Określanie liczby bakterii psychro
advertisement
MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 9 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ MIKROFLORA GLEBY O rozwoju mikroorganizmów w glebie decydują części stałe, zawierające związki mineralne i substancje organiczne (ok. 50% gleby), powietrze glebowe (ok. 35%) oraz roztwór glebowy (ok. 15%). Właściwym siedliskiem bakterii i innych najdrobniejszych mikroorganizmów glebowych są koloidy glebowe. Tworzą one na tych koloidach skupienia – kolonie. Pewna część osobników z kolonii jest przenoszona przez roztwory glebowe i osiada w nowym miejscu (nowy koloid) dając następną kolonię. Koloidy glebowe silnie chłoną tlen, wodę i ważne składniki pokarmowe (amoniak, połączenia potasu, fosforu itp.) – stanowiąc zbiorniki pokarmu dla drobnoustrojów. Oprócz koloidów mineralnych (glinokrzemiany, uwodniona krzemionka, wodorotlenki glinu i żelaza) występują koloidy organiczne. Stanowią one źródło węgla, azotu oraz energii dla mikroorganizmów i występują w glebie głównie pod postacią związków humusowych. Koloidy organiczne odpowiadają za regulowanie odczynu (właściwości buforowe) gleby oraz ilości wody i powietrza (stosunki wodno-powietrzne). Roztwory glebowe – woda z rozpuszczonymi substancjami organicznymi i mineralnymi (wł. buforowe). Woda zawarta w glebie nasyca się w pewnym stopniu bezwodnikiem węglowym i staje się słabym kwasem, w którym rozpuszczają się różne połączenia mineralne i organiczne, dając roztwory glebowe. W ich skład wchodzą wszystkie te związki, które znajdują się w substancji mineralnej i organicznej, ale w postaci jonów (chlor, siarczany, fosforany, wapń, magnez, potas, sód i in.). Skład (stężenie) roztworów zależy od temperatury i ilości wody w glebie, a także od rodzaju drobnoustrojów, które mogą utleniać bądź redukować dane związki, wytrącać je lub pochłaniać. Składniki roztworów mogą też być wymywane z gleby. Powietrze glebowe (atmosfera gleby) – wypełnia wolne przestrzenie, nie zajęte przez wodę; zawiera CO2 (zwykle 0,15-0,65%, lub więcej), O2 (10-15%, a nawet 0,5% w glebach błotnych), N2, NH3, H2S, H2 i CH4. Ulega znacznie większym wahaniom niż skład powietrza nad ziemią, wpływ na to mają te same czynniki, co regulujące skład roztworów glebowych, szczególnie temperatura oraz działalność mikroorganizmów. Dwutlenek węgla powstaje z rozkładu substancji organicznej i podczas oddziaływania kwasów na węglany. Część się http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 1 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 9 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ ulatnia lub jest asymilowana przez rośliny i mikroorganizmy. Swoisty zapach gleby powodują aromatyczne metabolity promieniowców (geosmina) i grzybów. Mikroflora gleby jest bardzo bogata i stanowi najszybciej rosnący i reagujący na zmiany parametrów środowiska składnik jej biocenozy. Oprócz mikroflory do drobnoustrojów bytujących w glebie zalicza się także mikrofaunę (wiciowce, korzenionóżki i orzęski) oraz mezofaunę (drobne organizmy należące do robaków, mięczaków, pierścienic, niesporczaków i stawonogów). Jednak podczas związków mineralnych i organicznych przemian zachodzących w glebie najważniejszą rolę odgrywa mikroflora. Drobnoustroje odgrywają w glebie różną rolę rozmnażają się i metabolizują materię organiczną, tworzą biomasę własnych komórek oraz nagromadzają substancje, które tworzą próchnicę Łatwo rozkładane substancje są wykorzystywane w metabolizmie drobnoustrojów glebowych (sacharydy, aminokwasy, białka, tłuszcze i kwasy tłuszczowe), trudno rozkładające się związki tworzą próchnicę. Mikroflora gleby jest ważnym czynnikiem powstawania humusu – substancje organiczne dostające się do gleby pod wpływem różnych zespołów mikroorganizmów ulegają przemianom powodującym ich częściową lub całkowitą mineralizację i powstawanie połączeń aromatycznych (wynik rozkładu i ponownej syntezy różnorodnych związków organicznych wchodzących w skład humusu). rozkładają i mineralizują związki organiczne, przez co wprowadzają w ponowny obieg pierwiastki niezbędne do produkcji roślinnej (węgiel, azot, siarka, fosfor) poprawiają strukturę gleby poprzez wytwarzanie śluzu rozluźniają glebę – strzępki grzybów i „nitki” promieniowców Mikroflora glebowa może wywoływać zatrucia pokarmowe jeśli dostanie się wraz z niewłaściwie oczyszczonymi warzywami i owocami do pożywienia. Może też przyczyniać się do psucia surowców w wyniku przemian enzymatycznych. Mycie powinno redukować liczbę drobnoustrojów tak, aby nie zagrażała procesowi technologicznemu. Ilość drobnoustrojów w glebie zależy od wielu czynników. Po pierwsze od warunków środowiskowych, jakie stwarza gleba i klimat (temperatura, struktura, wilgotność, odczyn, zasobność gleby w substancje pokarmowe). Zależy od głębokości – w warstwie ornej jest ich http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 2 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 9 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ najwięcej. W warstwie gleby uprawnej o powierzchni 1 ha (ok. 3 mln kg gleby) ciężar bakterii wynosi około 3-15 ton, a grzybów ok. 1,5 tony. W glebach żyznych będzie o wiele więcej mikroorganizmów niż w piasku pustynnym, w glebach południowych niż północnych, w glebach położonych na dolinach i nizinach niż wysokogórskich. Również na danym obszarze geograficznym rozmieszczenie drobnoustrojów w różnych warstwach gleby jest zmienne. Mikroorganizmy gromadzą się przede wszystkim wokół korzeni roślin i w warstwie próchniczej gleby, a więc głównie w warstwie powierzchniowej (5-20 cm). Im głębiej tym mniej jest w glebie tlenu i mniej organizmów tlenowych może ją zasiedlać. W glebach leśnych, zacienionych i pokrytych warstwą substancji organicznej, drobnoustroje bytują głównie na powierzchni. W glebach podmokłych (utrudniony dostęp powietrza) drobnoustroje skupiają się w najpłytszych miejscach (poniżej 0,5m praktycznie nie ma już mikroorganizmów). W glebach silnie wysuszonych liczne drobnoustroje znajdowano nawet na 5 metrach głębokości. Do najpospolitszych i najczęściej występujących drobnoustrojów w glebach i na roślinach należą organotroficzne bakterie z rodzajów Alcaligenes, Bacillus, Enterobacter, Flavobacterium, Micrococcus oraz wirusy. Istotną rolę odgrywają bakterie wiążące azot atmosferyczny i prowadzące przemiany azotu mineralnego oraz organicznego, m.in. z rodzajów Azotobacter, Arthrobacter, Nitrosomonas, Nitrobacter, Pseudomonas, Serratia oraz beztlenowce Clostridium. Pod względem zawartości w glebie drugą grupę po bakteriach właściwych stanowią organotroficzne promieniowce, których przedstawiciele z rodzajów Nocardia i Streptomyces wykazują uzdolnienia do rozkładu celulozy, lignin oraz różnych połączeń aromatycznych. Przyjmuje się, że stosunek bakterii do promieniowców wynosi 60:40. Niektóre promieniowce mogą też wytwarzać antybiotyki. Szeroko rozpowszechnione w glebach uprawnych są grzyby organotroficzne, przedstawiciele klas grzybów niedoskonałych (Fungi imperfecti), sprzężniaków (Zygomycota), workowców (Ascomycota) oraz drożdże z rodziny Saccharomycetaceae i Cryptococcaceae. Grzyby z rodzaju Penicillium mogą wytwarzać antybiotyki. Przeciętne proporcje poszczególnych przedstawicieli mikroflory gleby Drobnoustroje Jtk/1 g gleby Bakterie 50 000 000 Promieniowce 6 000 000 http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 3 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 9 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Grzyby 85 000 Glony 2 000 Pierwotniaki 15 000 PODZIAŁ MIKROORGANIZMÓW GLEBOWYCH 1. Mikroflora autochtoniczna – obejmuje mikroorganizmy, które zawsze występują i rozwijają się w danym środowisku, w tym przypadku gleba jest dla nich najwłaściwszym środowiskiem, żyją w niej dzięki rozkładowi próchnicy czerpiąc z niej energię oraz mineralizując jej węgiel i azot. 50-80% mikroorganizmów gleby stanowią bakterie saprofityczne, glebotwórcze. Możemy wyróżnić: fotolitotrofy – drobnoustroje przeprowadzające fotosyntezę: glony, bakterie zielone, bakterie purpurowe siarkowe i bezsiarkowe, sinice (Nostoc, Anabaena), chemoorganotrofy – w tym różne bakterie i grzyby (workowce, drożdże, grzyby niedoskonałe), promieniowce, pierwotniaki i mezofauna. Do tej grupy należą mikroorganizmy przeprowadzające różne procesy: o bakterie uczestniczące w przemianach związków azotu (bakterie nitryfikacyjne, denitryfikacyjne i wiążące azot) jak Nitrosomonas, Nitrobacter, Pseudomonas, Serratia, Clostridium, Bradyrhizobium, Azotobacter, Arthrobacter, Rhizobium, o bakterie uczestniczące w przemianach związków siarki, np. Thiobacillus, Desulfovibrio, o bakterie uczestniczące w przemianach związków fosforu, np. Serratia, Pseudomonas, Corynebacterium oraz grzyby Penicillium Rhodotorula o grzyby: Zygomycota, Ascomycota, Fungi imperfecti, drożdże: Saccharomycetes, Cryptococcus, Rhodotorula, Candida, oraz promieniowce: Nocardia, Streptomyces, które syntetyzują bądź rozkładają różne związki, oraz wpływają na strukturę gleby. 2. Mikroflora zymogenna – to drobnoustroje bytujące okresowo (saprofity i patogeny), dostają się do gleby niejako z zewnątrz, są aktywne w okresie dobrych warunków (np. po dostaniu się do gleby reszek roślin lub zwierząt rozwijają się masowo), po wyczerpaniu się w glebie łatwo dostępnej substancji organicznej przechodzą w stan spoczynku, który trwa aż do następnej dostawy świeżej substancji organicznej. Bakterie autochtoniczne są natomiast aktywne cały czas. Źródła mikroflory zymogennej to resztki roślin i padlina zwierząt oraz http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 4 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 9 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ odchody zwierząt i ludzi, zdrowych lub chorych, gryzonie i owady, nosiciele mikroflory patogennej, ścieki bytowo-gospodarcze z gospodarstw rolnych, nawozy naturalne (obornik, kompost roślinny), opady atmosferyczne zmywające obszary zamieszkałe przez ludzi oraz środowiska przemysłowe (mikroflora patogenna). Zaliczamy tu: o mikroorganizmy pochodzące z nawozów naturalnych: pałeczki gramujemne Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Proteus, Azotobacter, o szczególnie niebezpieczne dla człowieka bakterie Salmonella (dur brzuszny), Shigella (czerwonka), Clostridium tetani (tężec), Clostridium botulinum (jad kiełbasiany), Escherichia coli (pałeczki fekalne), prątki gruźlicy oraz wirusy polio, ECHO, WZW, o termofile: Bacillus stearothermophillus, Listeria monocytogenes, Yersinia, Aeromonas. MIKROFLORA WODY