SESJA 8

Sesja sponsorowana przez
Olympus Optical Polska
SESJA 8
DIAGNOSTYKA GENETYCZNA.
TERAPIA GENOWA
WYKŁADY
180
SESJA 8 WYKŁADY
W08-01
DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA-METODY WYKRYWANIA MUTACJI W GENACH
Włodzimierz J. Krzyżosiak, Piotr Kozłowski, Anna Jasińska, Marta Birak, Krzysztof Sobczak
Instytut Chemii Bioorganicznej PAN, Poznań
Nowe tendencje w diagnostyce genetycznej chorób człowieka ukazane są z perspektywy poznanej sekwencji
ludzkiego genomu i zaawansowanych badań nad jego polimorfizmem. Przedstawiony jest postęp w poznawaniu związków między genami i chorobami oraz rozwój metod wykrywania mutacji w genach, któremu towarzyszy miniaturyzacja aparatury i skokowy wzrost możliwości jednoczesnego prowadzenia wielu analiz. Na
przykładzie badań genów BRCA1 i BRCA2 pokazana jest droga prowadząca od odkrycia genu poprzez opracowanie testu genetycznego do jego wykorzystania w działaniach profilaktycznych i praktyce klinicznej.
Przedstawione są również kierunki i podsumowane wyniki badań własnych genów BRCA1 i BRCA2 prowadzonych od kilku lat w Pracowni Genetyki Nowotworów IChB PAN. Główne nurty tych badań obejmowały wykrywanie mutacji predysponujących do choroby nowotworowej w grupie podwyższonego ryzyka, ulepszanie najczęściej stosowanych metod wykrywania mutacji w genach, analizę powszechnych wariantów polimorficznych i
rzadkich wariantów sekwencji w aspekcie ich związku z ryzykiem raka piersi oraz badanie potencjalnej roli transkryptu w patogenezie.
DIAGNOSTYKA GENETYCZNA. TERAPIA GENOWA
181
W08-02
MOLEKULARNE PODSTAWY DIAGNOSTYKI NOWOTWORÓW
Janusz A. Siedlecki
Centrum Onkologii-Instytut, Zakład Biologii Molekularnej, Warszawa
Obecny stan wiedzy o molekularnych mechanizmach karcinogenezy nie wydaje się stwarzać nadziei na znalezienie wielu jednoznacznych korelacji pomiędzy określona zmianą, a typem nowotworu. Dlatego większość opracowywanych obecnie testów diagnostycznych nastawiona jest raczej na jak najwcześniejsze odróżnienie komórki
nowotworowej od normalnej. W warunkach początkowych, gdy masa nowotworu jest niewielka analiza morfologiczna jest często niewystarczająca do zidentyfikowania małej grupy zmienionych komórek. Podobnie zawodne mogą okazać się techniki immunocytochemiczne. Biologia molekularna oferuje narzędzia pozwalające na wykrycie zmian w DNA, RNA i białkach nawet w pojedynczej komórce.
Dzięki technice PCR możliwe jest otrzymanie ponad miliona kopii danego fragmentu DNA z pojedynczej nici
cząsteczki obecnej w przednowotworowej lub nowotworowej komórce. Stało się więc możliwe wykrycie małej
grupy nieprawidłowych komórek, które złuszczyły się z nowotworu do płynów ustrojowych – takich jak krew,
mocz, plwocina, czy nawet wydzielina z sutka. W cytologicznie negatywnych próbkach plwociny, na 10 przebadanych przypadków w 8 stwierdzono obecność komórek z mutacją w genach Ki-RAS lub P53. We wszystkich
tych przypadkach rak płuc został klinicznie potwierdzony w 1–4 miesięcy później, a w przypadku jednego z pacjentów aż 13 miesięcy później. Metoda PCR umożliwia również wykazanie obecności mikronacieków w obszarze otaczającym usuniętą wraz z odpowiednim marginesem zmianę pierwotną oraz ujawnienie mikroprzerzutów w węzłach chłonnych.
Technika PCR oparta o tkankowo-specyficzne markery pozwala na znalezienie nawet kilkuset komórek nowotworowych krążących we krwi obwodowej. Poszukuje się tą metodą komórek nowotworowych krążących we
krwi obwodowej u chorych po radykalnym zabiegu chirurgicznym i/lub z czynnym procesem nowotworowym.
