DZIEŃ 1 Neurobiologia – Genetyka Medyczna Grupa ćw. Nazwiska

DZIEŃ 1
Neurobiologia – Genetyka Medyczna
Grupa ćw.
Nazwiska:
1.A. IZOLACJA DNA
Materiał: komórki ludzkie (fibroblasty mrożone -80˚C)
Metoda: komercyjny zestaw kolumienkowy opiera się na zdolności wiązania DNA do złóż
krzemionkowych w wysokich stężeniach soli chalotropowych. Komórki lizowane są w buforze
zawierającym detergenty niejonowe oraz proteazę (Proteinaza K). W tych warunkach dochodzi do lizy
komórek i degradacji wszelkich białek. Następnie mieszanina nanoszona jest na mini kolumnę ze
złożem krzemionkowym. Dna przechodząc przez złoże osiada na nim, podczas gdy zanieczyszczenia
przechodza niezwiązane. Po wypłukaniu z kolumny resztek zanieczyszczeń, oczyszczony DNA
wymywany jest z niej niskojonowymi buforami lub ddH2O.
Izolacji dokonujemy zgodnie z procedurą dostarczoną z zestawem.
Uwagi:
2. POMIAR STĘŻENIA DNA, OCENA JAKOŚCI
Pomiar spektrofotometryczny za pomocą urządzenia NanoDrop.
Pomiaru dokonuje się w objętości 1,5 μl po uprzedniej kalibracji urządzenia z użyciem tego
samego buforu, w którym rozpuszczony jest DNA.
Długość fali (nm)
substancje absorbujące:
260
DNA, RNA
280
białka
Stosunek absorpcji A260/A280 (ratio) świadczy o zanieczyszczeniu kwasów nukleinowych
białkami. Wartości optymalne A260/A280 przy których izobat DNA uznaje się za czysty to:
1,8-2,0 (ratio).
DNA………………….. (ng/μl)
Ratio A260/A280……………………
1
DZIEŃ 1
Neurobiologia – Genetyka Medyczna
Grupa ćw.
Nazwiska:
Co powinieneś umieć (Sylabus):
Homogenizacja materiału biologicznego (homogenat, lizat, ekstrakt, sonikacja, permeabilizacja).
Metody oczyszczania białek (chromatografia powinowactwa, żelowa, kolumnowa, jonowymienna,
hydrofobowa; wirowanie różnicowe, wirowanie w gradiencie gęstości; sedymentacja szybkościowa,
równowagowa; frakcjonowanie; dializa; supernatant).
Metody oczyszczania kwasów nukleinowych (ekstrakcja fenol/chloroform; odsalanie białek, metody
kolumienkowe; elektroforeza w żelu agarozowym).
Metody analizy jakościowej i ilościowej białek (elektroforeza w żelu poliakrylamidowym, Western
blotting; elektroforeza dwukierunkowa; ogniskowanie izoelektryczne; sekwencjonowanie białek,
spektroskopia mas, krystalografia rentgenowska, spektroskopia NMR, spektroskopia dichroizmu
kołowego, termostabilność białek).
Metody analizy jakościowej i ilościowej RNA (Technika northern-blot; RT-PCR; RT-qPCR; SAGE
(serial analysis of gene expression); Mikromacierze; Hybrydyzacja in situ (tech. mikroskopowa);
RNAseq: Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie transkryptomów).
Metody analizy jakościowej i ilościowej DNA (Enzymy restrykcyjne; Hybrydyzacja (renaturacja):
Southern Blotting, DNA fingerprinting, Northern blotting, In situ hybridization (FISH); Amplifikacja DNA
metodą PCR (łańcuchowej reakcji polimerazy); Wizualizacja produktów PCR następuje poprzez
rozdział elektroforetyczny: PCR-Multiplex; PCR-RFLP (analiza polimorfizmu długości fragmentów
restrykcyjnych); Sekwencjonowanie enzymatyczne metodą Sangera; Sekwencjonowanie równoległe,
Next Generation Sequencing).
2