Woda jest naturalnym środowiskiem bytowania wielu organizmów żywych, w tym drobnoustrojów. W zbiorniku wodnym organizmy można podzielić na 3 zasadnicze grupy: - producenci – organizmy samożywne, wykorzystujące substancje nieorganiczne do budowy związków organicznych, warunkują życie wszystkich pozostałych organizmów, należą tu rośliny zielone, bakterie fotosyntetyzujące i chemosyntetyzujące, - konsumenci – to mikroorganizmy zwierzęce żywiące się gotowymi substancjami organicznymi w postaci żywych lub martwych organizmów, - reducenci – to bakterie oraz grzyby, w większości saprofityczne, które żywią się ciałami producentów, konsumentów i innych reducentów oraz organicznymi produktami metabolizmu wszystkich organizmów, rozkładają związki organiczne do substancji prostych. Mikroorganizmy pełnią w wodzie bardzo ważną rolę, należą tu przedstawiciele zarówno producentów, jak i reducentów. W wodach lądowych znaleźć można przedstawicieli prawie wszystkich grup drobnoustrojów, obok form typowo wodnych występują tu także drobnoustroje bytujące normalnie w glebie, powietrzu, przewodach pokarmowych ludzi i zwierząt. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 5 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 9 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Skład jakościowy i ilościowy drobnoustrojów w wodzie zależy od warunków przyrodniczych, klimatycznych, meteorologicznych, rodzaju dna, pory roku, pory doby oraz charakteru, jakości i głębokości wody. Drobnoustroje występujące w wodzie można podzielić na 2 grupy. 1. Mikroflora autochtoniczna (tubylcza) to drobnoustroje naturalnie bytujące i rozmnażające się w środowisku wodnym. Najbardziej typowe mikroorganizmy wodne to autotrofy (foto- i chemotrofy) i heterotrofy, zdolne do wzrostu nawet w obecności śladowych ilości substancji odżywczych. Do grupy tej należą: - bakterie siarkowe z rodzajów Beggiatoa, Thiothrix, Thiobacillus, Thiorhodaceae, Chlorobium, wykorzystujące siarczany, siarczki, tiosiarczany i siarkę elementarną w swoich procesach życiowych, Beggiatoa sp. – żółte kuleczki w nitkach to siarka http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 6 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 9 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Thiothrix Chlorobium – zielone bakterie siarkowe, które utleniają H2S, początkowo do siarki elementarnej (S0), a w przypadku całkowitego wyczerpania siarkowodoru utleniają siarkę S0 do siarczanu (SO42-). Siarka jest gromadzona w postaci zewnątrzkomórkowych białych granulek, które powodują, że hodowla ma wygląd mleczny. - bakterie żelaziste z rodzajów Leptothrix, Gallionella, Crenothrix, Clonothrix (mogą powodować zatykanie i korozję przewodów wodnych), Leptothrix – potrafią utleniać zarówno Fe(II), jak i Mn(II). http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 7 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 9 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Gallionella – utlenia i akumuluje żelazo (w postaci Fe(OH) lub FeOOH) wokół swoich spiralnie skręconych nici - inne bakterie, m.in. z rodzajów Vibrio, Pseudomonas, Achromobacter, Spirochaeta, Aeromonas, Selenomonas, Spirillum, - grzyby z rodzajów Mucor, Leptomitus, Saprolegnia Leptomitus lacteus http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 8 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 9 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Saprolegnia – częsta pleśń w środowisku wodnym, powoduje infekcje ryb i pleśnienie