streszczenie pracy w j. polskim Białko tau należy do rodziny białek

streszczenie pracy w j. polskim
Białko tau należy do rodziny białek zasocjowanych z mikrotubulami. W wyniku
transkrypcji genu MAPT (ang. microtubule associated protein tau) powstaje pre-mRNA, z
którego podczas alternatywnego splicingu powstaje sześć izoform tego białka. U dorosłego
człowieka białko tau występuje w części aksonalnej neuronów. Główne funkcje tego białka to
polimeryzacja i stabilizacja mikrotubul, a co za tym idzie, pełni rolę w morfogenezie,
rozszerzaniu aksonalnym i transporcie białek w aksonach. Biologiczna funkcja tau jest
regulowana głównie przez hiperfosforylację. W stanach patologicznych białko tau występuje
w całej komórce nerwowej i może tworzyć helikalne włókna PHFs (ang. paired helical
filaments) oraz neurofibrylarne sploty NFTs (ang. neurofibrillary tangles).
Zespół chorób, w których występują patologiczne formy białka tau (PHFs oraz NFTs)
nazywamy tauopatiami. Do tych chorób zaliczamy jednostki związane z chorobą Alzheimera
AD (ang. alzheimer disease) oraz różnego typu otępienia czołowo-skroniowe FTDs (ang.
frontotemporal demetias). W 1998 roku odkryto pierwsze mutacje w genie MAPT, które są
odpowiedzialne za chorobę neurodegeneracyjną, a mianowicie otępienie czołowo-skroniowe
połączone z zespołem parkinsonowskim sprzężone z chromosomem 17, FTDP-17 (ang.
frontotemporal dementia and parkinsonism linked to chromosome 17).
Mutacje genu MAPT mogą mieć dwojaki charakter. Pierwszy typ mutacji, powoduje
zmianę właściwości biochemicznych białka. Drugi rodzaj, to mutacje zaburzające proces
alternatywnego splicingu. U zdrowego człowieka stosunek izoform 3R/4R białka tau w
przybliżeniu równy jest jeden. Różnica w ilości domen wiążących się do mikrotubul związana
jest z wycięciem (izoforma 3R) lub pozostawieniem (izoforma 4R) eksonu 10 w czasie
alternatywnego splicingu.
W regulacji alternatywnego składania eksonu 10 białka tau bierze udział wiele
czynników splicingowych i elementy działające w układzie cis. Z danych literaturowych
wiadomo, że miejsca akceptorowe i donorowe eksonu 10 to miejsca słabe, dlatego do
przyłączenia składników spliceosomu potrzebują dodatkowych miejsc regulujących. W
przypadku eksonu 10 pre-mRNA genu MAPT można wyróżnić siedem następujących
elementów działających w układzie cis: wzmacniacz splicingu SC35 (ang. SC35-like
enhancer), polipurynowy wzmacniacz splicingu PPE (ang. polypurine enhancer),
wzmacniacz splicingu ACE (ang. A/C rich enhancer), eksonowy wyciszacz splicingu ESS
(ang. exonic splicing silencer), eksonowy wzmacniacz splicingu ESE (ang. exonic splicing
enhancer), intronowy wyciszacz splicingu ISS (ang. intronic splicing silencer) i intronowy
modulator splicingu ISM (ang. intronic splicing modulator). Intronowy wyciszacz splicingu
ISS przyjmuje formę spinki RNA i zawiera 5’ miejsce splicingowe. Wydaje się, że element
ten pełni kluczową rolę w regulacji alternatywnego składania eksonu 10 pre-mRNA genu
MAPT. Sugeruje się, że zmiany w stabilności termodynamicznej tego motywu spinkowego w
sposób bezpośredni lub pośredni powodują różnice w oddziaływaniu z nim składników
spliceosomu.
W niniejszej pracy doktorskiej przedstawiono badania dotyczące wpływu wybranych
mutacji na alternatywne składanie eksonu 10 pre-mRNA genu MAPT. Podzielić je można na
trzy części: badania termodynamiczne, strukturalne i badania na liniach komórkowych cos-7.
