjne przedsiębiorstwa”;
Poddziałanie 1.2.1 „Innowacyjne przedsiębiorstwa– konkurs horyzontalny”;
Schemat 1.2 A Wsparcie dla przedsiębiorstw chcących rozpocząć lub rozwinąć działalność B+R
Regionalnego Programu Operacyjnego dla Województwa Dolnośląskiego na lata 2014–2020
Strona
Analizowana ilość próbek: 250
Rodzaj próbki:
1
B. Zautomatyzowana analiza immunohistochemiczna.
Równolegle do ekspresji białka dostarczone próbki powinny być mierzone za pomocą analizy
immunohistochemicznej. Do przeprowadzenia analizy immunohistochemicznej powinien być
zastosowany aparat posiadający certyfikat CE IVD. Każda próbka powinna być kontrastowo barwiona
przez Heamatoxyline eozyn. Barwione szkiełka mikroskopowe powinny być pokryte folią, a
komórki/tkanki powinny być zanurzone w odczynniku odpornym na zanikanie i osadzone na płytce
wodnej. Każda próbka powinna być testowana max. na trzy przeciwciała spośród następnych: CD10,
KRT19, KRT18, VIM, WT1, ESR, ESR alfa, ESR beta, MUC16 , MMP9. Ki-67.
1. Krążące komórki endometrialne separowane na membranie (próbki cytologiczne)
2. Tkanka endometrialna utrwalona w formalinie i zatopiona w parafinie (próbki histologiczne)
Wizualizacja przeciwciał - system detekcji: nie fluorescencyjne
Finalne dane: dokumentacja kontroli pozytywnych i negatywnych próbek
ETAP II
Ekspresje genowe – faza II
Analiza ekspresji genetycznej genów predefiniowanych w próbkach biologicznych pacjentów z
endometriozą
Etap składający się z dwóch rodzajów analiz:
A. Analiza ekspresji genów metodologią qPCR.
Analiza ekspresji genów za pomocą standardowej metodologii qPCR dla grupy genów za pomocą sond
do pośredniego pomiaru względnej ilości cząsteczek RNA. Do przeprowadzenia badań i analiz
niezbędne jest posługiwanie się sprzętem z certyfikatem CE IVD. Próbki do analizy będą dostarczane
przez Zamawiającego w postaci RNA i / lub komplementarnego DNA (cDNA) otrzymanych z
wyizolowanego RNA. Wszystkie cechy jakości każdej próbki RNA (dane o koncentracji i czystości) będą
dostarczane wraz z próbkami, jak również dla każdej próbki będą wyspecyfikowane rodzaje genów
niezbędne do zbadania.
Testowana liczba genów: 500 w trzech powtórzeniach (tryplet)
Minimalna objętość reakcji qPCR: 20 µl
Minimalne objętości primery i sondy: 1 µl
Minimalna pojemność cDNA dla 1 qPCR reakcji: 3 µl
Forma przekazanych danych: Threshold definition
Baseline definition
Threshold cycle - raw data
Analizowana ilość próbek: 500
Projekt współfinansowany w ramach Działania 1.2 „Innowacyjne przedsiębiorstwa”;
Poddziałanie 1.2.1 „Innowacyjne przedsiębiorstwa– konkurs horyzontalny”;
Schemat 1.2 A Wsparcie dla przedsiębiorstw chcących rozpocząć lub rozwinąć działalność B+R
Regionalnego Programu Operacyjnego dla Województwa Dolnośląskiego na lata 2014–2020
Strona
B. Zautomatyzowana analiza immunohistochemiczna.
Równolegle do ekspresji białka dostarczone próbki powinny być mierzone za pomocą analizy
immunohistochemicznej. Do przeprowadzenia analizy immunohistochemicznej powinien być
zastosowany aparat posiadający certyfikat CE IVD. Każda próbka powinna być kontrastowo barwiona
przez Heamatoxyline eozyn. Barwione szkiełka mikroskopowe powinny być pokryte folią, a
komórki/tkanki powinny być zanurzone w odczynniku odpornym na zanikanie i osadzone na płytce
wodnej. Każda próbka powinna być testowana max. na trzy przeciwciała spośród następnych: CD10,
KRT19, KRT18, VIM, WT1, ESR, ESR alfa, ESR beta, MUC16 , MMP9. Ki-67.
2
Analiza danych: do raportowania ilości RNA powinno być wykorzystywane specjalistyczne
oprogramowanie do przetwarzania i analizy danych qPCR.
Na zakończenie wymagane będzie dostarczenie raportów.
Rodzaj próbki:
1. Krążące komórki endometrialne separowane na membranie (próbki cytologiczne)
2. Tkanka endometrialna utrwalona w formalinie i zatopiona w parafinie (próbki histologiczne)
Wizualizacja przeciwciał - system detekcji: nie fluorescencyjne
Finalne dane: dokumentacja kontroli pozytywnych i negatywnych próbek
Strona
3
ETAP III
Badanie molekularne
Analiza ekspresji zdefiniowanych genów w próbkach biologicznych za pomocą nowych metod
biotechnologicznych umożliwia bezpośredni pomiar kopii RNA
Etap III realizacji usługi badawczej obejmujący pomiar absolutnej liczby kopii RNA za pomocą
bezpośredniego pomiaru molekuły RNA (jeśli minimalna RNA jest dostępna). W większości
testowanych próbek oczekiwana ilość RNA odpowiadać powinna jednej komórce. Reakcja
enzymatyczna nie powinna być wykorzystywana w kopiowaniu i liczeniu RNA, w celu
zminimalizowania błędu pomiaru. Wszystkie reakcje pomiaru powinny być prowadzone w jednej
reakcji, po jednej próbce, multipleksowane.
Panel genu składać powinien się z 80 genów, które zostaną określone po analizie dwóch pierwszych
etapów projektu. Jeśli zostaną wykorzystane technologie sekwencjonowania, tylko geny będące
przedmiotem zainteresowania (80) powinny być wyrównane.
Ilość próbek: 10-20, od 14 pacjentów
Rodzaj próbki: RNA
Pochodzenie próbki: cyrkulujące komórki endometria i tkanki endometrialne białych ciałek krwi i
tkanki endometrium
Projekt współfinansowany w ramach Działania 1.2 „Innowacyjne przedsiębiorstwa”;
Poddziałanie 1.2.1 „Innowacyjne przedsiębiorstwa– konkurs horyzontalny”;
Schemat 1.2 A Wsparcie dla przedsiębiorstw chcących rozpocząć lub rozwinąć działalność B+R
Regionalnego Programu Operacyjnego dla Województwa Dolnośląskiego na lata 2014–2020