Eksperymenty tego typu prowadzone są dla raka prostaty, sutka, płuca i czerniaka. W Centrum Onkologii opracowaliśmy dwumarkerową metodę pozwalającą na wykrycie (w całkowitym RNA izolowanym z krwi obwodowej) obecności mRNA dla tyrozynazy i MART 1 – transkrypów specyficznych dla komórek czerniaka. Z pobranej
krwi izolowano całkowite RNA, a następnie przy pomocy odwrotnej transkryptazy syntetyzowano cDNA. W celu
ujawnienia obecności transkryptów przeprowadzano reakcję PCR. Badania nad czułością reakcji amplifikacji pozwoliły na ustalenie, że możliwe jest wykrycie krążących komórek czerniaka, gdy ich liczba jest większa niż 1000
w pełnej objętości krwi.
Wysoce obiecujące jest wykorzystanie do identyfikacji komórek nowotworowych analizy sekwencji mikrosatelitarnych. Zmiany w ich obrębie są świadectwem niestabilności genomu wywołanej na przykład mutacją w genie
mutatorowym. Prostota analizy powtórzeń mikrosatelitarnych oraz możliwość pełnego jej zautomatyzowania
stanowi o przewadze tej techniki w porównaniu z techniką wykrywania specyficznych mutacji.
182
SESJA 8 WYKŁADY
W08-03
ANALIZY MOLEKULARNE W DIAGNOSTYCE WYSOKIEJ GENETYCZNEJ PREDYSPOZYCJI
DO NOWOTWORÓW
Jan Lubiński
Ośrodek Nowotworów Dziedzicznych, Pomorska Akademia Medyczna, Szczecin
W ostatnich latach wykryto, że 5–10% wszystkich nowotworów złośliwych w tym tzw. pospolitych nowotworów
jak raki sutka, jelita grubego lub jajnika, wywołanych jest mutacjami w jednym z genów związanych z zespołami
nowotworów dziedzicznych.
Diagnostyka tych zespołów oparta jest o ocenę danych rodowodowo-klinicznych oraz o testy DNA/RNA.
W naszym ośrodku zdiagnozowano ~1000 rodzin z dziedzicznymi predyspozycjami do raków różnych
narządów. W ~20% z nich wykryto mutacje markerowe dla rodzin.
Znalezienie mutacji umożliwiło postawienie jednoznacznej diagnozy w wielu rodzinach w których rozpoznanie
zespołu dziedzicznej predyspozycji mogło być jedynie podejrzewane na podstawie danych rodowodo-klinicznych. Ponadto testy molekularne zmniejszyły o około 50% liczbę osób, które zakwalifikowano do kosztownych
programów intensywnych badań kontrolnych. W części przypadków testy DNA okazały się jedyną metodą umożliwiającą zdiagnozowanie genetycznej predyspozycji w związku z wystąpieniem mutacji germinalnych „de
novo”. Techniki stosowane w naszym ośrodku obejmują sekwencjonowanie, SSCP, „long PCR” i „Southern blotting”.
Testy na BRCA1, BRCA2 są już obecnie tanie dzięki wykryciu „founder effect” w polskiej populacji. Dzięki wprowadzeniu nowych algorytmów diagnostyki klinicznej i laboratoryjnej osiągnięto znaczną redukcję kosztów badania genów hMSH2, hMLH1 (rak jelita grubego), VHL (nowotwory mózgu, nadnercza, nerek i oka) oraz Rb-1 (siatkówczak oka).
