cwiczenia nr 10

Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka
Ćwiczenie 10
Część teoretyczna
KOLOKWIUM 2
I. MIKROFLORA OPAKOWAŃ
Stopień zakażenia opakowań, szczególnie bezpośrednich, ma wpływ na jakość produktów. Zakażone
opakowania wnoszą do produktu mikroflorę, której część może powodować zepsucia. W celu usunięcia
mikroorganizmów, opakowania poddawane są myciu. Efekt mycia określa się porównując stopień zakażenia
opakowania przed myciem (A) z zakażeniem po myciu (B). Efekt dezynfekcyjny oblicza się ze wzoru:
y = 100 – B/A * 100%.
Dobrze wykonane mycie usuwa z powierzchni opakowania 99,99% drobnoustrojów.
Mikroflorę opakowań można określić czterema sposobami:
1) Metoda popłuczyn – stosuje się ją do określania mikroflory małych opakowań szklanych lub
metalowych, tj. butelki, słoje, puszki, konwie itp. Do naczynia wlewa się płyn Ringera w ilości 1/20
objętości naczynia, a następnie po zamknięciu wytrząsa 25 razy wzdłuż osi poprzecznej i 25 razy wzdłuż osi
podłużnej. Z popłuczyn robi się posiewy, z reguły po rozcieńczeniu;
naczynia myte do 10-2, a nie myte do 10-4. Rodzaj użytego do
hodowli podłoża zależy od opakowania. Do opakowań na
produkty owocowe stosuje się agar brzeczkowy. Do opakowań
konserw warzywnych i warzywno-mięsnych używa się agaru
odżywczego z glukozą, do opakowań produktów mięsnych i ryb
– agar odżywczy, a do produktów mleczarskich – agar bulionowy
z mlekiem i laktozą. Płytki z agarem odżywczym inkubuje się
w temp.37ºC przez 48 godzin, a z agarem brzeczkowym – w
temp. 28-30ºC przez 72 godziny. Po inkubacji liczy się kolonie
i oblicza stopień zakażenia powierzchni, podając liczbę komórek
na 1 cm2 powierzchni. W prawidłowo umytych opakowaniach nie
powinno być więcej niż 10 komórek na 1 cm2.
2) Metoda bezpośrednia (Richtera) – polega na hodowli drobnoustrojów na
badanej powierzchni. Metodę tą stosuje się do oznaczania zakażenia butelek
do mleka. Do butelki wlewa się 15 ml podłoża bulionowego z mlekiem i
laktozą z dodatkiem 3% agaru. Butelkę obraca się tak aby podłoże
rozprowadzić po całej powierzchni wewnętrznej butelki. Inkubacje prowadzi
się przez 4 dni w temp. 20ºC. Wynik podaje się w jtk/cm2 powierzchni opakowania.
1
Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka
3) Metoda tamponowa – stosuje się ją do badania zakażeń dużych powierzchni opakowań i przedmiotów,
tj. beczki, kadzie fermentacyjne, skrzynki, kontenery, stoły i urządzenia produkcyjne. Tampony
przygotowuje się z czterokrotnie złożonej gazy pociętej na kwadraty o boku 5 cm, boki zszywa się i
sterylizuje w suszarce w 160ºC. Dodatkowo sporządza się szablon z drutu lub blachy w postaci kwadratu o
znanej powierzchni. Szablon wyjaławia się w alkoholu, opala w płomieniu i przykłada do badanej
powierzchni. Tampon chwyta się jałową pincetą, zanurzą w płynie Ringera, odciska nadmiar płynu i wyciera
dokładnie powierzchnię ograniczoną szablonem. Tampon wrzuca się do kolbki z płynem, wytrząsa 2 minuty
a z otrzymanej zawiesiny wykonuje się rozcieńczenia i posiewa na płytki.
4) Metoda odciskowa – stosowana jest do oznaczeń zakażeń opakowań typu
papier, pergamin, folia, korki itp. Po wylaniu na płytki podłoża i po zestaleniu
agaru, płytki wstawia się do termostatu o temp. 55ºC na 1 godzinę w celu
podsuszenia podłoża. Z badanego materiału wycina się kwadraty o boku 5 cm2
i jałową pincetą przenosi na płytki, lekko przyciskając do podłoża. Po zdjęciu
próbki płytkę inkubuje się, a wyniki podaje jako liczbę komórek na 100 cm2
powierzchni.
Część praktyczna:
Wszystkie doświadczenia należy wykonywać w warunkach jałowych!
