Æwiczenia nr 9
advertisement
Mikrobiologia – II rok Dietetyka Ćwiczenie 9 Część teoretyczna: I. MIKROFLORA POWIETRZA Drobnoustroje w powietrzu rzadko występują w postaci wolnej, zwykle jako bioaerozole. Bioaerozol to układ dwu- lub trójfazowy, składający się z fazy rozpraszającej (powietrza) i rozproszonej (drobne cząsteczki płynu lub substancji stałych zawierające pyłki roślin, zarodniki grzybów, komórki bakterii, drożdży i wirusy). Drobnoustroje, przyczepione do cząstek kurzu i pyłu lub mikrokropelek płynów, mogą przebywać w powietrzu bardzo długo. Saprofityczną mikroflorę powietrza stanowią: ziarniaki z rodzaju Micrococcus i Sarcina wytwarzające barwniki, gronkowce białe, pałeczki Alcaligenes, tlenowe laseczki przetrwalnikujące z rodzaju Bacillus. W pomieszczeniach zamkniętych oraz w powietrzu atmosferycznym występują zarodniki grzybów strzępkowych z rodzaju Cladosporium, Penicillium, Aspergillus, Alternaria, Botrytis, czy Rhizopus i Mucor oraz drożdże Rhodotorula, Torulopsis i Candida. Liczba zarodników pleśni i komórek bakterii w powietrzu atmosferycznym zależy od sezonu, warunków pogodowych, wysokości nad poziomem morza. Bakterie chorobotwórcze, tj. gronkowiec złocisty (Staphylococcus aureus), pałeczka ropy błękitnej (Pseudomonas aeruginosą), a także paciorkowce z rodzaju Enterococcus i Streptococcus przedostają się do powietrza z jamy nosowo-gardłowej, zakażonych ran czy bielizny szpitalnej. Oznaczanie stopnia zakażenia powietrza Analiza powietrza prowadzona jest w oparciu o obecność tzw. wskaźników bakteriologicznego zanieczyszczenia powietrza. Są to gatunki lub rodzaje wytypowane jako przedstawiciele mikroflory pochodzącej z określonych zanieczyszczeń – gleby, wód powierzchniowych, od ludzi i zwierząt. Wskaźniki bakteriologicznego zanieczyszczenia powietrza: - z przewodów oddechowych człowieka – gronkowce i paciorkowce hemolizujące Staphylococcus albus, Streptococcus salivarius, Streptococcus viridans, - cząstkami gleby – promieniowce, - cząstkami wód powierzchniowych – Pseudomonas fluorescens. Dezynfekcja i wyjaławianie powietrza może być prowadzona następującymi metodami: • mechanicznie – filtrowanie przez filtry włókniste bawełniane, z włókien szklanych lub przez roztwory kwasów i ługów, • fizycznie – ogrzewanie powietrza poprzez sprężanie go do wysokich ciśnień, odpylanie elektrostatyczne oraz z zastosowaniem promieniowania UV, promieniowania jonizującego, wysokoenergetycznych promieni katodowych, gamma lub ultradźwięków, • chemicznie – stosowanie substancji bakteriobójczych, w tym preparatów na bazie kwasu nadoctowego, nadtlenku wodoru, podchlorynu sodu, kwasu mlekowego, glikolu propylenowego i jego pochodnych. 1 Mikrobiologia – II rok Dietetyka Ogólna liczba bakterii 3 Liczba drożdży i pleśni 3 Promieniowce Stopień zanieczyszczenia powietrza jtk/m jtk/m jtk/m3 atmosferycznego Poniżej 1000 10 3000-5000 Niezanieczyszczone 1000-3000 10-100 5000-10000 Średnio zanieczyszczone Powyżej 3000 Powyżej 100 Powyżej 10000 Silnie zanieczyszczone Zasadniczo wyróżnia się dwie grupy metod pobierania prób oparte na: 1) osiadaniu zawiesin drobnoustrojów, 2) filtracji powietrza przez filtry. Metoda sedymentacyjna Kocha Najczęściej