DLA BAKTERII BEZTLENOWYCH API 20E METODY

OGÓLNE ZASADY
DIAGNOSTYKI
MIKROBIOLOGICZNEJ
Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej
Anna Majewska
DROBNOUSTROJE
•BAKTERIE
•WIRUSY
•GRZYBY
RODZAJE INTERAKCJI
DROBNOUSTROJU Z ORGANIZMEM
DROBNOUSTROJE KOMENSALNE
DROBNOUSTROJE OPORTUNISTYCZNE
DROBNOUSTROJE PATOGENNE
DIAGNOSTYKA MIKROBIOLOGICZNA
CEL:
• IDENTYFIKACJA CZYNNIKA
ETIOLOGICZNEGO ODPOWIEDZIALNEGO
ZA ZAKAŻENIE
• OKREŚLENIE JEGO PROFILU
WRAŻLIWOŚCI NA CHEMIOTERAPEUTYKI
• NADZÓR MIKROBIOLOGICZNY I
EPIDEMIOLOGICZNY
POBRANIE MATERIAŁU
TRANSPORT
METODA DIAGNOSTYCZNA
PRÓBKI MATERIAŁU DO BADANIA
MIKROBIOLOGICZNEGO
WYMAZ Z GARDŁA I MIGAŁKÓW, PLWOCINA,
WYMAZ Z RANY, ROPA Z ROPNIA,
WYCINKI TKANEK,
KREW, KAŁ, MOCZ,
POPŁUCZYNY PĘCHERZYKOWO- OSKRZELOWE
PŁYN MÓZGOWO-RDZENIOWY,
WYMAZ ZE SPOJÓWKI,
ZESKROBINY ROGÓWKOWE
ZASADY
•PRZED ROZPOCZĘCIEM CHEMIOTERAPII
•Z MIEJSC, W KTÓRYCH TOCZY SIĘ PROCES
CHOROBOWY
•W ODPOWIEDNIM CZASIE
•POBRAĆ ODPOWIEDNIĄ ILOŚĆ/OBJĘTOŚĆ
MATERIAŁU
•ZACHOWAĆ ZASADY ASEPTYKI (SPRZĘT,
DEZYNFEKCJA SKÓRY)
•ZAPEWNIĆ WŁAŚCIWE WARUNKI
PRZECHOWYWANIA I TRANSPORTU
(TERMICZNE, PODŁOŻA TRANSPORTOWE)
•DOSTARCZYĆ DO PRACOWNI
MIKROBIOLOGICZNEJ W MOŻLIWIE
NAJKRÓTSZYM CZASIE
METODY
BEZPOŚREDNIE
WYKRYCIE DROBNOUSTROJU
LUB JEGO FRAGMENTU
W MATERIALE KLINICZNYM
POŚREDNIE
WYKRYCIE SWOISTYCH
PRZECIWCIAŁ
METODY
METODY KONWENCJINALNE
(HODOWLA DROBNOUSTROJÓW)
METODY NIEHODOWLANE
(SZYBKIE TESTY
DIAGNOSTYCZNE)
METODY KONWENCJONALNE
(HODOWLA)
IZOLACJA I IDENTYFIKACJA DROBNOUSTROJU
METODY HODOWLI DROBNOUSTROJÓW
POŁĄCZONE Z IZOLACJĄ I IDENTYFIKACJĄ
MIKROORGANIZMU (NAJCZĘŚCIEJ DO
GATUNKU) NAZYWANE SĄ METODAMI
KONWENCJONALNYMI (KLASYCZNYMI).
SĄ SZCZEGÓLNIE ISTOTNE W BAKTERIOLOGII I
MIKOLOGII, GDZIE OPRÓCZ IDENTYFIKACJI
CZYNNIKA ETIOLOGICZNEGO POWINNY BYĆ
WYKONANE TESTY WRAŻLIWOŚCI NA
CHEMIOTERAPEUTYKI/ANTYBIOTYKI.
