Temat 7: Metody posiewu i hodowli drobnoustrojów (2)

Temat 7: Metody posiewu i hodowli drobnoustrojów (2)
Zadanie 1. Posiew na podłoże agarowe ze skrobią
Podłoże to umożliwia zbadanie zdolności szczepu do hydrolizy skrobi (amylolizy), a
także do określenia liczby bakterii amylolitycznych w badanej próbie.
1. Wykonać posiew metodą powierzchniową wprowadzając pipetą na pożywkę 100 μl
zawiesiny bakterii Bacillus sp. i rozprowadzając głaszczką
2. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 7 dni
3. Po inkubacji zalać powierzchnię hodowli płynem Lugola i odczekać kilka minut.
Płyn Lugola reaguje ze skrobią dając fioletowe zabarwienie. Wyjaśnić
zaobserwowane zmiany barwne w pożywce.
Zadanie 2. Hodowla bakterii nitryfikacyjnych
Hodowle bakterii autotroficznych (w tym nitryfikacyjnych) prowadzi się zasadniczo na
pożywkach zawierających jedynie związki nieorganiczne (czasami dodaje się jeszcze
niezbędne witaminy). Związki organiczne bakterie te wytwarzają asymilując CO2. Bakterie
autotroficzne rosną wolniej od heterotroficznych (korzystających z gotowych związków
organicznych), dlatego wymagają dłuższego czasu inkubacji.
1. Do probówki z pożywką mineralną Winogradskiego dla I fazy nitryfikacji
(zawierającą kationy amonowe) wprowadzić grudkę ziemi lub 0,5 cm3 wody rzecznej
2. Tak samo zaszczepić pożywkę Winogradskiego dla II fazy (zawierającą azotyny)
3. Inkubować przez 14 dni w temp. pokojowej.
4. Po inkubacji zbadać obecność produktów nitryfikacji I fazy (azotyny) i II fazy
(azotany) oraz zanik substratów w odpowiednich probówkach.
Wykrywanie azotynów:
a) na szkiełko zegarkowe nanieść pipetą 0,2 cm3 hodowli,
b) oddzielnymi pipetami dodać: 0,1 cm3 r-u kwasu sulfanilowego i 0,1 cm3 r-u
α- naftyloaminy (odczynnik Griessa); w przypadku obecności azotynów pojawia
się czerwono - amarantowe (do brunatnego) zabarwienie.
Wykrywanie azotanów:
a) w celu usunięcia azotynów, które dają taką samą reakcję barwną, do probówki
wsypać 1 g mocznika, rozpuścić i wstawić do łaźni wodnej o temp. 100C, po
czym wlać ok. 2 cm3 stężonego kwasu siarkowego nie dopuszczając do wrzenia.
b) po ustąpieniu wydzielania się pęcherzyków gazu, wlać ostrożnie 1cm3 r-u
dwufenyloaminy; pojawienie się zabarwienia niebieskiego do granatowego
świadczy o obecności azotynów.
Wykrywanie kationów amonowych:
a) na szkiełko zegarkowe nanieść 0,2 cm3 odczynnika Nesslera,
b) dodać (inną pipetą) 0,2 cm3 badanej hodowli i wymieszać,
c) pojawienie się żółtopomarańczowego do czerwonobrunatnego zabarwienia
świadczy o obecności kationów amonowych
Zadanie 3. Hodowla bakterii chemosyntezy żelazistej
1. Do probówki z pożywką mineralną wg Lieske (zawierającą Fe++) wprowadzić
0,5 cm3 hodowli osadu czynnego
2. Inkubować przez 14 dni w temperaturze pokojowej
3. Po inkubacji opisać i wyjaśnić zaobserwowane zmiany w wyglądzie hodowli
Zadanie 4. Obserwacja mikroskopowa bakterii chemosyntezy siarkowej pochodzących z
hodowli w warunkach słabego natlenienia
1. Wykonać preparat przyżyciowy z osadu czynnego
2. Zaobserwować charakterystyczne nitkowate bakterie siarkowe z granulami siarki
widocznymi jako czarne kropki wewnątrz komórek
3. Wykonać rysunek
Zadanie 5. Obserwacja mikroskopowa purpurowych bakterii siarkowych pochodzących z
hodowli w warunkach beztlenowych
1. Wykonać preparat przyżyciowy
2. Zaobserwować duże bakterie wypełnione licznymi granulami siarki i poruszające się
ruchem śrubowatym. Wykonać rysunek.
Zadanie 6. Hodowla w warunkach beztlenowych bakterii denitryfikacyjnych
Bakterie denitryfikacyjne są heterotrofami oddychającymi w warunkach beztlenowych
za pomocą NO3-.
1. Probówki z bulion z KNO3 zaszczepić osadem dennym (ok. 0,5 cm3) i zakorkować
uszczelniając folią
2. Inkubować przez 7 dni w temperaturze pokojowej.
3.W wyniku denitryfikacji wydziela się gaz (N2) oraz tworzą się m. in. azotyny i
amoniak
Zadanie 7. Hodowla w warunkach beztlenowych bakterii desulfurykacyjnych
Bakterie desulfurykacyjne są bezwzględnie beztlenowymi heterotrofami oddychającymi
za pomocą SO4-2
1. Zaszczepić osadem dennym metodą kłutą słupki agarowe z octanem ołowiu
2. Inkubować przez 7 dni w temperaturze pokojowej
3. Po inkubacji sprawdzić, czy pożywka ściemniała wzdłuż (i wokół) linii wkłucia.
Bakterie desulfurykacyjne redukują S+6 (SO4-2) do S-2, który reaguje z kationami
metali (tu Pb+2) tworząc ciemne siarczki metali (w zastosowanej pożywce PbS).
Zadanie 8. Hodowla w warunkach beztlenowych bakterii fermentacji masłowej
Fermentacja jest rodzajem oddychania beztlenowego, w którym substrat oddechowy (np.
sacharoza) jest utleniany za pomocą innego związku organicznego. Fermentację masłową
przeprowadzają głównie klostridia, czyli beztlenowe laseczki z rodzaju Clostridium, np.
bakterie glebowe Clostridium pasteurianum. W wyniku fermentacji masłowej powstaje kwas
masłowy, CO2 i H2.
1. Probówki z 2% roztworem sacharozy zaszczepić grudką ziemi
2. Zawartość probówki ogrzewać przez 10 minut w łaźni wodnej w temperaturze
75-80oC, w celu usunięcia tlenu i zabicia bakterii nieprzetrwalnikujących
3. Następnie probówkę szybko schłodzić i zakorkować uszczelniając folią
4. Inkubować przez 7 dni w temperaturze pokojowej.
5.Po inkubacji sprawdzić zapachowo obecność kwasu masłowego (charakterystyczny
zapach zjełczałego masła)
6.Pobrać 3 ml przesączonej hodowli na szkiełko zegarkowe, dodać kilka kropli
chlorku żelaza i podgrzać. W obecności kwasu masłowego pojawi się brązowy
maślan żelaza (III).
Zadanie 9. Hodowla w anerostacie - pokaz