stosowaną metodą badawczą badania stopnia zanieczyszczenia mikrobiologicznego powietrza jest metoda sedymentacyjna. Oparta jest na swobodnym osiadaniu pod wpływem sił grawitacji pyłków i kropelek niosących mikroorganizmy. Pobranie próby polega na otwarciu przez ściśle określony czas płytki Petriego z wylaną uprzednio pożywką. Wynik ostateczny, tj. ilość drobnoustrojów w 1 m3 powietrza oblicza się ze wzoru Omeliańskiego: L=A·100·100/P·k Gdzie: L- ilość drobnoustrojów (jtk/m3) A – średnia ilość kolonii na płytkach Petriego, P – powierzchnia płytki (cm2), k – współczynnik zależny od czasu ekspozycji k=1 dla 5 minut, k=2 dla 10 minut, k=3 dla 15 minut. Metody zderzeniowe Wyróżniamy w nich dwa sposoby przepuszczania powietrza tzn. wirowanie powietrza wciąganego przez przyrząd (mikroorganizmy osadzają się na cylindrze) lub zderzanie strumienia zassanego powietrza z pożywką. 2 Mikrobiologia – II rok Dietetyka Metody filtracji Polegają na przepuszczaniu określonej objętości powietrza przez odpowiedni jałowy filtr. Po przefiltrowaniu powietrza, wypłukuje się zatrzymane drobnoustroje ze stałego materiału filtracyjnego znaną objętością cieczy, która następnie posiewa się na pożywki stałe. II. ANALIZA ILOŚCIOWA MIKROORGANIZMÓW – METODY HODOWLANE - znajomość ilości mikroorganizmów potrzebna jest dla oceny wzrostu drobnoustrojów w warunkach hodowli laboratoryjnych, dla oceny prawidłowego przebiegu procesów biotechnologicznych, dla określenia stopnia zanieczyszczenia produktów żywnościowych lub farmaceutycznych - metody określania ilości drobnoustrojów oparte są na metodach bezpośrednich – mikroskopowych, pośrednich – hodowlanych, wagowych, optycznych - metody hodowlane pośrednie oparte są na zdolności drobnoustrojów do rozmnażania, dzięki czemu oznacza się tylko żywe komórki zdolne do wzrostu: w pożywkach płynnych (metoda rozcieńczeń) w pożywkach stałych (metoda płytkowa) A) Metoda rozcieńczeń - metoda seryjnych rozcieńczeń Listera należy do klasycznych technik stosowanych do określania liczby drobnoustrojów oraz do izolowania czystych hodowli ze środowiska płynnego - zasada tej metody polega na wieloetapowym rozcieńczaniu badanej zawiesiny, tak aby w 1 cm3 znajdowała się jedna komórka - z kolejnych rozcieńczeń wykonuje się posiewy po 1 cm3 do pożywek płynnych co najmniej w dwóch powtórzeniach - po inkubacji określa się ilość prób dodatnich – takich w których rosną drobnoustroje - korzystając z tablic McCrady’ego ujmujących statystycznie ilość prób ze wzrostem drobnoustrojów, rozcieńczeniem i ilością powtórzeń wylicza się w oparciu o rachunek prawdopodobieństwa NPL, czyli najbardziej prawdopodobną liczbę drobnoustrojów w 1 cm3 badanej próby - dokładność metody zależy od przygotowania właściwych rozcieńczeń i od ilości równoległych prób - warunkiem jest przygotowanie takiego szeregu rozcieńczeń, aby w ostatnim nie były już obecne mikroorganizmy - jest to jednak metoda czasochłonna, pracochłonna, wymagająca dużej ilości szkła i jest rzadko stosowana B) Metoda płytkowa - tradycyjna metoda mikrobiologiczna stosowana powszechnie - wprowadzona w 1881 roku przez Roberta Kocha - zastosowanie: określanie liczby drobnoustrojów, izolacja