Elementy bioinformatyki. Aminokwasy, białka, receptory
advertisement
Elementy bioinformatyki. Aminokwasy, białka, receptory Andrzej Bąk Instytut Chemii UŚ chemoinformatyka wykład 1 Tematy Historia odkrywania białek Budowa białek Budowa aminokwasów Właściwości aminokwasów Wiązanie peptydowe Przestrzenne struktury białek Oddziaływania ligand-receptor Biosynteza białek Chemia białek – rys historyczny w 1816 francuski fizjolog F. Magendi roku wskazał białka jako niezbędne składniki diety człowieka W 1839 roku G. J. Mulder wprowadził do nomenklatury chemicznej, stosowaną do chwili obecnej, nazwę „protein” (greckie „proteios” – pierwszy, przodujący, polskie „proteina”) W. Kuhne, F. Hoffmeister, A. Kossel oraz A. Danilewski, którzy badali struktury białek wskazując na istnienie „cegiełek strukturalnych” – aminokwasów Prace badawcze niemieckiego chemika E. Fischera doprowadziły do pierwszych laboratoryjnych syntez związków zawierających wiązanie peptydowe W kolejnych latach zidentyfikowano wszystkie aminokwasy występujące w białkach, kierując badania w stronę określania ich struktury makrocząsteczkowej. Chemia białek – rys historyczny Opierając się na danych eksperymentalnych L. Pauling oraz R. B. Corey zaproponowali obowiązujące do dziś koncepcje modeli przestrzennych łańcuchów polipeptydowych budujących białka Lata pięćdziesiąte ubiegłego wieku to intensywny rozwój technik sekwencjonowania (określania kolejności aminokwasów) białek. Przełomem był rok 1953, w którym Fredrick Sanger określił skład strukturalny hormonu białkowego (hormon trzustki) – insuliny białka mają ściśle określone sekwencje aminokwasowe, które uwarunkowane są specyficznym kodem genetycznym Badaniem zaburzeń sekwencji aminokwasów bezpośrednio wpływających na funkcjonowanie białek (np. choroby: mukowiscydoza lub niedokrwistość sierpowata) zajmuje się nowa dziedzina medycyny – patologia molekularna Budowa białek Wszystkie białka, mimo swej różnorodności, mają jedną cechę wspólną – zbudowane są z połączonych ze sobą monomerycznych jednostek (fragmentów), które hydrolizują do związków zwanych aminokwasami Można je zatem traktować jako polimery liniowe (poliamidy), złożone z podjednostek (monomerów) połączonych wiązaniem peptydowym Nomenklatura i klasyfikacja tej grupy związków w znacznym stopniu zależy od liczby jednostek aminokwasowych (peptydów) w cząsteczce. Peptyd zbudowany z dwu aminokwasów to dipeptyd, z 3 aminokwasów – tripeptyd, itd. Związki zawierające do 10 reszt aminokwasów nazywane są oligopeptydami, zaś peptydy posiadające więcej niż 10 reszt aminokwasowych zaliczane są do grupy polipeptydów. Zgodnie z przyjętą umową, białko składa się z około 100 aminokwasów połączonych wiązaniem peptydowym Budowa aminokwasów „białka są ucieleśnieniem przejścia jednowymiarowego świata sekwencji do trójwymiarowego świata cząstek o odmiennych właściwościach” Podstawowym elementem budulcowym białek jest zestaw 20 naturalnych aminokwasów (niekiedy podawana jest liczba 19 aminokwasów i jednego iminokwasu – proliny) Tworzą one dwie podstawowe grupy: aminokwasy egzogenne (przyjmowane z pokarmem) i endogenne (syntezowane w organizmach zwierząt). Dla ułatwienia wprowadzono również trzyliterowe skróty oraz symbole jednoliterowe Najogólniej aminokwasy to związki dwufunkcyjne, które można zapisać wzorem ogólnym postaci: (H2N-)m-Z-(-CO2H)n Z - łańcuch węglowy n, m – liczby naturalne. Budowa aminokwasów Wszystkie aminokwasy naturalne, które