cwiczenia nr 8

advertisement
Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka
Ćwiczenie 8
Część teoretyczna:
I. MIKROFLORA POWIETRZA
Drobnoustroje w powietrzu rzadko występują w postaci wolnej, zwykle jako bioaerozole. Bioaerozol to
układ dwu- lub trójfazowy, składający się z fazy rozpraszającej (powietrza) i rozproszonej (drobne
cząsteczki płynu lub substancji stałych zawierające pyłki roślin, zarodniki grzybów, komórki bakterii,
drożdży i wirusy). Drobnoustroje, przyczepione do cząstek kurzu i pyłu lub mikrokropelek płynów, mogą
przebywać w powietrzu bardzo długo.
Saprofityczną mikroflorę powietrza stanowią: ziarniaki z rodzaju Micrococcus i Sarcina wytwarzające
barwniki, gronkowce białe, pałeczki Alcaligenes, tlenowe laseczki przetrwalnikujące z rodzaju Bacillus. W
pomieszczeniach zamkniętych oraz w powietrzu atmosferycznym występują
zarodniki grzybów
strzępkowych z rodzaju Cladosporium, Penicillium, Aspergillus, Alternaria, Botrytis, czy Rhizopus i Mucor
oraz drożdże Rhodotorula, Torulopsis i Candida. Liczba zarodników pleśni i komórek bakterii w powietrzu
atmosferycznym zależy od sezonu, warunków pogodowych, wysokości nad poziomem morza.
Bakterie chorobotwórcze, tj. gronkowiec złocisty (Staphylococcus aureus), pałeczka ropy błękitnej
(Pseudomonas aeruginosą), a także paciorkowce z rodzaju Enterococcus i Streptococcus przedostają się do
powietrza z jamy nosowo-gardłowej, zakażonych ran czy bielizny szpitalnej.
Oznaczanie stopnia zakażenia powietrza
Analiza powietrza prowadzona jest w oparciu o obecność tzw. wskaźników bakteriologicznego
zanieczyszczenia powietrza. Są to gatunki lub rodzaje wytypowane jako przedstawiciele mikroflory
pochodzącej z określonych zanieczyszczeń – gleby, wód powierzchniowych, od ludzi i zwierząt.
Wskaźniki bakteriologicznego zanieczyszczenia powietrza:
- z przewodów oddechowych człowieka – gronkowce i paciorkowce hemolizujące Staphylococcus albus,
Streptococcus salivarius, Streptococcus viridans,
- cząstkami gleby – promieniowce,
- cząstkami wód powierzchniowych – Pseudomonas fluorescens.
Dezynfekcja i wyjaławianie powietrza może być prowadzona następującymi metodami:
• mechanicznie – filtrowanie przez filtry włókniste bawełniane, z włókien szklanych lub przez
roztwory kwasów i ługów,
• fizycznie – ogrzewanie powietrza poprzez sprężanie go do wysokich ciśnień, odpylanie
elektrostatyczne oraz z zastosowaniem promieniowania UV, promieniowania jonizującego,
wysokoenergetycznych promieni katodowych, gamma lub ultradźwięków,
1
Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka
• chemicznie – stosowanie substancji bakteriobójczych, w tym preparatów na bazie kwasu
nadoctowego, nadtlenku wodoru, podchlorynu sodu, kwasu mlekowego, glikolu propylenowego i
jego pochodnych.
Ogólna liczba bakterii
jtk/m3
Liczba drożdży i pleśni
jtk/m3
Promieniowce
jtk/m3
Stopień zanieczyszczenia
powietrza
atmosferycznego
Poniżej 1000
10
3000-5000
Niezanieczyszczone
1000-3000
10-100
5000-10000
Średnio zanieczyszczone
Powyżej 3000
Powyżej 100
Powyżej 10000
Silnie zanieczyszczone
Zasadniczo wyróżnia się dwie grupy metod pobierania prób oparte na:
1) osiadaniu zawiesin drobnoustrojów,
2) filtracji powietrza przez filtry.
