Æwiczenia nr 10

Mikrobiologia – II rok Dietetyka
Ćwiczenie 10
Część teoretyczna:
I. MIKROFLORA WODY
Mikroflora autochtoniczna to drobnoustroje naturalnie bytujące i rozmnażające się w środowisku wodnym.
Właściwe bakterie wodne to autotrofy i heterotrofy, zdolne do wzrostu nawet w obecności śladowych ilości
substancji odżywczych. W grupie mikroorganizmów najbardziej typowych dla środowiska wodnego
znajdują się ruchliwe bakterie należące do rodzajów: Vibrio, Pseudomonas, Aeromonas, Selenomonas,
Spirillum oraz bakterie nitryfikacyjne, siarkowe i żelaziste. Ponadto zaliczamy tu grzyby z rodzajów
Mucor, Leptomitus, Sąprolegnia
Mikroflora allochtoniczna przedostaje się do wody zarówno z powietrza, gleby, jak i ze ściekami
przemysłowymi i komunalnymi. Spotyka się je najczęściej w wodach powierzchniowych.
Ze względu na znaczenie dla zdrowia i gospodarki człowieka mikroorganizmy można podzielić na
saprofityczne (nieszkodliwe, wyżej wymienione autotrofy i heterotrofy), patogenne (chorobotwórcze) i
szkodliwe w określonych gałęziach przemysłu.
Bakterie patogenne należą do drobnoustrojów allochtonicznych i dostają się do wody z przewodu
pokarmowego ludzi i zwierząt. W wodzie nie rozmnażają się, lecz są przenoszone na następnego żywiciela.
Drogą wodną przenoszone są:
• cholera przenoszona przez przecinkowca cholery (Vibrio cholerae, w wodzie powierzchniowej
przeżywa do kilku tygodni, w wodociągowej kilka dni),
• dur brzuszny powodowany przez pałeczkę duru brzusznego (Salmonella Typhi),
• czerwonka - pałeczki czerwonki (Shigella flexneri i Shigella sonnei)
• tularemia - Pasteurella (Francisella) tularensis.
Mogą być także tą drogą przenoszone brucelloza, żółtaczka zakaźna, gorączka błotna oraz
enterowirusy (wirusy Polio).
Podczas analiz mikrobiologicznych wody niemożliwe jest badanie wszystkich organizmów
chorobotwórczych, dużo łatwiej jest analizować tzw. mikroorganizmy wskaźnikowe, które dostają się do
wody z wydalinami ludzkimi lub zwierzęcymi. Badania mikroflory jelitowej ustaliły stałe występowanie
trzech różnych rodzajów bakterii wskaźnikowych, świadczących o kontakcie wody z fekaliami lub
ściekami:
- pałeczki okrężnicy Escherichia coli, Enterobacter aerogenes
- paciorkowców kałowych z typowym gatunkiem Enterococcus faecalis,
- beztlenowców przetrwalnikujących Clostridium perfringens.
Stwierdzenie zawartości bakterii z grupy coli powyżej normy (tab. 2) świadczy o
fekalnym zanieczyszczeniu wody, a tym samym o możliwości występowania bakterii
chorobotwórczych.
1
Mikrobiologia – II rok Dietetyka
Tabela 1. Wymagania mikrobiologiczne dla wody pitnej i na potrzeby gospodarcze
Wskaźniki jakości wody
Woda z wodociągów
sieciowych
dezynfekowana
Woda z wodociągów
sieciowych
niedezynfekowana
Woda z wodociągów
lokalnych, studni
publicznych i studni
zakładowych
Podawana
do sieci
W sieci
Podawana
do sieci
W sieci
Liczba bakterii grupy coli
typu kałowego w 100 ml
0
0
0
0
0
Liczba bakterii grupy coli
w 100 ml
0
1
1
2
2
Liczba kolonii bakterii na
agarze odżywczym po
24h, 37ºC w 1 ml
10
20
20
40
40
Liczba kolonii bakterii na
agarze odżywczym po
72h, 20°C w 1 ml
50
100
100
200
x
X – nie oznacza się
Tabela 2. Wskaźniki bakteriologiczne jakości wody do picia
Rodzaj oznaczenia
Objętość próbki [ml]
Dopuszczalna ilość bakterii
Escherichia coli lub bakterie grupy coli
100
0
Bakterie grupy coli
100
0
Paciorkowce kałowe
100
0
Clostridium sp. redukujące siarczyny
20
0
Ogólna liczba bakterii w temp. 37ºC
1
10
Ogólna liczba bakterii w temp. 20ºC
1
100
typu kałowego (termotolerancyjne)
Zgodnie z obowiązującymi w Polsce przepisami, sanitarna ocena wody polega na określeniu liczby
bakterii psychrofilnych oraz mezofilnych w 1 ml badanej wody oraz ustaleniu tzw. miana coli.