budują białka (tzw. „cegiełki białkowe”) zbudowane są z centralnego atomu węgla, określanego jako węgiel α, połączonego z atomem wodoru, grupą α-aminową, grupą α-karboksylową oraz podstawnikiem (R) o zróżnicowanej budowie, który nazywany jest często łańcuchem bocznym. H R C * CO2H NH2 Obecność czterech różnych grup funkcyjnych połączonych z tetraedrycznym atomem węgla wskazuje, iż aminokwasy to związki optycznie czynne (ich roztwory skręcają płaszczyznę światła spolaryzowanego) Budowa aminokwasów Wyjątek stanowi glicyna (Gly), której podstawnik (R) zastąpiony został atomem wodoru. Jest to jedyny aminokwas achiralny – brak jest asymetrycznego atomu węgla stanowiącego centrum chiralności. Każdy aminokwas może występować w dwóch odmianach: lewo lub prawoskrętnej, które stanowią swoje wzajemne odbicie lustrzane (enancjomery), podobnie jak lewa i prawa dłoń człowieka Budowa aminokwasów Naturalne aminokwasy, które wchodzą w skład białek (tak zwane aminokwasy białkowe) mają konfigurację L. L – α – aminokwas (enancjomer białkowy) D – α – aminokwas (enancjomer niebiałkowy) centrum asymetryczne powinno być zdefiniowane zgodnie z regułami CIP (Cahna - Ingolda - Preloga) jako S (łac. sinister – „lewy”) lub R (łac. rectus – „prawy”). Aminokwasy mają w tej nomenklaturze konfigurację S, choć często spotykana jest również starsza terminologia L, D Właściwości aminokwasów Jednoczesna obecność w cząsteczce grupy karboksylowej oraz aminowej sprawia, iż aminokwasy posiadają właściwości kwasowo-zasadowe (amfoteryczne). W roztworze fizjologicznym (pH 7,4 ÷ 7,6) aminokwasy ulegają swoistej reakcji wewnętrznego zobojętniania, która polega na przeniesieniu protonu H+ od grupy karboksylowej do aminowej R H * C O NH2 OH H R O C* + NH3 - O Struktura tak utworzonej formy dwubiegunowej (soli wewnętrznej) podana została w 1923 roku przez Bjerruma Właściwości aminokwasów W roztworach obojętnych cząsteczki te występują głównie w postaci jonów obojnaczych, tzw. zwitterionów W roztworze kwaśnym aminokwas zachowuje się jak zasada, przyłączając proton wodoru do grupy aminowej. Dodatnia zasadowa cząsteczka aminokwasu z uprotonowaną grupą aminową (-NH3+) oraz niezjonizowaną grupą karboksylową (-COOH) jest kationowym kwasem (dawcą protonów). W roztworze o pH powyżej 9 grupa aminowa oraz karboksylowa ulegają deprotonowaniu, przyjmując postać anionowej zasady H R O C* + NH3 OH w środowisku kwaśnym H -H+ +H+ R O C* + NH3 - O forma dwubiegunowa -H H + +H+ R O C* - NH2 O w środowisku zasadowym Właściwości aminokwasów w roztworze fizjologicznym grupą kwasową aminokwasu jest grupa -NH3+ (nie COOH), zaś zasadową -COO- (nie NH2). Dipolowy jon obojnaczy z protonowaną grupą aminowa (-NH3+) oraz deprotonowaną grupą karboksylową (-COO-) jest związkiem amfoterycznym (amfoterem), którego budowa (stan jonizacji) uzależniona jest od pH roztworu W przypadku przyłożenia zewnętrznego pola elektrycznego zjonizowany aminokwas przesunie się do jednej z elektrod (zależnie od odczynu środowiska, przy pH < 7 – do ujemnej katody, pH > 7 – do dodatniej anody). Powyższe zjawisko nazywane jest elektroforezą Właściwości aminokwasów Różnorodność cech monomerycznych składowych białka, niezbędnych do zrozumienia istoty jego funkcji i budowy, wynika głównie z różnic kształtu, hydrofobowości/hydrofilowości (polarności), zdolności do tworzenia wiązań wodorowych, charakteru elektrostatycznego oraz reaktywności podstawnika R. Aminokwasy alifatyczne z apolarnym