W POBRANYCH MATERIAŁACH WYSTĘPUJĄ
RÓŻNE GATUNKI DROBNOUSTROJÓW, W CELU
ICH WYIZOLOWANIA, NAMNOŻENIA I
UZYSKANIA CZYSTEJ HODOWLI, PRÓBKI
POSIEWA SIĘ NA ODPOWIEDNIE PODŁOŻA
WZROSTOWE.
HODOWLA DROBNOUSTROJÓW
STWORZYĆ WARUNKI W KTÓRYCH BYTUJĄ DROBNOUSTROJE
W A R U N K I H O D O W L I:
TLENOWE, MIKROAEROFILNE, BEZTLENOWE
TEMPERATURA: 35-37°C, 22-30°C
CIŚNIENIE OSMOTYCZNE - IZOTONICZNE
STĘŻENIE JONÓW WODOROWYCH (pH) - 6,8 - 7,5
P O D Ł O Ż A (POŻYWKI) H O D O W L A N E
PŁYNNE, PÓŁPŁYNNE, STAŁE
PROSTE, WZBOGACONE, SPECJALNE , RÓŻNICUJĄCE,
WYBIÓRCZE, WYBIÓRCZO - RÓŻNICUJĄCE
IDENTYFIKACJA
•NA PODSTAWIE CHARAKTERYSTYCZNEGO
WZROSTU NA PODŁOŻACH
(MORFOLOGII KOLONII)
S. aureus
Salmonella spp.
MORFOLOGIA KOLONII
•KSZTAŁT - OKRGŁY, OWALNY, SOCZEWKOWATY,
PROMIENISTY
• WIELKOŚĆ - ŚREDNICA KOLONII [W MM]
• BRZEG - RÓWNY, FALISTY, POSZARPANY
• POWIERZCHNIA - GŁADKA, POMARSZCZONA,
GRUBOZIARNISTA
• WYNIOSŁOŚĆ PONAD POWIERZCHNIĘ - PŁASKA, BRAK,
STOŻKOWATA
• KOLOR - KOLONII, PODOŻA
• PRZEJRZYSTOŚĆ - PRZEJRZYSTA, MĘTNA
• ZAPACH - DROŻDŻY, MIODU
• TYP HEMOLIZY - α, β, γ
PRODUKCJA HEMOLIZYN
S. pyogenes
S. pneumoniae
C. perfringens - podwójna hemoliza
WZROST NA PODŁOŻACH PŁYNNYCH
WZROST DROBNOUSTROJÓW ZWIĄZANY JEST ZE
SPOSOBEM ODDYCHANIA BAKTERII.
• MOŻE ODBYWAĆ SIĘ NA POWIERZCHNI
POŻYWKI,
• TWORZYĆ OSAD NA DNIE NACZYNIA LUB
POWODOWAĆ
• ZMĘTNIENIE CAŁEJ POŻYWKI
IDENTYFIKACJA (2)
• NA PODSTAWIE OBRAZU MIKROSKOPOWEGO
• NA PODSTAWIE WYNIKÓW TESTÓW
BIOCHEMICZNYCH (KOMERCYJNE TESTY API)
OKREŚLAJĄCYCH ZDOLNOŚĆ
DROBNOUSTROJÓW DO NP.: ROZKŁDU
CUKRÓW, ALKOHOLI, ICH WŁAŚCIWOŚCI
PROTEOLITYCZNE, WYTWARZANIE
ENZYMÓW
NAJBARDZIEJ ROZPOWSZECHNIONE SĄ
KOMERCYJNE BIOCHEMICZNE TESTY
DIAGNOSTYCZNE, NP.:
API 20 E - PRZEZNACZONE DLA BAKTERII
Z RODZINY ENTEROBACTERIACEAE
API 20 A - DLA BAKTERII
BEZTLENOWYCH
API 20E
METODY NIEHODOWLANE
•ODCZYNY IMMUNOLOGICZNE
•METODY BIOLOGII MOLEKULARNEJ
•TYPOWANIE BAKTERIOFAGAMI
METODY NIEHODOWLANE (1)
ODCZYNY IMMUNOLOGICZNE
• PRECYPITACJI
• AGLUTYNACJI
• IMMUNOFLUORESCENCJI,
• IMMUNOENZYMATYCZNE
ODCZYN PRECYPITACJI
ROZPUSZCZALNE ANTYGENY POLIPEPTYDOWE LUB
WIELOCUKROWE UZYSKUJE SIĘ Z TKANEK LUB Z
DROBNOUSTROJÓW NA DRODZE EKSTRAKCJI KWASAMI,
ENZYMATYCZNIE LUB W PODWYŻSZONEJ TEMPERATURZE.