Miano coli jest to najmniejsza objętość badanej wody lub ścieków, w której stwierdza się jeszcze
obecność bakterii z grupy coli. Miano coli jest wartością niemianowaną. Jeśli miano coli wynosi 10 to
znaczy, że w 10 ml znajduje się co najmniej 1 komórka bakterii z grupy pałeczki okrężnicy. Wartość
miana coli jest odwrotnie proporcjonalna do stopnia zanieczyszczenia wody!
Za bakterie z grupy coli uważa się gramujemne pałeczki nie wytwarzające przetrwalników, rozwijające się
w warunkach względnie beztlenowych, mające zdolność fermentowania laktozy z wytworzeniem kwasu
i gazu, w ciągu 48h hodowli w temp. 35-37°C. Tryptofan redukują do indolu. Należą do niej bakterie z
rodzaju Escherichia, Citrobacter, Klebsiella i Enterobacter.
Określanie liczby bakterii psychro- i mezofilnych
Posiewu bakterii na agar odżywczy dokonuje się w dwóch równoległych powtórzeniach. Wodę
wodociągową należy posiewać bezpośrednio, pobierając 1 ml wody i przenosząc na płytkę Petriego.
2
Mikrobiologia – II rok Dietetyka
Dodatkowo posiewu dokonuje się często z rozcieńczenia 10-1. Wodę powierzchniową wysiewa się z
rozcieńczeń 10-3 i 10-5; ścieki miejskie z rozcieńczeń 10-6 i 10-8. Następnie płytki odwraca się do góry dnem i
jedną z nich wstawia do cieplarki o temp. 20°C, drugą do cieplarki o temp. 37°C. Czas hodowli w
pierwszym przypadku dla bakterii psychrofilnych wynosi 72 h, a w drugim – dla bakterii mezofilnych
wynosi 24 h.
Oznaczanie bakterii grupy coli metodą fermentacyjno-probówkową
Bakterie grupy coli można wykryć metodą fermentacyjno-probówkową, a wynik podać jako miano coli.
Wykrywanie tych bakterii oparte jest na zdolności do fermentowania laktozy z wytworzeniem w podłożu
kwasu oraz gazu.
W przypadku, kiedy dopuszczalne miano coli wynosi:
100 (np. woda pitna) – wysiewa się = 50 ml i 5x10 ml,
50 – wysiewa się = 5x10 ml i 1 ml oraz 0,1 ml
10 – wysiewa się = 2x10 ml i 1 ml oraz 0,1 ml.
Posiewów dokonuje się na podłoże laktozowe z purpurą bromokrezolową (podłoże Eijkmana, LPB), a
następnie inkubuje w temp. 37°C przez 24 lub 48 godzin. Za wynik dodatni przyjmuje się obecność gazu w
próbówce Durhama, zmętnienie pożywki i zmianę jej barwy z fioletowej na żółtą.
Jeśli po 24 godzinach powyższe zmiany nie wystąpią, wówczas próbki
inkubuje się dalej i ponownie odczytuje po 48 h. Pojawienie się bardzo małej
ilości gazu, przy jednoczesnym bardzo słabym zakwaszeniu lub braku
zakwaszenia, uważa się za wynik wątpliwy. Hodowle, których wyniki po 24
godzinach inkubacji uznano za wątpliwe, poddaje się badaniu potwierdzającemu,
a następnie inkubuje dalej do 48 h. W przypadku wątpliwości wykonuje się
posiew na podłoże Endo oraz próby biochemiczne np. na wytwarzanie indolu.