łańcuchem bocznym oraz hydrofobowością zwiększającą się z długością łańcucha. Zaliczyć tutaj można: Gly, Ala, Val, Leu, Ile oraz niekiedy Pro. Aminokwasy alifatyczne o słabej polarności, zawierające: + grupę hydroksylową (-OH): Ser, Thr + grupę tiolową (-SH): Cys + siarkę (S): Met • Aminokwasy cykliczne, zawierające układ aromatyczny: + o właściwościach hydrofobowych: Phe + o małej polarności: Trp, Tyr Właściwości aminokwasów Aminokwasy zawierające grupy o kwasowym charakterze polarnego podstawnika + grupę karboksylową: Asp, Glu + grupę karboksyamidową: Asn, Gln • Aminokwas o zasadowym charakterze polarnego podstawnika, zawierające + heterocykliczną grupę imidazolową: His H H + grupę guanidynową: Arg H + -H+ - H CH2 C CO2 N N CH2 N CH2 C CO2 + grupę aminową: Liz + + N H NH3 + N H + NH3 +H N H Ważnym elementem miejsca aktywnego enzymu jest histydyna (His), która w zależności od otoczenia występować może w dwóch odmianach: obojętnej (akceptor protonu) lub obdarzonej ładunkiem dodatnim (donor protonu). H - C CO2 + NH3 Właściwości aminokwasów a hydrofobowy + H2N C H H N (CH2)3 C H2N 2 HN - CO2 + + C H H N (CH2)3 C + NH3 2 HN NH3 hydrofilowy b hydrofilowy H + H3N (CH2)4 - C CO2 + NH3 hydrofobowy - CO2 Wiązanie peptydowe Teoria o amidowym charakterze wiązań pomiędzy jednostkami aminokwasów zaproponowana została na początku wieku XX przez A. Danielewskiego Doświadczalne prace F. Hofmeistera oraz E. Fischera potwierdziły wcześniejsze przypuszczenia o istnieniu wiązania peptydowego, które powstaje na skutek połączenia grupy α-karboksylowej jednego aminokwasu z grupą α-aminową drugiego aminokwasu, czemu towarzyszy zawsze uwolnienie (dehydratacja) jednej cząsteczki wody Wiązanie peptydowe • Aminokwasy połączone wiązaniami peptydowymi tworzą spolaryzowany łańcuch polipeptydowy. Zgodnie z przyjętym zapisem N-terminalna reszta aminokwasu z wolną grupą aminową zapisywana jest po stronie lewej, podczas gdy C-terminalna z grupą karboksylową po stronie prawej. • wiązanie peptydowe jest wiązaniem zasadniczo płaskim, ponieważ dla pary aminokwasów, sześć atomów znajduje się w tej samej płaszczyźnie: atom węgla grupy karbonylowej, atom azotu oraz cztery atomy bezpośrednio do nich przyłączone Długość wiązania C ̶ N 0.132 nm) wskazuje, iż w znacznym stopniu wykazuje ono charakter wiązania podwójnego (ok. 50%) • Wiązanie peptydowe • • • W konsekwencji hamowana jest swobodna rotacja wiązania C ̶ N, zaś kąty wiązań przy atomie N przyjmują wartości zbliżone do kątów wiązania karbonylowego atomu węgla (sp2). W takim układzie wiązania C=O i N ̶ H są praktycznie równoległe, zaś atomy Cα mogą występować po tej samej (konformacja cis) lub przeciwnej (konformacja trans) stronie wiązania C ̶ N Planarna struktura wiązania peptydowego z częściowo podwójnym charakterem wiązania C N ogranicza labilność konformacyjną szkieletu peptydowego. (omega od -20 do 10o) Wzajemne oddziaływania (położenie) sąsiednich reszt aminokwasowych (R) korygowane mogą być przez rotację dwóch wiązań peptydowych wokół wiązań typowo pojedynczych, tworzonych przez grupę aminową i atom węgla α oraz węgiel α i grupę karbonylową. Wiązanie peptydowe • Dzięki swobodnej rotacji wokół obu wiązań, peptydy i białka mogą się zwijać, przyjmując zróżnicowane struktury przestrzenne. Rotację wokół tych wiązań określa się za pomocą dwóch kątów torsyjnych (dwuściennych): fi (ϕ) – wokół wiązania między atomem azotu i atomem węgla α oraz psi (ψ) – wokół wiązania