1. Odczyty posiewów z wody – oznaczenie bakterii psychro- i mezofilnych.
a) policzyć ilość kolonii wyrosłych na każdej szalce z agarem odżywczym
b) uwzględniając rozcieńczenie i objętość posianych próbek wody policzyć ilość psychro- i mezofili w jtk na
1 cm3 badanej wody
c) wyniki (każda grupa) umieścić w zbiorczej tabeli (na ćwiczeniach)
d) obliczenia, zbiorczą tabelę i omówienie wyników umieścić w sprawozdaniu 3.
2. Odczyt zmian w probówkach LPB (metoda fermentacyjno-probówkowa)
a) odczytać zmiany w poszczególnych probówkach dla każdej próby wody, (zmiana barwy, zmętnienie,
obecność i wielkość pęcherzyka gazu w rurce Durhama)
b) opisy wraz z omówieniem umieścić w sprawozdaniu 3
3. Przesiew z prób LPB na agar Endo (posiew potwierdzający)
a) wybrać próbkę wody z wynikiem wątpliwym
b) za pomocą ezy posiać wodę na podłoże Endo (szalka Petriego)
c) opisana szalkę odłożyć do inkubacji
4. Metoda popłuczyn (praca w trzech grupach)
2
Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka
a) do wykonania doświadczenia potrzebne: brudna butelka, płyn do naczyń i szczotka do butelek, parafilm,
nożyczki, woda sterylna do rozcieńczeń (w słoiczku 99 cm3 i 4 probówki z 9 cm3), 4 szalki z agarem
odżywczym i 4 z agarem brzeczkowym, pipeta automatyczna i końcówki, głaszczki, szklana pipeta, pompka.
b) doświadczenie wykonać według schematu
Przed myciem (A)
1/20 objętości
sterylnego płynu
do rozcieńczeń
Posiew powierzchniowy
1 cm3
1 cm3
1
2
3
9 cm3
10-3
99 cm3
10-2
zamknąć
parafilmem
i wytrząsać
25x wzdłuż
osi pionowej
i 25x wzdłuż
osi poprzecznej
1 cm3
1 cm3
2
1 cm3
3
agar
odżywczy
(AO)
Bakterie
1 cm3
9 cm3
10-4
4
agar
agar
brzeczkowy
odżywczy
(AB)
(AO)
Drożdże
Bakterie
i grzyby
1 cm3
agar
brzeczkowy
(AB)
Drożdże
i grzyby
Po myciu (B)
1/20 objętości
sterylnego płynu
do rozcieńczeń
Posiew powierzchniowy
1 cm3
1 cm3
1
2
9 cm3
10-2
zamknąć
1 cm3
parafilmem
2
i wytrząsać
25x wzdłuż
osi pionowej
i 25x wzdłuż
agar
osi poprzecznej odżywczy
(AO)
Bakterie
1 cm3
9 cm3
10-3
1 cm3
agar
brzeczkowy
(AB)
Drożdże
i grzyby
1 cm3
3
agar
odżywczy
(AO)
Bakterie
agar
brzeczkowy
(AB)
Drożdże
i grzyby
3
Mikrobiologia – II rok Towaroznawstwo i Dietetyka
c) odpowiednio opisane szalki odłożyć do inkubacji
d) policzyć pole powierzchni mytej butelki! WAŻNE NIE ZAPOMNIEĆ!
5. Metoda Richtera (bezpośrednia)
a) rozpuścić 15 ml podłoża w łaźni wodnej
b) do słoiczka szybko wlać wystudzony do ok. 45ºC agar, szybko zamknąć zakrętką, przechylić i powoli
obracać pod małym strumieniem zimnej wody, aby agar pokrywał równomiernie wewnętrzne ścianki
słoiczka, do całkowitego zestalenia
c) odpowiednio opisany słoiczek pozostawić do inkubacji
6. Metoda popłuczyn
a) plastykowy szablon o wewnętrznej powierzchni 25 cm2 wyjałowić za pomocą alkoholu
b) sterylny tampon pobrać jałową pęsetą i wrzucić do słoiczka z 25 cm3 sterylnej wody do rozcieńczeń
c) tampon odcisnąć z nadmiaru wody pęsetą
d) szablon przyłożyć do badanej powierzchni i pobrać próbkę tamponem dokładnie wycierając powierzchnię
e) tampon ponownie umieścić w słoiczku z 25 cm3 płynu, dokładnie wytrząsnąć
f) pobrać 1 cm3 płynu i posiać powierzchniowo na agar odżywczy
g) opisaną szalkę odłożyć do inkubacji
7. Metoda odciskowa
a) wyciąć, w miarę możliwości w jak najbardziej jałowy sposób, kwadrat o boku 5 cm, z szarego papieru
pakunkowego
b) za pomocą pęsety papier przyłożyć do agaru odżywczego, lekko docisnąć i zdjąć
c) opisaną szalkę pozostawić do inkubacji.
4