jaj (ikry) 2. Mikroflora allochtoniczna (naniesiona) przedostaje się do wód (głównie powierzchniowych): z powietrza i gleby, ze ścieków przemysłowych (drożdżowni, browarów, zakładów mięsnych i mleczarskich), z przewodu pokarmowego człowieka i zwierząt bezpośrednio wraz z odchodami lub za pośrednictwem ścieków komunalnych. Ze względu na znaczenie dla zdrowia i gospodarki człowieka mikroorganizmy można podzielić na saprofityczne (nieszkodliwe, wyżej wymienione autotrofy i heterotrofy), patogenne (chorobotwórcze) i szkodliwe w określonych gałęziach przemysłu. Bakterie patogenne należą do drobnoustrojów allochtonicznych i dostają się do wody z przewodu pokarmowego ludzi i zwierząt. W wodzie nie rozmnażają się, lecz są przenoszone na następnego żywiciela. Drogą wodną przenoszone są: cholera przenoszona przez przecinkowca cholery (Vibrio cholerae, w wodzie powierzchniowej przeżywa do kilku tygodni, w wodociągowej kilka dni), dur brzuszny powodowany przez pałeczkę duru brzusznego (Salmonella Typhi), czerwonka - pałeczki czerwonki (Shigella flexneri i Shigella sonnei) tularemia - Pasteurella (Francisella) tularensis. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 9 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 9 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Wystarczy 10 komórek Francisella tularensis, aby wywołać u ludzi ciężką, podobną do dżumy chorobę – tularemię .Bakteria znajduje się na liście substancji biologicznych, co do których istnieją możliwości użycia ich w ataku terrorystycznym. Mogą być także tą drogą przenoszone brucelloza, żółtaczka zakaźna, gorączka błotna oraz enterowirusy (wirusy Polio). Podczas analiz mikrobiologicznych wody niemożliwe jest badanie wszystkich organizmów chorobotwórczych, ze względu na ich niewielkie ilości w porównaniu z pozostałą mikroflorą oraz specyficzne wymagania pokarmowe. Dlatego do wykrywania zanieczyszczeń kałowych w wodzie wykorzystuje się badanie obecności tzw. mikroorganizmów wskaźnikowych (tab. 1). Są to inne bakterie, występujące obficie w przewodzie pokarmowym, łatwe w hodowli i zasadniczo nieszkodliwe w stosunku do ludzi, które dostają się do wody z wydalinami ludzkimi lub zwierzęcymi. Badania mikroflory jelitowej ustaliły stałe występowanie trzech różnych rodzajów bakterii wskaźnikowych, świadczących o kontakcie wody z fekaliami lub ściekami: - pałeczka okrężnicy (Escherichia coli) i Enterobacter aerogenes, - paciorkowce kałowe z typowym gatunkiem Enterococcus faecalis, - beztlenowce przetrwalnikujące Clostridium perfringens. Stwierdzenie zawartości bakterii z grupy coli powyżej normy (tab. 2) świadczy o fekalnym zanieczyszczeniu wody, a tym samym o możliwości występowania bakterii chorobotwórczych. Tabela 1. Wymagania mikrobiologiczne dla wody pitnej i na potrzeby gospodarcze Wskaźnik jakości wody Liczba bakterii grupy coli typu kałowego w 100 cm3 Liczba bakterii grupy coli w 100 cm3 Liczba kolonii bakterii na agarze odżywczym po 24h, 37C w 1 cm3 Liczba kolonii bakterii na agarze odżywczym po 24h, 20C w 1 cm3 Woda z wodociągów sieciowych dezynfekowana Podawana W sieci do sieci 0 0 Woda z wodociągów sieciowych niedezynfekowana Podawana do W sieci sieci 0 0 Woda z wodociągów lokalnych, studni publicznych i studni zakładowych 0 0 1 1 2 2 10 20 20 40 40 50 100 100 200 X – nie oznacza się Tabela 2. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 10 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 9 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Wskaźniki bakteriologiczne jakości wody do picia Rodzaj oznaczenia Escherichia coli lub bakterie grupy coli typu kałowego (termotolerancyjne) Bakterie grupy coli Paciorkowce kałowe Clostridium sp. redukujące siarczany Ogólna liczba bakterii w temp. 37°C Ogólna liczba bakterii w temp. 20°C Objętość próbki [cm3] 100 Dopuszczalna ilość bakterii 0 100 100 20 1 1 0 0 0 10 100 Zgodnie z obowiązującymi w Polsce przepisami, sanitarna ocena wody polega na określeniu liczby bakterii psychrofilnych oraz mezofilnych w 1 cm3 badanej wody oraz ustaleniu tzw. miana coli. MIANO COLI Miano coli jest to najmniejsza objętość badanej wody lub ścieków (w cm3), w której stwierdza się jeszcze obecność bakterii z grupy coli. Miano coli jest wartością niemianowaną. Jeśli miano coli wynosi 10 to znaczy, że w 10 cm3 znajduje się co najmniej 1 komórka bakterii z grupy pałeczki okrężnicy. Wartość miana coli jest odwrotnie proporcjonalna do stopnia zanieczyszczenia wody! Za bakterie z grupy coli uważa się gramujemne pałeczki nie wytwarzające przetrwalników, rozwijające się w warunkach względnie beztlenowych, mające zdolność fermentowania laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu, w ciągu 48 h hodowli w temp. 35-37°C. Tryptofan redukują do indolu. Należą do niej bakterie z rodzaju Escherichia, Citrobacter, Enterobacter i Klebsiella. SAMOOCZYSZCZANIE WODY Z biologicznego punktu widzenia zanieczyszczeniami są czynniki działające szkodliwie na organizmy ludzi i zwierząt w przypadku korzystania z wody do celów konsumpcyjnych. Czynnikami tymi może być nadmierne stężenie soli, substancji organicznych, zmieniona temperatura wody, radioaktywność, mętność i barwa, a także obecność bakterii i wirusów chorobotwórczych. Samooczyszczanie chemicznych przy jest udziale naturalnym procesem usuwania czynników biologicznych i zanieczyszczeń fizykochemicznych. Zanieczyszczenia po rozcieńczeniu wodą odbieralnika, po sedymentacji i adsorpcji zawiesin ulegają mineralizacji przy udziale mikroorganizmów wodnych, jak bakterie, promieniowce, http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 11 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 9 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ grzyby, pierwotniaki, sinice i wiciowce. Przy wystarczającej ilości tlenu w wodzie, w wyniku mineralizacji otrzymuje się wodę przejrzystą i pozbawioną zapachu. Przy braku wolnego tlenu proces mineralizacji prowadzą bakterie beztlenowe, a produktami rozkładu zanieczyszczeń są kwasy organiczne, aminy, amoniak, metan, siarkowodór, indol, skatol i inne związki, które nadają wodzie przykry zapach (indol, skatol) lub mają właściwości trujące (amoniak, siarkowodór). Woda uzyskana w drodze oczyszczania beztlenowego jest nadal mętna i cuchnąca. Poza czynnikami biotycznymi, czyli organizmami żywymi, wpływ na samooczyszczanie wody mają również czynniki abiotyczne, jak zawartość tlenu, temperatura wody, odczyn środowiska, obecność substancji toksycznych i radioaktywnych. Zawartość tlenu jest związana z oddychaniem drobnoustrojów. Przy dużym zanieczyszczeniu może dojść do całkowitego wyczerpania tlenu., Ilość tlenu (w mg na litr wody), która zostanie zużyta przez mikroorganizmy (heterotrofy) na mineralizację zanieczyszczeń nosi nazwę biochemicznego zapotrzebowania na tlen (BZT). W praktyce oznacza się zwykle BZT5, czyli biochemiczne zapotrzebowanie na tlen w czasie 5 dni. OKREŚLANIE LICZBY BAKTERII PSYCHRO- I MEZOFILNYCH W WODZIE Posiewu bakterii na agar odżywczy dokonuje się w dwóch równoległych powtórzeniach. Wodę