DIAGNOSTYKA GENETYCZNA. TERAPIA GENOWA
183
W08-04
DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA: PRZYKŁADY Z DYSTROFII MIĘŚNIOWEJ, STWARDNIENIA
GUZOWATEGO, RODZINNEJ POLIPOWATOŚCI JELITA I OSTEOPOROZY
Ryszard Słomski
Zakład Genetyki Człowieka PAN, Poznań
Katedra Biochemii i Biotechnologii AR, Poznań
Dystrofia mięśniowa Duchenne’a, najczęstsza choroba genetyczna sprzężona z chromosomem X, występuje z
częstością 1 na 3500 noworodków płci męskiej i w 30% przypadków jest następstwem nowych mutacji. Najczęstszymi mutacjami w genie DMD są duże delecje, które stanowią 50% wszystkich mutacji. Analizę delecji przeprowadzono dla 46 chorych. Wykryto je u 20 osób. Dla 41 osób przeprowadzono analizę mutacji punktowych w
22 regionach genu DMD. Metody przesiewowe (PCR-SSCP i PCR-HD) umożliwiły wykrycie mutacji punktowych u
17% chorych. Analizę nosicielstwa przeprowadzono dla 38 rodzin. W 6 przypadkach marker położony był w regionie, który u chorego uległ delecji. Dodatkowo analiza wybranych markerów pozwoliła na zidentyfikowanie 7
przypadków rekombinacji wewnątrzgenowych. Stwardnienie guzowate (TSC) jest chorobą autosomalną, dominującą, występującą z częstością 1/10000 urodzeń. TSC charakteryzuje się zmianami w mózgu, sercu i nerkach, o
różnym nasileniu w zależności od wieku, jak również zróżnicowaniem klinicznym u członków tej samej rodziny.
Analizę mutacji wykonano łącznie dla 161 chorych i zidentyfikowano 17 mutacji, położonych w różnych eksonach. Rodzinna polipowatość jelita grubego (FAP) jest dziedzicznie warunkowaną podatnością na występowanie
w jelicie grubym licznych polipów, które charakteryzują się wysokim potencjałem do rozwoju w kierunku nowotworu złośliwego. Choroba jest cechą autosomalną, dominującą, warunkowaną dziedzicznymi mutacji w genie
supresorowym APC na chromosomie 5q21. Badaniami objęto 250 osób z rodzin z FAP. U chorych z FAP zidentyfikowano 16 typów mutacji w genie APC w 28 rodzinach oraz 2 substytucje nie powodujące zmiany aminokwasu. Najczęściej występującą mutacją była delAAAGA1309 (9,4% rodzin). Osteoporoza należy do chorób o wzrastającej częstości występowania. Jednym z genów mogących uczestniczyć w rozwoju osteoporozy jest gen osteoprotegeryny (OPG). Wykorzystując analizę PCR-HD, analizę PCR-SSCP oraz bezpośrednie sekwencjonowanie
DNA od 85 chorych na osteoporozę lub osteopenię wykryto 7 polimorfizmów: 6 w intronach oraz transwersję w
eksonie 1 (9G>C). Transwersja 9G>C powoduje zmianę konserwatywnej, dodatnio naładowanej lizyny na neutralną asparaginę w trzecim kodonie sekwencji sygnałowej. Uzyskane wyniki pozwoliły oszacować iloraz szans
wystąpienia osteoporozy równy 2,99 dla osób posiadających allel C.
184
SESJA 8 WYKŁADY
W08-05
WEKTORY WIRUSOWE W TERAPII GENOWEJ
Andrzej Mackiewicz
Zakład Immunologii Nowotowrów, Akademia Medyczna, Wielkopolskie Centrum Onkologii, Poznań
Opracowanie technologii rekombinowanych wirusów w celu przenoszenia genów stało się przełomem, który
umożliwił zastosowanie terapii genowej u ludzi. Obecnie wykorzystuje się kilkanaście rodzajów wirusów zarówno wirusów RNA jak i DNA. Generalna zasada konstrukcji wektorów wirusowych polega na tym, iż z materiału
genetycznego wirusa usuwa się niektóre sekwencje odpowiedzialne za kodowanie ich elementów strukturalnych
(aby zapobiec replikacji w komórce docelowej, obniżyć immunogenność, itp.). W zamian za to wprowadza się
geny terapeutyczne i często geny selekcyjne. Najczęściej obecnie używane w badaniach klinicznych są wektory
Retrowirusowe (RV), następnie Adenovirusowe (AdV), Adeno-Associated (AAV), Herpes czy Poxwirusowe. Ostatnio opracowano wektory oparte na Lentiwirusach (HIV) oraz wirusie SV40. Każdy z wektorów charakteryzują odrębne cechy związane z biologią poszczególnych wirusów. RV wprowadzają geny do komórek dzielących się, integrując na stałe swój materiał genetyczny z genomem komórki docelowej. AdV wprowadzają geny do komórek
nie dzielących i dzielących się bez integracji z genomem komórki docelowej. AAV wprowadzają geny do komórek
dzielących i nie dzielących się prowadząc do stałej ich integracji z genomem. Wektory Lentiwirusowe oraz SV40
maja podobne właściwości do AAV, jednak uważa się, że są znacznie efektywniejsze, szczególnie w przypadku
wprowadzania genów do wczesnych komórek pnia (CD34+). Powyższe cechy determinują zastosowanie poszczególnych wektorów, np. RV są doskonałym narzędziem do konstrukcji genetycznych szczepionek komórkowych (GMTV), AdV do transdukcji komórek nabłonkowych drzewa oskrzelowego w mukowiscydozie.