między atomem węgla α i atomem węgla grupy karbonylowej O C swobodna rotacja N H brak rotacji • swobodna rotacja Teoretycznie, zmiany kątów rotacyjnych ϕ i ψ mogą przyjmować wartości z zakresu od -180° do +180°. Nie wszystkie kombinacje wartości kątów są jednakowo prawdopodobne. Wiązanie peptydowe • G. N. Ramachandran wykazał, iż zawada steryczna eliminuje ¾ wartości. Dozwolone wartości kątów rotacyjnych przedstawić można w postaci dwuwymiarowej (2D) mapy, nazywanej diagramem Ramachandrana Wiązanie peptydowe Przestrzenne struktury białek Z reguły naturalne łańcuchy polipeptydowe zawierają 50÷2000 reszt aminokwasowych i nazywa się je powszechnie białkami • peptydy złożone z małej liczby aminokwasów to oligopeptydy lub po prostu peptyd Struktura pierwszorzędowa • W przełomowym roku 1953 Fredrick Sanger określił sekwencję aminokwasową hormonu białkowego – insuliny • Struktura pierwszorzędowa podaje kolejność reszt aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym, połączonych kowalencyjnymi wiązaniami peptydowymi • Struktura ta jest następstwem łączenia się aminokwasów za pomocą wiązania peptydowego. • Przestrzenne struktury białek Badania przestrzennych relacji pomiędzy atomami wiązania peptydowego umożliwiły poznanie geometrycznych właściwości monomeru peptydowego – podstawowej podjednostki strukturalnej łańcucha polipeptydowego Struktura drugorzędowa • Podanie kątów pomiędzy sąsiednimi podjednostkami peptydowymi definiuje l lokalne ukształtowanie łańcucha polipeptydowego, tzw. drugorzędową strukturę białka. • Struktury drugorzędowe mogą występować w dwóch formach: regularnej lub nieregularnej. • W 1951 roku Linus Pauling i Robert Corey [2] opierając się na danych doświadczalnych zaproponowali dwie podstawowe koncepcje regularnej struktury przestrzennej wiązania peptydowego + cylindryczną prawoskrętną α-helisę + harmonijka β + zwrot β i pętlę Ω (pętlę omega) • Przestrzenne struktury białek Przestrzenne struktury białek • Helisę α tworzy szkielet polipeptydowy, który zwinięty jest w kształcie śruby prawoskrętnej • Helisa α jest strukturą skręconą, stabilizowaną przez wiązania wodorowe, które tworzą się między grupami NH i CO w obrębie łańcucha głównego Każda grupa CO aminokwasu tworzy wiązanie wodorowe z grupą NH aminokwasu zajmującego w sekwencji liniowej pozycję wysuniętą do przodu o cztery reszty aminokwasowe Przestrzenne struktury białek • jedna reszta aminokwasowa zajmuje 0,15 nm długości helisy i obrócona jest do poprzedniej reszty o kąt 100° wokół osi • Wiązania wodorowe tworzone są pomiędzy wszystkimi grupami NH i CO wiązania peptydowego – wyjątek stanowią jedynie grupy aminokwasów terminalnych • na końcach helisy prowadzony jest odpowiednio ładunek dodatni (grupa NH) oraz ujemny (CO), zaś utworzony dipol elektryczny oddziaływać może elektrostatycznie z otoczeniem • Równie prawdopodobne jest istnienie konformacji helisy lewoskrętnej i prawoskrętnej, jednak energetycznie uprzywilejowane są helisy prawoskrętne, ponieważ występuje w nich mniej zawad sterycznych między łańcuchami bocznymi a szkieletem aminokwasy • 38% reszt w białkach globularnych to helisy α • chętniej biorą udział w tworzeniu helisy α, inne zaś wręcz uniemożliwiają tworzenie się tej struktury Przestrzenne struktury białek • Do tzw. „helix-breakerów” należy prolina oraz hydroksyprolina a O CH C b HO O CH C N N H H • formowaniu się struktury helikalnej sprzyjają: kwas glutaminowy, metionina, alanina oraz