Do badań termodynamicznych wykorzystano 11 cząsteczek RNA o długości 25/26
nukleotydów, które obejmowały motyw spinkowy na granicy eksonu 10 i intronu 10-11. W
eksperymentach wykorzystano spinkę RNA dla formy typu dzikiego (WT), sześć mutacji
występujących w chorobie FTDP-17 (11C, 12U, 13G, DD-PAC, 16U oraz 19G) oraz cztery
mutanty skonstruowane sztucznie (DD-10C, DDI-17T, WT-10C i WTI-17T). Pomiary
trwałości termodynamicznej metodą topnień UV pozwoliły na uzyskanie parametrów
termodynamicznych wszystkich spinek RNA. Wykonano także pomiary ich trwałości
termodynamicznej w obecności niskocząsteczkowych ligandów: neomycyny, kanamycyny,
tobramycyny i mitoksantronu. Badania potwierdziły znaczący wpływ mutacji na stabilność
termodynamiczną spinek RNA. Dodatkowo, stabilność termodynamiczna spinek RNA może
być zwiększona przez oddziaływanie z antybiotykami.
Kolejnym etapem badań było określenie struktury drugorzędowej jedenastu 194/195
nukleotydowych fragmentów pre-mRNA genu MAPT. Mapowanie struktury drugorzędowej
wykonano trzema metodami: wykorzystując izoenergetyczne macierze RNA, metodę SHAPE
i z użyciem siarczanu dimetylu (DMS). Dane eksperymentalne zostały wsparte programami
komputerowymi służącymi do przewidywaniu pofałdowania RNA i pozwoliły na
zaproponowanie struktury drugorzędowej badanego fragmentu pre-mRNA. Dodatkowo, na
podstawie otrzymanej struktury drugorzędowej udało się wymodelować strukturę
trzeciorzędową o optymalnej energii swobodnej.
Ostatnią częścią badań były eksperymenty na liniach komórkowych cos-7, które
obejmowały badanie wpływu mutacji na alternatywne składanie eksonu 10 pre-mRNA genu
MAPT. Z wyjątkiem jednej mutacji (19G), udało się zauważyć korelacje pomiędzy
stabilnością termodynamiczną regulatorowej spinki ISS, a ilością powstających izoform 3R i
4R białka tau. Ponadto, wykorzystano ligandy niskocząsteczkowe (neomycyna, kanamycyna,
tobramycyna i mitoksantron) do regulacji procesu splicingu eksonu 10. Wszystkie badane
ligandy, oprócz mitoksantronu, powodowały zwiększenie ilości izoformy 4R białka tau w
przypadku mutacji naturalnie występujących w FTDP-17 i destabilizujących regulatorową
spinkę ISS (11C, 12U, 13G, DD-PAC, 16U). Dodatkowo, w eksperymentach na liniach
komórkowych badano także wpływ modyfikowanych oligonukleotydów antysensowych,
nakierowanych na blokowanie innych niż spinka ISS elementów regulujących splicing
eksonu 10. Także w tym przypadku udało się zmienić stosunek ilościowy tworzących się
izoform białka tau.
Wyniki uzyskane we wszystkich przeprowadzonych badaniach pozwoliły na zaproponowanie
nowego modelu regulacji alternatywnego splicingu eksonu 10 pre-mRNA genu MAPT.
Postuluje on, że po transkrypcji do cząsteczki pre-mRNA przyłączają się czynniki
splicingowe powodujące lokalną rearanżację struktury, co uniemożliwia rozpoznanie miejsca
akceptorowego eksonu 10. Zmiany w ilości izoform białka tau spowodowane mutacjami
destabilizującymi spinkę regulatorową wynikają z niemożności wiązania się białka PSF do
takiej spinki. Mutacja 19G nie wpływa na stabilność termodynamiczną spinki, ale powoduje
stabilizację motywu dwuniciowego powstałego w wyniku lokalnej rearanżacji pre-mRNA. W
konsekwencji ilości tworzących się 3R i 4R izoform białka tau są odmienne od tych
tworzonych w przypadku pre-mRNA typu dzikiego.