Badania potwierdzające należy wykonać przesiewając bakterie jałowa ezą z podłoża laktozowego na
pożywkę Endo. Inkubacje należy prowadzić w temp. 37°C w ciągu 24 godzin. Bakterie grupy coli rosną na
pożywce Endo w postaci ciemnoczerwonych kolonii o metalicznym (fuksynowym) połysku. W przypadku
obecności chociażby jednej takiej kolonii na pożywce Endo, wynik badania potwierdzającego należy uznać
za dodatni.
3
Mikrobiologia – II rok Dietetyka
Próba na indol
Probówki zawierające wodę peptonową z tryptofanem szczepi się 1 ml badanej wody bezpośrednio lub z
rozcieńczenia. Po 48-godzinnej inkubacji w temperaturze 37°C nanosi się po ściance kilka kropel
odczynnika Ehrlicha, który w obecności indolu barwi się na różowo.
Część praktyczna:
Wszystkie doświadczenia należy wykonać w warunkach jałowych!
1. Odczyt z posiewów mikroflory powietrza (metoda sedymentacyjna Kocha)
a) policzyć ilość kolonii bakteryjnych wyrosłych na szalce z agarem odżywczym i dane umieścić w tabeli
zbiorczej (ćwiczenia) to samo wykonać dla agaru brzęczkowego
b) obliczyć średnie wartości koloni dla bakterii i dla grzybów
c) obliczyć ze wzoru Omeliańskiego ilość bakterii i grzybów w jtk w 1 m3 powietrza
d) obliczenia wraz z ich omówieniem umieścić w sprawozdaniu 3.
2. Odczyt mikroflory gleby
a) policzyć ilość kolonii na poszczególnych podłożach (p. Pochona – promieniowce, p. Martina – grzyby
strzępkowe, agar odżywczy – OLB i bakterie przetrwalnikujące
b) znając ilość kolonii i rozcieńczenia z których zostały wykonane posiewy obliczyć ilość poszczególnych
drobnoustrojów w 1 g gleby
c) wyniki (każda grupa) wypisać w zbiorczej tabeli (na ćwiczeniach)
d) obliczenia, tabelę zbiorczą oraz omówienie wyników umieścić w sprawozdaniu 3.
3. Odczyt posiewów na aktywność enzymatyczną bakterii Bacillus
a) na podłoże Fraziera nanieść sublimat! OSTROŻNIE!, a na podłoże ze skrobią rozpuszczalną nanieść płyn
Lugola, na wszystkich hodowlach obserwować zmiany wokół kolonii
b) obserwację zanotować, omówić w grupach i umieścić w sprawozdaniu 3.
4. Określanie liczby bakterii psychro- i mezofilnych w wodzie (wodociągowej, studziennej i rzecznej)
a) praca w trzech grupach
b) do doświadczenia potrzebne są słoik z 99 i probówka z 9 cm3 sterylnego płynu do rozcieńczeń, trzy
rodzaje wody, 4 sterylne, puste szalki Petriego, agar odżywczy, pipety automatyczne, sterylne końcówki
c) posiewy wykonać wg schematu
4
Mikrobiologia – II rok Dietetyka
1 cm3 badanej próbki wody
1 cm3
1
99 cm3
10-2
1 cm3
zalać agarem
odżywczym
Psychrofile,
20ºC, 72h
1
9 cm3
10-3
1 cm3
zalać agarem
odżywczym
Mezofile,
32ºC, 24h
1
cm3
1 cm3
2
zalać agarem
odżywczym
Psychrofile,
20ºC, 72h
zalać agarem
odżywczym
Mezofile,
32ºC, 24h
Posiewy metodą wgłębną
d) podpisane szalki odłożyć do inkubacji we wskazane miejsce
5. Oznaczanie bakterii grupy coli metodą fermentacyjno-probówkową na podłożu Eijkmana (LPB) dla wody
wodociągowej i rzecznej
a) praca w dwóch grupach
b) do doświadczeń przygotowano szereg probówek, jak dla wody pitnej 1x50 cm3 i 5x10 cm3,
c) doświadczenie wykonać według schematu
50 cm3
próbki badanej wody
50 cm3
10 cm3
10 cm3 10 cm3
10 cm3
10 cm3
10 cm3
10 cm3
10 cm3
10 cm3
10 cm3
podłoże LPB (Eijkmana)
d) podpisane probówki odłożyć do inkubacji we wskazane miejsce
5