Metoda sedymentacyjna Kocha
Najczęściej stosowaną metodą badawczą badania stopnia zanieczyszczenia mikrobiologicznego powietrza
jest metoda sedymentacyjna. Oparta jest na swobodnym osiadaniu pod wpływem sił grawitacji pyłków i
kropelek niosących mikroorganizmy. Pobranie próby polega na otwarciu przez ściśle określony czas płytki
Petriego z wylaną uprzednio pożywką. Wynik ostateczny, tj. ilość drobnoustrojów w 1 m3 powietrza oblicza
się ze wzoru Omeliańskiego:
L=A·100·100/P·k
Gdzie: L- ilość drobnoustrojów (jtk/m3)
A – średnia ilość kolonii na płytkach Petriego,
P – powierzchnia płytki (cm2),
k – współczynnik zależny od czasu ekspozycji k=1 dla 5 minut, k=2 dla 10 minut, k=3 dla 15 minut.
Metody zderzeniowe
Wyróżniamy w nich dwa sposoby przepuszczania powietrza tzn. wirowanie powietrza wciąganego
przez przyrząd (mikroorganizmy osadzają się na cylindrze) lub zderzanie strumienia zassanego powietrza z
pożywką.
2
Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka
Metody filtracji
Polegają na przepuszczaniu określonej objętości powietrza przez odpowiedni jałowy filtr. Po
przefiltrowaniu powietrza, wypłukuje się zatrzymane drobnoustroje ze stałego materiału filtracyjnego znaną
objętością cieczy, która następnie posiewa się na pożywki stałe.
II. ANALIZA ILOŚCIOWA MIKROORGANIZMÓW – METODY HODOWLANE
- znajomość ilości mikroorganizmów potrzebna jest dla oceny wzrostu drobnoustrojów w warunkach
hodowli laboratoryjnych, dla oceny prawidłowego przebiegu procesów biotechnologicznych, dla określenia
stopnia zanieczyszczenia produktów żywnościowych lub farmaceutycznych
- metody określania ilości drobnoustrojów oparte są na metodach bezpośrednich – mikroskopowych,
pośrednich – hodowlanych, wagowych, optycznych
- metody hodowlane pośrednie oparte są na zdolności drobnoustrojów do rozmnażania, dzięki czemu
oznacza się tylko żywe komórki zdolne do wzrostu: w pożywkach płynnych (metoda rozcieńczeń) w
pożywkach stałych (metoda płytkowa)
A) Metoda rozcieńczeń
- metoda seryjnych rozcieńczeń Listera należy do klasycznych technik stosowanych do określania liczby
drobnoustrojów oraz do izolowania czystych hodowli ze środowiska płynnego
- zasada tej metody polega na wieloetapowym rozcieńczaniu badanej zawiesiny, tak aby w 1 cm3 znajdowała
się jedna komórka
- z kolejnych rozcieńczeń wykonuje się posiewy po 1 cm3 do pożywek płynnych co najmniej w dwóch
powtórzeniach
- po inkubacji określa się ilość prób dodatnich – takich w których rosną drobnoustroje
- korzystając z tablic McCrady’ego ujmujących statystycznie ilość prób ze wzrostem drobnoustrojów,
rozcieńczeniem i ilością powtórzeń wylicza się w oparciu o rachunek prawdopodobieństwa NPL, czyli
najbardziej prawdopodobną liczbę drobnoustrojów w 1 cm3 badanej próby
- dokładność metody zależy od przygotowania właściwych rozcieńczeń i od ilości równoległych prób
- warunkiem jest przygotowanie takiego szeregu rozcieńczeń, aby w ostatnim nie były już obecne
mikroorganizmy
- jest to jednak metoda czasochłonna, pracochłonna, wymagająca dużej ilości szkła i jest rzadko stosowana
B) Metoda płytkowa
3
Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka
- tradycyjna metoda mikrobiologiczna stosowana powszechnie
- wprowadzona w 1881 roku przez Roberta Kocha
- zastosowanie: określanie liczby drobnoustrojów, izolacja czystych kultur, obserwacja morfologiczna,
- zasada polega na wysiewie odpowiednio rozcieńczonej zawiesiny drobnoustrojów na pożywkę stałą,
inkubacje i liczenie wyrosłych kolonii
- wady: wyrosłe kolonie mogą łączyć się w łańcuszki, zlewać się itp., a więc mogą powstawać z więcej niż
jednej komórki, wyrosłe kolonie są to tylko te które wyrosły z komórki zdolnej do rozmnażania
- technika:
rozcieńczenia zawiesiny (0.85 % NaCl jałowy – rozpuszczalnik, w objętości 9, 90 lub 99 cm3
uzupełnia się odpowiednio 1, 10 i 1 cm3 zawiesiny drobnoustrojów, uzyskując żądane rozcieńczenia, roztwór
dokładnie zamieszać, do każdego rozcieńczenia osobne pipety)
posiewy na płytki Petriego – metoda wgłębna lub powierzchniowa
inkubacja – czas 24-48 godzin, w temperaturze optymalnej dla danego gatunku drobnoustrojów,
płytki z agarem odwrócone do góry nogami, z żelatyną normalnie
liczenie – liczymy wyrosłe kolonie, odrzucamy te gdzie kolonii jest więcej niż 300.