czystych kultur, obserwacja morfologiczna, 3 Mikrobiologia – II rok Dietetyka - zasada polega na wysiewie odpowiednio rozcieńczonej zawiesiny drobnoustrojów na pożywkę stałą, inkubacje i liczenie wyrosłych kolonii - wady: wyrosłe kolonie mogą łączyć się w łańcuszki, zlewać się itp., a więc mogą powstawać z więcej niż jednej komórki, wyrosłe kolonie są to tylko te które wyrosły z komórki zdolnej do rozmnażania - technika: rozcieńczenia zawiesiny (0.85 % NaCl jałowy – rozpuszczalnik, w objętości 9, 90 lub 99 cm3 uzupełnia się odpowiednio 1, 10 i 1 cm3 zawiesiny drobnoustrojów, uzyskując żądane rozcieńczenia, roztwór dokładnie zamieszać, do każdego rozcieńczenia osobne pipety) posiewy na płytki Petriego – metoda wgłębna lub powierzchniowa inkubacja – czas 24-48 godzin, w temperaturze optymalnej dla danego gatunku drobnoustrojów, płytki z agarem odwrócone do góry nogami, z żelatyną normalnie liczenie – liczymy wyrosłe kolonie, odrzucamy te gdzie kolonii jest więcej niż 300. III. MIKROFLORA GLEBY O rozwoju mikroorganizmów w glebie decydują części stałe, zawierające związki mineralne i substancje organiczne (ok. 50% gleby), powietrze glebowe (ok. 35%) oraz roztwór glebowy (ok. 15%). Mikroflora gleby jest bardzo bogata i stanowi najszybciej rosnący i reagujący na zmiany parametrów środowiska składnik jej biocenozy. Drobnoustroje odgrywają w glebie dwojaką rolę: - rozmnażają się i metabolizują materię organiczną, tworząc biomasę własnych komórek oraz nagromadzają substancje, które tworzą próchnicę, - rozkładają i mineralizują związki organiczne, przez co wprowadzają w ponowny obieg pierwiastki niezbędne do produkcji roślinnej. Drobnoustroje Jtk w 1 g gleby Bakterie 50 000 000 Promieniowce 6 000 000 Grzyby 85 000 Glony 2 000 Pierwotniaki 15 000 Do najpospolitszych i najczęściej występujących drobnoustrojów w glebach i na roślinach należą organotroficzne bakterie z rodzajów Alcaligenes, Bacillus, Enterobacter, Flavobacterium, Micrococcus oraz wirusy. Istotną rolę odgrywają bakterie wiążące azot atmosferyczny i prowadzące przemiany azotu mineralnego oraz organicznego, m.in. z rodzajów Azotobacter, Arthrobacter, Nitrosomonas, Nitrobacter, Pseudomonas, Serratia oraz beztlenowce Clostridium. Pod względem zawartości w glebie drugą grupę po bakteriach właściwych stanowią organotroficzne promieniowce, których przedstawiciele z rodzajów Nocardia i Streptomyces wykazują uzdolnienia do rozkładu celulozy, lignin oraz różnych połączeń aromatycznych. Szeroko rozpowszechnione w glebach uprawnych są grzyby organotroficzne, przedstawiciele klas grzybów niedoskonałych, glonowców, workowców oraz drożdże z rodziny Sąccharomycetaceae i Cryptococcaceae. 4 Mikrobiologia – II rok Dietetyka Podział mikroorganizmów glebowych 1. Mikroflora autochtoniczna – obejmuje mikroorganizmy, które zawsze występują i rozwijają się w danym środowisku, w tym przypadku gleba jest dla nich najwłaściwszym środowiskiem, żyją w niej dzięki rozkładowi próchnicy czerpiąc z niej energię oraz mineralizując jej węgiel i azot. 50-80% mikroorganizmów gleby stanowią bakterie saprofityczne, glebotwórcze. Możemy wyróżnić: fotolitotrofy – drobnoustroje przeprowadzające fotosyntezę: glony, bakterie zielone Chlorobium, bakterie purpurowe siarkowe Thiobacillus, bakterie purpurowe bezsiarkowe Desulfovibrio, sinice (Nostoc, Anabaena), chemoorganotrofy – na przykład bakterie: Alcaligenes, Bacteroides, Bacillus, Enterobacter, Escherichia, Flavobacterium, Micrococcus, Leuconostoc lub grzyby (workowce, drożdże, grzyby niedoskonałe), promieniowce, pierwotniaki i mezofauna. Do tej grupy należą mikroorganizmy przeprowadzające różne procesy: bakterie uczestniczące w przemianach związków azotu (bakterie nitryfikacyjne, denitryfikacyjne i wiążące azot) jak Nitrosomonas, Nitrobacter, Pseudomonas, Serratia, Clostridium, Bradyrhizobium, Azotobacter, Arthrobacter, Rhizobium, bakterie uczestniczące w przemianach związków siarki, np. Thiobacillus, Desulfovibrio, bakterie uczestniczące w przemianach związków fosforu, np. Serratia, Pseudomonas, Corynebacterium oraz grzyby Penicillium, Rhodotorula grzyby: Zygomycota, Ascomycota, Fungi imperfecti, drożdże: Sąccharomycetes, Cryptococcus, Rhodotorula, Candida, oraz promieniowce: Nocardia, Streptomyces, które syntetyzują bądź rozkładają różne związki, oraz wpływają na strukturę gleby. 2. Mikroflora zymogenna – to drobnoustroje bytujące okresowo (saprofity i patogeny), dostają się do gleby niejako z zewnątrz, są aktywne w okresie dobrych warunków (np. po dostaniu się do gleby reszek roślin lub zwierząt rozwijają się masowo), po wyczerpaniu się w glebie łatwo dostępnej substancji organicznej przechodzą w stan spoczynku, który trwa aż do następnej dostawy świeżej substancji organicznej. Bakterie autochtoniczne są natomiast aktywne cały czas. Źródła mikroflory zymogennej to resztki roślin i padlina zwierząt oraz odchody zwierząt i ludzi, zdrowych lub chorych, gryzonie i owady, nosiciele mikroflory patogennej, ścieki bytowo-gospodarcze z gospodarstw rolnych, nawozy naturalne (obornik, kompost roślinny), opady atmosferyczne zmywające obszary zamieszkałe przez ludzi oraz środowiska przemysłowe (mikroflora patogenna). Zaliczamy tu: mikroorganizmy pochodzące z nawozów naturalnych: pałeczki gramujemne Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Proteus, Azotobacter, szczególnie niebezpieczne dla człowieka bakterie Salmonella (dur brzuszny), Shigella, (czerwonka), Clostridium tetani (tężec), Clostridium botulinum (jad kiełbasiany), Escherichia coli (pałeczki fekalne), prątki gruźlicy oraz wirusy polio, ECHO, WZW, termofile: Bacillus stearothermophillus, Listeria monocytogenes, Yersinia, Aeromonas. IV. WŁAŚCIWOŚCI ENZYMATYCZNE MIKROORGANIZMÓW • aktywność proteolityczna – aby białka mogły być wykorzystywane przez mikroorganizmy, muszą zostać najpierw rozłożone. Drobnoustroje wydzielają w tym celu proteinazy, enzymy zewnątrzkomórkowe, które 5 Mikrobiologia – II rok Dietetyka hydrolizują białka, początkowo do peptydów, a w końcowym efekcie do aminokwasów. Aminokwasy mogą dalej ulegać reakcjom dekarboksylacji lub/i dezaminacji. W pierwszym przypadku powstają aminy biogenne – typowe produkty gnilnego rozkładu białek. Aktywność proteolityczną mikroorganizmów badamy na podłożach zawierających żelatynę. Wynikiem pozytywnym jest rozpuszczenie pożywki, wokół posiewu. • aktywność lipolityczna – drobnoustroje rozkładające tłuszcze tworzą lipazy, za pomocą których hydrolizują je do gliceryny i kwasów tłuszczowych. Kwasy tłuszczowe (szczególnie nienasycone), mogą dalej ulegać przemianom tzw. jełczeniu, w wyniku, czego tworzą się związki o bardzo nieprzyjemnym zapachu. Aktywność lipolityczna badana jest na podłożu z margaryną. Wynikiem pozytywnym jest rozpuszczona pożywka wokół kolonii (strefa przejaśnienia). • aktywność celulolityczna – enzymatyczne rozszczepienie celulozy katalizowane jest przez celulazę, na której aktywność składają się co najmniej trzy enzymy: endo-β-1,4-glukanaza (atakuje wiązania wewnątrz łańcuchów, tworzą się krótsze łańcuchy celulozowe), egzo-β-1,4-glukanaza (odcinająca disacharyd celobiozę od końców łańcuchów celulozy) oraz β-glukozydazy (hydrolizuje celobiozę do glukozy). Aktywność celulolityczną bada się na podłożu zawierającym karboksymetylocelulozę. Wynikiem pozytywnym jest upłynnienie pożywki. • aktywność amylolityczna – skrobia hydrolizowana jest przez enzymy amylazy. W wyniku jej rozpadu powstają coraz krótsze łańcuchy dekstryn, a w końcowym etapie maltotrioza, maltoza i glukoza. Aktywność tę bada się na podłożu zawierającym skrobie rozpuszczalną. Na posiew po tygodniu inkubacji nanosi się płynu Lugola, przejaśnienia wokół kolonii świadczą o reakcji pozytywnej. Część praktyczna: Wszystkie doświadczenia wykonujemy w warunkach jałowych! 1. Badanie stopnia zanieczyszczenia mikrobiologicznego powietrza metodą sedymentacyjną Kocha a) przygotowane szalki Petriego (dla każdej grupy po 2 sztuki; 1-sza z agarem odżywczym i 2-ga z agarem brzeczkowym) opisać b) eksponować szalki w dowolnym miejscu sali laboratoryjnej lub innym pomieszczeniu (otwarcie szalki) w taki sposób, aby uniemożliwiony był ruch powietrza wokół nich, przez 15 minut c) odłożyć szalki we wskazane miejsce do inkubacji 2. Badanie mikroflory gleby a) do wykonania ćwiczenia potrzebne będą sterylna woda (99,9 cm3), gleba, waga, łyżeczka aluminiowa, dwie probówki z 9 cm3 sterylnej wody destylowanej, szalki Petriego z podłożem Pochona dla promieniowców i z podłożem Martina dla grzybów pleśniowych, dwie puste sterylne szalki Petriego (posiew metodą wgłębną), kolba z rozpuszczonym agarem odżywczym, głaszczka, łaźnia wodna wrząca, pipeta automatyczna i sterylne końcówki 6 Mikrobiologia – II rok Dietetyka b) doświadczenie wykonać wg schematu a) 1 cm3 próby zalać agarem odżywczym Saprofity Ogólna Liczba Bakterii (OLB) 0.1 g gleby 2 1 9 cm3 10-4 99.9 cm3 10-3 1 cm3 1 cm3 1 cm3 1 cm3 2 Podłoże Pochona Promieniowce 3a 9 cm3 10-5 1 cm3 Podłoże Martina Grzyby pleśniowe Posiew powierzchniowy b) Całą probówkę wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 10 min. 1 cm3 Posiew 3b wglebny b) 1 cm3 z probówki z łaźni wodnej zalać agarem odżywczym Bacillus (Bakterie przetrwalnikujace) c) opisane szalki Petriego wstawić do cieplarki 3. Posiew Bacillus na podłoża do zbadania właściwości enzymatycznych a) za pomocą ezy pobrać próbki z hodowli Bacillus i posiać na każde z podłóż: Fraziera (proteolityczna), z margaryną (lipolityczna), ze skrobią (amylolityczna), z karboksymetylocelulozą (celulolityczna) b) opisane szalki pozostawić do inkubacji 7