leucyna, które określa się mianem „wzmacniaczy” • strukturą drugorzędową jest pofałdowana harmonijka β Odległość między kolejnymi wiązaniami peptydowymi wynosi 0,35nm, a reszty aminokwasowe skręcone są względem siebie o kąt 180° • 28% reszt w białkach globularnych Przestrzenne struktury białek • Ułożone mogą być w przeciwnych kierunkach, tworząc antyrównoległą harmonijkę β, w której grupy NH i CO każdego aminokwasu połączone są wiązaniami wodorowymi z odpowiednimi grupami CO i NH aminokwasu sąsiedniego łańcucha. • W przypadku, gdy mają ten sam kierunek, występuje tzw. równoległa harmonijka β. Grupa CO każdego aminokwasu jest połączona wiązaniem wodorowym z grupą NH aminokwasu sąsiedniej nici przesuniętej o dwie reszty względem osi łańcucha Przestrzenne struktury białek Przestrzenne struktury białek • Struktura ta powstaje na skutek utworzenia wiązania wodorowego w łańcuchu polipeptydowym pomiędzy grupą CO reszty i grupą NH reszty i+3 • pętle Ω, które w przeciwieństwie do helis α i zwrotu β nie posiadają okresowej struktury. Przestrzenne struktury białek Struktura trzeciorzędowa • Rozmieszczenie reszt bocznych aminokwasów opisuje ułożenie przestrzenne łańcucha polipeptydowego w przestrzeni, czyli jego strukturę trzeciorzędową • W utworzeniu struktury przestrzennej białek biorą udział również siły typu van der Waalsa (oddziaływania elektrostatyczne pomiędzy dipolami) Struktura czwartorzędowa • Struktura czwartorzędowa determinuje stopień polimeryzacji (dimer, trimer, itp.) oraz wzajemne ułożenia białek w przestrzeni, które składają się z więcej niż jednego łańcucha polipeptydowego. • Monomeryczny łańcuch nazywany jest podjednostką • Struktura czwartorzędowa określa wzajemne położenie podjednostek w przestrzeni oraz naturę stabilizujących ją oddziaływań grup fenolowych, aminowych, karboksylowych oraz jonów metali Oddziaływanie ligand-receptor Zmiana energii związana z bezpośrednim, odwracalnym oddziaływaniem ligandu z receptorem L +M k1 k2 ML (2) charakteryzowana jest przy pomocy energii swobodnej (potencjału Gibbsa). ∆G = ∆H – T∆S W stanie równowagi stała równowagi ∆G = ∆G° + RT ln(Keq) Oddziaływanie ligand-receptor • Najsilniejszymi wiązaniami są disiarczkowe wiązania kowalencyjne o mocy 60 kcal/mol, które tworzą się na skutek utlenienia pary reszt cysteiny • Istotną rolę w procesie rozpoznawania molekularnego odgrywają wiązania wodorowe • Siła wiązania wodorowego (1,5 – 2,5 Å) oraz kątem pod jakim są wzajemnie ułożone w przestrzeni (180°-110°). • Przeciętna siła 1,7 ÷ 9,6 kcal/mol. • uczestniczyć może 8 reszt aminokwasowych (Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr, Trp). Oddziaływanie ligand-receptor O NH2 NH2 O H N H N N tryptofan H N - N histydyna - N arginina H N H2N HN H N H2N NH + N N N HN H2N H2N N + NH H2N HN N HN NH H2N tyrozyna - O OH Glu, Asp O OH OH O O - O - R OH R O R SH R S R NH2 R NH3 S Me + Oddziaływanie ligand-receptor • Oddziaływania van der Waalsa występują pomiędzy cząsteczkami hydrofobowymi, np. między dwoma resztami aromatycznymi fenyloalaniny W wyniku chwilowej fluktuacji rozkładu gęstości elektronowej cząsteczki dochodzi do wytworzenia układu dwubiegunowego (końca dodatniego i ujemnego) tzw. dipola. •Tego typu oddziaływaniom ulegają: glicyna, alanina, walina, leucyna, izoleucyna, fenyloalanina, prolina i metionina. • Dipole w cząsteczkach mogą także oddziaływać z obdarzonymi ładunkami resztami aminokwasów (oddziaływanie typu jon-dipol). Oddziaływanie