III. MIKROFLORA GLEBY
O rozwoju mikroorganizmów w glebie decydują części stałe, zawierające związki mineralne i substancje
organiczne (ok. 50% gleby), powietrze glebowe (ok. 35%) oraz roztwór glebowy (ok. 15%). Mikroflora
gleby jest bardzo bogata i stanowi najszybciej rosnący i reagujący na zmiany parametrów środowiska
składnik jej biocenozy.
Drobnoustroje odgrywają w glebie dwojaką rolę:
- rozmnażają się i metabolizują materię organiczną, tworząc biomasę własnych komórek oraz nagromadzają
substancje, które tworzą próchnicę,
- rozkładają i mineralizują związki organiczne, przez co wprowadzają w ponowny obieg pierwiastki
niezbędne do produkcji roślinnej.
Drobnoustroje
Jtk w 1 g gleby
Bakterie
Promieniowce
Grzyby
Glony
Pierwotniaki
50 000 000
6 000 000
85 000
2 000
15 000
Do najpospolitszych i najczęściej występujących drobnoustrojów w glebach i na roślinach należą
organotroficzne bakterie z rodzajów Alcaligenes, Bacillus, Enterobacter, Flavobacterium, Micrococcus
oraz wirusy. Istotną rolę odgrywają bakterie wiążące azot atmosferyczny i prowadzące przemiany azotu
mineralnego oraz organicznego, m.in. z rodzajów Azotobacter, Arthrobacter, Nitrosomonas, Nitrobacter,
Pseudomonas, Serratia oraz beztlenowce Clostridium. Pod względem zawartości w glebie drugą grupę po
bakteriach właściwych stanowią organotroficzne promieniowce, których przedstawiciele z rodzajów
4
Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka
Nocardia i Streptomyces wykazują uzdolnienia do rozkładu celulozy, lignin oraz różnych połączeń
aromatycznych. Szeroko rozpowszechnione w glebach uprawnych są grzyby organotroficzne,
przedstawiciele klas grzybów niedoskonałych, glonowców, workowców oraz drożdże z rodziny
Sąccharomycetaceae i Cryptococcaceae.
Podział mikroorganizmów glebowych
1. Mikroflora autochtoniczna – obejmuje mikroorganizmy, które zawsze występują i rozwijają się w
danym środowisku, w tym przypadku gleba jest dla nich najwłaściwszym środowiskiem, żyją w niej dzięki
rozkładowi próchnicy czerpiąc z niej energię oraz mineralizując jej węgiel i azot. 50-80%
mikroorganizmów gleby stanowią bakterie saprofityczne, glebotwórcze.
Możemy wyróżnić:
 fotolitotrofy – drobnoustroje przeprowadzające fotosyntezę: glony, bakterie zielone Chlorobium,
bakterie purpurowe siarkowe Thiobacillus, bakterie purpurowe bezsiarkowe Desulfovibrio, sinice (Nostoc,
Anabaena),
 chemoorganotrofy – na przykład bakterie: Alcaligenes, Bacteroides, Bacillus, Enterobacter,
Escherichia, Flavobacterium, Micrococcus, Leuconostoc lub grzyby (workowce, drożdże, grzyby
niedoskonałe), promieniowce, pierwotniaki i mezofauna.
