Zastosowanie technik biologii molekularnej w diagnostyce chorób
advertisement
Zastosowanie technik biologii molekularnej w diagnostyce chorób dziedzicznych Choroba dziedziczna • schorzenie spowodowane przez mutacje jednego lub więcej genów lub też aberrację chromosomalną przekazywane w rodzinie w kolejnym pokoleniu • zmiany w DNA zostają przekazane w gametach rodziców bądź też pojawiają się we wczesnych etapach rozwoju zarodkowego (jako mutacje de novo) Test genetyczny • analiza ludzkiego DNA, RNA, chromosomów, białek i określonych metabolitów • umożliwia identyfikację odpowiednich genotypów, mutacji, fenotypów lub kariotypu • wykonywany do celów klinicznych i poradnictwa genetycznego Cel wykonywania testu genetycznego • zdiagnozowanie genetycznej przyczyny choroby lub • wykazanie, że osoba posiada jedna lub więcej zmian genetycznych: – mogących spowodować rozwój choroby lub – mogących wywołać chorobę u potomstwa lub – mających znaczenie dla postępowania leczniczego. Testy genetyczne oparte na analizie DNA • niezależne od znajomości patogenezy choroby • niezależne od ekspresji badanego genu • wynik testu niezależny od momentu wystąpienia objawów klinicznych czy zmian w środowisku mogących wpływać na ujawnienie się kliniczne genotypów • wynik testu stały w ciągu całego życia Materiał do badań DNA - krew obwodowa, - hodowla fibroblastów skóry, - plamy krwi, - komórki nabłonka jamy ustnej, - cebulki włosowe, do badań prenatalnych: - komórki płynu owodniowego, - komórki trofoblastu (możliwość analizy w I trymetrze ciąży) Specyficzność analizy nie zależy od rodzaju tkanki użytej do badania. Strategie metodyczne w diagnostyce molekularnej analiza sposobu dziedziczenia danego genu (analiza sprzężeń) bezpośrednia analiza mutacji Analiza sposobu dziedziczenia (analiza sprzężeń) • polega na na śledzeniu w rodzinie przekazywania określonego markera genetycznego sprzężonego ze zmutowanym genem • wykorzystuje fakt kosegregacji loci markera i genu powodującego chorobę – marker i gen ze względu na bliskie położenie na chromosomie dziedziczą się wspólnie Markery genetyczne stosowane w analizie sprzężeń Marker genetyczny – dowolna sekwencja DNA możliwa do identyfikacji, występująca w co najmniej dwóch formach allelicznych 1. SNP - Southern blotting, - PCR-RFLP, - PCR-ASO, - sekwencjonowanie, - mikromacierze 2. Sekwencje powtórzone (np. mikrosatelitarne) - ocena wielkości produktu PCR w żelu poliakrylamidowym Analiza sposobu dziedziczenia (analiza sprzężeń) • możliwa nawet przy brak znajomości/możliwości bezpośredniej identyfikacji mutacji chorobotwórczej • konieczność badania rodziców chorego • nie służy do weryfikacji rozpoznania klinicznego (opiera się na nim) • umożliwia wykrycie nosicielstwa u krewnych chorego • obciążona ryzykiem błędu wynikającego ze zjawiska rekombinacji (badanie co najmniej dwóch markerów) Analiza sposobu dziedziczenia markera XV2C sprzężonego z genem CFTR w rodzinie ryzyka mukowiscydozy. Strategie metodyczne w diagnostyce molekularnej analiza sposobu dziedziczenia danego genu (analiza sprzężeń) bezpośrednia analiza mutacji Bezpośrednia analiza mutacji • weryfikuje rozpoznanie kliniczne • brak ryzyka błędu diagnostycznego wynikającego ze zjawiska rekombinacji • konieczna znajomość mutacji powodującej chorobę Współczesna rutynowa diagnostyka molekularna – głównie analiza znanych mutacji. Bezpośrednia analiza mutacji przeszukiwanie genu poszukiwanie konkretnej mutacji/grupy mutacji Przeszukiwanie genu • nie wiadomo, która z licznych mutacji powoduje defekt genu • w populacji brak mutacji specyficznych o dużej częstości występowania sekwencjonwanie, poprzedzone badaniem metodą przesiewową (SSCP, HA, DGGE) Bezpośrednia analiza mutacji przeszukiwanie genu poszukiwanie konkretnej mutacji/grupy mutacji Poszukiwanie konkretnej mutacji - mutacje punktowe 1) analiza restrykcyjna - PCR-RFLP - Southern blotting 2) PCR-ASO 3) sekwencjonowanie 4) mikromacierze DNA Analiza mutacji punktowej w genie -globiny powodującej anemię sierpowatokrwinkową (Southern blotting). Poszukiwanie konkretnej mutacji – insercje, delecje, duplikacje 1) analiza wielkości produktu PCR – małe delecje 2) Southern blotting – duże delecje lub duplikacje, – duże powtórzenia trójnukleotydowe, Analiza delecji 508 w rodzinie ryzyka mukowiscydozy (analiza długości produktu PCR) 1. Czym spowodowane są choroby dziedziczne? 2. Co to jest test genetyczny i do czego służy? 3. Jaki materiał stosuje się do badania DNA w diagnostyce chorób dziedzicznych? 4. Na czym polega i do czego służy analiza sposobu dziedziczenia? 5. Na czym polega przeszukiwanie genu? Jakie techniki się tu wykorzystuje?