ligand-receptor • W środowisku płynu fizjologicznego (pH=7,4) łańcuchy boczne aminokwasów białkowych o charakterze zasadowym ulegają protonowaniu, zaś podstawniki kwasowe deprotonowaniu. • Pomiędzy przeciwnie naładowanymi częściami cząsteczki/cząsteczek dochodzić może do oddziaływań o charakterze elektrostatycznym (oddziaływania jonowe). Wiązania jonowe mogą się tworzyć między jonem karboksylanowym reszty kwasowej jednego aminokwasu (np. kwasu asparaginowego, glutaminowego), a jonem amoniowym reszty zasadowej innego aminokwasu, np. lizyny, argininy Oddziaływanie ligand-receptor • Istotną rolę w procesie tworzenia kompleksu ligand-receptor odgrywają cząsteczki rozpuszczalnika (najczęściej wody). Polarny rozpuszczalnik może stabilizować strukturę makromolekuły tworząc wiązania wodorowe z polarnymi resztami aminokwasów. • Entropowy koszt unieruchomienia cząsteczki wody (-T∆S=20kcal/mol) związany z utratą translacyjnych i rotacyjnych stopni swobody jedynie częściowo kompensowany jest spadkiem entalpii (∆H) wytworzonych wiązań wodorowych O + - H3N O N O Lys O . + H3N + Phe -.... .... . W czasie bezpośredniego wiązania liganda w miejscu wiążącym receptora następuje spadek entropii tworzonego układu związany ze zmniejszeniem labilności konformacyjnej obu komponentów (zachowanie translacji i rotacji). Oddziaływanie ligand-receptor • Niekorzystny termodynamicznie wzrost energii swobodnej układu (∆G) kompensowany jest wzrostem entropii (∆S>0) wynikającym ze zjawiska asocjacji cząsteczek wody miejsca wiążącego w ogólnej masie rozpuszczalnika. • zmniejszenie ∆G, która stabilizuje kompleks ligand-receptor określa się mianem efektu hydrofobowego hydrofobowe wiązanie wodorowe H przeniesienie ładunku N .. N O CH3CH2CH2CH2 O dipol-dipol hydrofobowe jonowe lub jon-dipol H CH2CH2 + N CH2CH3 CH2CH3 hydrofobowe Modelowanie receptora • określenie struktury pokrewnej – referencyjnej R • określenie strukturalnie podobnych (SCR – structurally conserved regions) i niepodobnych (SVR – structurally variable regions) części • nałożenie sekwencyjne SCR na R (BLAST) • konstrukcja SCR przy użyciu współrzędnych z R (C α) • konstrukcja SVR (loop search – geometryczne kryteria PDB, de novo) • modelowanie reszt aminokwasowych (67 rotamerów dla 17 aminokwasów) • optymalizacja struktury oraz poprawa geometrii przy użyciu technik MD Białko - składowa błony komórkowej • Budowę błony komórkowej poprawnie opisuje model płynnej mozaiki, który został zaproponowany w latach 70 ubiegłego wieku przez S. J. Singera i G. L. Nicolsona Białko - składowa błony komórkowej • Amerykanin George Gamow powiązał budowę DNA i RNA ze strukturą białek. Założył on, iż liniowy układ nukleotydów musi mieć odzwierciedlenie w liniowym uporządkowaniu aminokwasów • matrycą do właściwej biosyntezy białek jest mRNA (matrycowy RNA) – transkrypcja • Istotną rolę w procesie translacji odgrywają cząsteczki tRNA (transportowy RNA) Jedna cząsteczka tRNA składa się z ok. 7594 nukleotydów tworzących kilka ramion, z których najważniejsza jest pętla antykodonowa. Zawiera ona 7 nukleotydów, z których środkowe 3 tworzą antykodon. Ligand – bioefektor, receptor – transduktor sygnału biologicznego Na skutek związania liganda z receptorem, obserwujemy • pobudzenie (gdy dochodzi do zmiany konformacji receptora) • blokowanie (brak zmiany konformacji receptora) receptora. • Agonista • Antagonista • odwrotny agonista PDB – chemoinformatyczne repozytorium makrocząsteczek