Do tej grupy należą mikroorganizmy przeprowadzające różne procesy:
 bakterie uczestniczące w przemianach związków azotu (bakterie nitryfikacyjne, denitryfikacyjne i
wiążące azot) jak Nitrosomonas, Nitrobacter, Pseudomonas, Serratia, Clostridium, Bradyrhizobium,
Azotobacter, Arthrobacter, Rhizobium,
 bakterie uczestniczące w przemianach związków siarki, np. Thiobacillus, Desulfovibrio,
 bakterie uczestniczące w przemianach związków fosforu, np. Serratia, Pseudomonas,
Corynebacterium oraz grzyby Penicillium, Rhodotorula
 grzyby: Zygomycota, Ascomycota, Fungi imperfecti, drożdże: Sąccharomycetes, Cryptococcus,
Rhodotorula, Candida, oraz promieniowce: Nocardia, Streptomyces, które syntetyzują bądź rozkładają
różne związki, oraz wpływają na strukturę gleby.
2. Mikroflora zymogenna – to drobnoustroje bytujące okresowo (saprofity i patogeny), dostają się do gleby
niejako z zewnątrz, są aktywne w okresie dobrych warunków (np. po dostaniu się do gleby reszek roślin lub
zwierząt rozwijają się masowo), po wyczerpaniu się w glebie łatwo dostępnej substancji organicznej
przechodzą w stan spoczynku, który trwa aż do następnej dostawy świeżej substancji organicznej. Bakterie
autochtoniczne są natomiast aktywne cały czas. Źródła mikroflory zymogennej to resztki roślin i padlina
zwierząt oraz odchody zwierząt i ludzi, zdrowych lub chorych, gryzonie i owady, nosiciele mikroflory
patogennej, ścieki bytowo-gospodarcze z gospodarstw rolnych, nawozy naturalne (obornik, kompost
roślinny), opady atmosferyczne zmywające obszary zamieszkałe przez ludzi oraz środowiska przemysłowe
(mikroflora patogenna).
5
Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka
Zaliczamy tu:
 mikroorganizmy pochodzące z nawozów naturalnych: pałeczki gramujemne Enterobacteriaceae,
Pseudomonas, Proteus, Azotobacter,
 szczególnie niebezpieczne dla człowieka bakterie Salmonella (dur brzuszny), Shigella,
(czerwonka), Clostridium tetani (tężec), Clostridium botulinum (jad kiełbasiany), Escherichia coli (pałeczki
fekalne), prątki gruźlicy oraz wirusy polio, ECHO, WZW,
 termofile: Bacillus stearothermophillus, Listeria monocytogenes, Yersinia, Aeromonas.
IV. MIKROBIOLOGICZNY ROZKŁAD MATERIAŁÓW (BIODEGRADACJA)
Część praktyczna:
Wszystkie doświadczenia wykonujemy w warunkach jałowych!
1. Badanie stopnia zanieczyszczenia mikrobiologicznego powietrza metodą sedymentacyjną Kocha
a) przygotowane szalki Petriego (dla każdej grupy po 2 sztuki; 1-sza z agarem odżywczym i 2-ga z agarem
brzeczkowym) opisać
b) eksponować szalki w dowolnym miejscu sali laboratoryjnej lub innym pomieszczeniu (otwarcie szalki) w
taki sposób, aby uniemożliwiony był ruch powietrza wokół nich, przez 15 minut
c) odłożyć szalki we wskazane miejsce do inkubacji
2. Badanie mikroflory gleby
a) do wykonania ćwiczenia potrzebne będą sterylna woda (99,9 cm3), gleba, waga, łyżeczka aluminiowa,
dwie probówki z 9 cm3 sterylnej wody destylowanej, szalki Petriego z podłożem Pochona dla
promieniowców i z podłożem Martina dla grzybów pleśniowych, dwie puste sterylne szalki Petriego
(posiew metodą wgłębną), kolba z rozpuszczonym agarem odżywczym, głaszczka, łaźnia wodna wrząca,
pipeta automatyczna i sterylne końcówki
b) doświadczenie wykonać wg schematu
a) 1 cm3 próby zalać
agarem odżywczym
Saprofity
Ogólna Liczba
Bakterii (OLB)
0.1 g gleby
2
1
9 cm3
10-4
99.9 cm3
10-3
1 cm3
1 cm3
1 cm3
1 cm3
2
Podłoże
Pochona
Promieniowce
3a
9 cm3
10-5
1 cm3
Podłoże
Martina
Grzyby pleśniowe
Posiew powierzchniowy
b) Całą probówkę wstawić
do wrzącej łaźni wodnej
na 10 min.