212
SESJA 8 WYKŁADY
W08-06
ANTYANGIOGENNA TERAPIA GENOWA
Stanisław Szala, Jarosław Szary
Zakład Biologii Molekularnej, Centrum Onkologii, Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie, Gliwice
Szereg danych wskazuje, że proces powstawania unaczynienia w nowotworach litycznych – angiogeneza – odgrywa ważną rolę zarówno w ich progresji jaki i w powstawaniu przerzutów. Tworzenie sieci okołonowotworowych naczyń krwionośnych jest złożonym procesem, rezultatem wzajemnych oddziaływań komórek nowotworowych z komórkami śródbłonkowymi, a także ze strukturalnymi elementami macierzy zewnątrzkomórkowej.
Wydzielane przez komórki nowotworowe czynniki wzrostowe, przy jednoczesnym zmniejszaniu się poziomu inhibitorów angiogenezy, indukują powstawanie unaczynienia. Odkrycie swoistych, endogennych inhibitorów
stworzyło nowe możliwości dla terapii nowotworów.
Jednym z takich inhibitorów jest odkryta przez grupę J. Folkmana endostatyna. Endostatyna została zidentyfikowana jako proteolityczny C-końcowy fragment kolagenu XVIII. Endostatyna posiada silne właściwości hamowania angiogenezy, w tym angiogenezy indukowanej przez nowotwory: silnie hamuje wzrost guzów pierwotnych oraz ogranicza ilość i wzrost przerzutów. Wprowadzanie do komórek nowotworowych, a także niektórych
komórek prawidłowych, genów kodujących białkowe inhibitory angiogenezy, może stać się cenną innowacją w
antyangiogennej terapii nowotworów. Zaproponowana tu strategia wprowadzania in vivo plazmidu kodującego endostatynę jest alternatywą dla podawania zrekombinowanego białka (co jest bardzo drogie) oraz
dla stosowania wektorów wirusowych (podejście skomplikowane technicznie, dość drogie i stwarzające niebezpieczeństwo mutacji insercyjnych).
Sekwencje kodujące – fragmentu 184 C-końcowych aminokwasów z mysiego kolagenu XVIII – zostały zsyntetyzowane przy pomocy reakcji PCR z wykorzystaniem jako matrycy plazmidu zawierającego cDNA kolagenu XVIII.
Sekwencje kodujące endostatynę zostały połączone z sekwencją sygnalną hemaglutyniny z wirusa grypy, a następnie przeklonowane do wektorów ekspresyjnych. Plazmid kodujący endostatynę wprowadzono do komórek
mysiego raka nerki Renca. W eksperymentach in vivo stwierdzono, że guzy wywodzące się z komórek wydzielających endostatynę rosną u myszy wolniej w porównaniu z guzami wywodzącymi się z komórek transfekowanych pustym wektorem. W eksperymentach terapeutycznych użyto plazmidu VR1012 zawierającego sekwencję
kodującą endostatynę. Podawano doguzowo DNA plazmidowy nieskompensowany z nośnikami. Zaobserwowano wyraźne zahamowanie wzrostu guzów w grupach myszy leczonych plazmidem z endostatyną w porównaniu do myszy, którym podawano „pusty” wektor nie zwierający wstawki.