wodociągową należy posiewać bezpośrednio, pobierając 1 cm3 wody i przenosząc na płytkę Petriego. Dodatkowo posiewu dokonuje się często z rozcieńczenia 10-1. Wodę powierzchniową wysiewa się z rozcieńczeń 10-3 i 10-5, a ścieki miejskie z rozcieńczeń 10-6 i 10-8. Następnie płytki odwraca się do góry dnem i jedną z nich wstawia do cieplarki o temp. 20°C, drugą do cieplarki o temp. 37°C. Czas hodowli w pierwszym przypadku dla bakterii psychrofilnych wynosi 72 h, a w drugim – dla bakterii mezofilnych wynosi 24 h. OZNACZANIE BAKTERII GRUPY COLI METODĄ FERMENTACYJNO-PROBÓWKOWĄ Bakterie grupy coli można wykryć metodą fermentacyjno-probówkową, a wynik podać jako miano coli. Wykrywanie tych bakterii oparte jest na zdolności do fermentowania laktozy z wytworzeniem w podłożu kwasu oraz gazu. Posiewów dokonuje się na podłoże Eijkmana (LPB - zawiera laktozę i wskaźnik purpurę bromokrezolową) z rurką Durhama wewnątrz, a następnie inkubuje w temp. 37°C przez 24 lub 48 godzin. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 12 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 9 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ Za wynik dodatni posiewu (obecność bakterii z grupy coli) przyjmuje się obecność gazu w probówce Durhama (nie mniej niż 1/10 objętości), zmętnienie pożywki i zmianę jej barwy z fioletowej na żółtą. Jeśli po 24 godzinach powyższe zmiany nie wystąpią, wówczas próbki inkubuje się dalej i ponownie odczytuje po 48 h. Wodę wodociągową (pitną), której miano powinno być większe niż: 100 – wysiewa się systemem = 50 cm3 i 5x10 cm3 (ewentualnie 5x10 cm3 i 1 cm3). Jeśli dopuszczalne miano coli wody badanej wynosi: 50 – wysiewa się = 5x10 cm3, 1 cm3 oraz 10-1 cm3 10 – wysiewa się = 2x10 cm3, 1 cm3 oraz 10-1 cm3. Wykonuje się to w ten sposób, że do 5 probówek lub butelek zawierających po 10 cm3 podwójnie stężonego podłoża wprowadza się po 10 cm3 wody wodociągowej z kolejnych rozcieńczeń. Wodę powierzchniową posiewa się bezpośrednio oraz z kolejnych rozcieńczeń (10-1, 10-2, 10 -3, 10-4 itd.). Schemat rozcieńczeń i posiewów przy oznaczaniu miana coli: 5 x 10 cm3, 1 cm3, 10-1 cm3, 10-2 cm3, 10-3 cm3 Pojawienie się bardzo małej ilości gazu, przy jednoczesnym bardzo słabym zakwaszeniu lub braku http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 13 MIKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI Ćwiczenie 9 WTŻ II rok ___________________________________________________________________________ zakwaszenia, uważa się za wynik wątpliwy. Hodowle, których wyniki po 24 godzinach inkubacji uznano za wątpliwe, poddaje się badaniu potwierdzającemu, a następnie inkubuje dalej do 48 h. W przypadku wątpliwości wykonuje się posiew na podłoże Endo oraz próby biochemiczne np. na wytwarzanie indolu. Badania potwierdzające należy wykonać przesiewając bakterie jałową ezą z podłoża laktozowego na pożywkę Endo. Inkubację należy prowadzić w temp. 37°C w ciągu 24 godzin. Bakterie grupy coli rosną na pożywce Endo w postaci ciemnoczerwonych kolonii o metalicznym (fuksynowym) połysku. W przypadku obecności chociażby jednej takiej kolonii na pożywce Endo, wynik badania potwierdzającego należy uznać za dodatni. Próba na indol Probówki zawierające wodę peptonową z tryptofanem szczepi się 1 ml badanej wody bezpośrednio lub z rozcieńczenia. Po 48-godzinnej inkubacji w temperaturze 37°C nanosi się po ściance kilka kropel odczynnika Ehrlicha, który w obecności indolu barwi się na różowo. http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/ 14