1 cm3
Posiew
3b
wglebny
b) 1 cm3 z probówki z
łaźni wodnej zalać
agarem odżywczym
Bacillus
(Bakterie
przetrwalnikujace)
6
Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka
c) opisane szalki Petriego odstawić do inkubacji.
3. Rozkład celulozy
a) na zestalony na płytce Petriego agar mineralny nałożyć za pomocą pęsety krążek bibuły filtracyjnej
b) na powierzchni krążka umieścić kilka grudek ziemi kompostowej
c) płytki nie odwrócone wstawić do cieplarki o temp. 30oC na 2-3 tygodnie
d) po inkubacji przeprowadzić obserwacje przy użyciu lupy lub mikroskopu stereoskopowego i opisać
zmiany, jakie nastąpiły w krążku bibuły filtracyjnej (wytrawienia, zmiany barwy)
e) ze zmienionych miejsc pobrać ezą materiał, wykonać preparaty
• bakteryjny barwiony fuksyną
• grzybowy w płynie Lugola
f) oglądać pod mikroskopem, podać morfologię występujących bakterii i grzybów
4. Rozkład tkanin
a) przygotować paski (2x3) wybranych tkanin o wymiarach 100 x 15 mm
b) trzy różne paski tkaniny włożyć za pomocą szpatułki do pojemnika z glebą (zachować paski kontrolne)
c) po 2-tygodniowej inkubacji w cieplarce w temp. 28°C wyjąć paski i oczyścić z gleby
d) używając lupy lub mikroskopu stereoskopowego zaobserwować i opisać zmiany wyglądu tkanin
e) sprawdzić wytrzymałość tkanin w porównaniu z kontrolą
5. Wpływ grzybów na skórę
a) na płytce z podłożem Czapek-Doxa za pomocą jałowej pęsety umieścić dwa paski: jeden skóry
naturalnej , drugi z materiału skóropodobnego (zachować paski kontrolne)
b) jałową pipetą pobrać 1 cm3 zawiesiny zarodników grzybów, zaszczepić przygotowane płytki i
rozprowadzić ją głaszczką na powierzchni badanych próbek
c) płytki z zaszczepionymi próbkami umieścić w cieplarce w temp. 30°C i wilgotności względnej 95% na ok.
28 dni.
d) po okresie inkubacji badane próbki wyjąć z płytek, zmyć bieżącą wodą wodociągową, usunąć nadmiar
wody przy użyciu bibuły. Paski pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej
e) wysuszone paski oglądać pod lupą lub mikroskopem stereoskopowym i zaobserwować zmiany w
porównaniu z próbką kontrolną (próbka nie poddana działaniu grzyba)
f) zanotować wyniki eksperymentu
6. Wpływ grzybów na tworzywa sztuczne
a) do oznaczenia przygotować trzy próbki tworzyw sztucznych
b) na płytce ze zmodyfikowanym podłożem Czapek-Doxa umieścić, używając jałowej pęsety próbkę
tworzywa sztucznego (zachować paski kontrolne)
c) jałową pipetą pobrać 0,2 cm3 zawiesiny zarodników grzyba i przenieść na płytkę
7
Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka
d) rozprowadzić zawiesinę po powierzchni przy użyciu głaszczki
e) płytki z zaszczepionymi próbkami umieścić w cieplarce w temp. 30°C i wilgotności względnej 95% na ok.
28 dni
f) po okresie inkubacji ocenić wzrost grzyba nieuzbrojonym okiem lub za pomocą lupy czy mikroskopu
Wizualną ocenę intensywności wzrostu grzyba przeprowadzić wg skali podanej w tabeli poniżej
Skala oceny wizualnej
Skala ocen
Wyniki badań
0
1
Brak widocznego pod mikroskopem wzrostu grzybów na próbce
Wzrost grzybów na próbce słabo widoczny nieuzbrojonym okiem,
ale dobrze widoczny pod mikroskopem
Wzrost grzybów na próbce widoczny nieuzbrojonym okiem, ale
mniej niż 25% powierzchni pokryte grzybem
Wzrost grzybów na próbce widoczny nieuzbrojonym okiem
i ponad 25% powierzchni pokryte grzybem
2
3
8
Download