DO ICH IDENTYFIKACJI STOSOWANE SĄ W OBECNOŚCI
ELEKTROLITÓW ZNANE SWOISTE PRZECIWCIAŁA.
ZASTOSOWANIE:
OZNACZANIE GRUP SEROLOGICZNYCH PACIORKOWCÓW
HEMOLIZUJĄCYCH WG LANCEFIELD (IDENTYFIKACJA
WIELOCUKRU C) - PRECYPITACJA OBRĄCZKOWA.
IMMUNOPRECYPITACJA (IMMUNODYFUZJA) - METODA ELEKA
DO WYKRYWANIA TOKSYNOTWÓRCZOŚCI MACZUGOWCÓW
BŁONICY.
AGLUTYNACJA LATEKSOWA
MIKROCZĄSTECZKI LATEKSU OPŁASZCZONE SĄ
ZNANYMI PRZECIWCIAŁAMI, KTÓRE WIĄŻĄ SIĘ ZE
SPECYFICZNYMI ANTYGENAMI, DOPROWADZAJĄC
DO WIDOCZNEJ GOŁYM OKIEM AGLUTYNACJI.
WYKONANIE TESTÓW NIE WYMAGA UŻYCIA
CZYSTYCH SZCZEPÓW DROBNOUSTROJÓW.
ZASTOSOWANIE: IDENTYFIKACJA DWOINEK
ZAPALENIA PŁUC, DO WYKRYWANIA CZYNNIKÓW
ZAPALENIA OPON MÓZGOWO - RDZENIOWYCH (H.
INFLUENZAE, S. PNEUMONIAE).
AGLUTYNACJA SZKIEŁKOWA
IDENTYFIKACJA NIEZNANYCH SZCZEPÓW
BAKTERYJNYCH,
PRZY UŻYCIU ZNANYCH SWOISTYCH SUROWIC
ODPORNOŚCIOWYCH.
ZASTOSOWANIE: W DIAGNOSTYCE BAKTERII Z
RODZAJÓW :
SALMONELLA, SHIGELLA, PSEUDOMONAS, NEISSERIA.
Coli Lateks EPEC
METODY IMMUNOFLUORESCENCYJNE
ODCZYN IMMUNOFLUORESCENCJI
BEZPOŚREDNIEJ
PO UTRWALENIU PRÓBKI NAKRAPLA SIĘ WZORCOWE
PRZECIWCIAŁA WYZNAKOWANE FLUOROCHROMEM.
PO OKRESIE INKUBACJI PREPARAT UMIESZCZA SIĘ W
MIKROSKOPIE FLUORESCENCYJNYM.
JEŚLI W BADANYM MATERIALE ZNAJDOWAŁY SIĘ
SPECYFICZNE DLA WYZNAKOWANYCH PRZECIWCIAŁ
DROBNOUSTROJE, W POLU WIDZENIA MIKROSKOPU
UWIDOCZNI SIĘ ŚWIECĄCY KOMPLEKS.
METODY IMMUNOFLUOROSCENCYJNE
ODCZYN IMMUNOFLUORESCENCJI POŚREDNIEJ
W REAKCJI BIORĄ UDZIAŁ 3 REAGUJĄCE
SUBSTANCJE:
•ZNANY ANTYGEN,
•BADANA SUROWICA,
•ZNAKOWANA FLUOROCHROMEM
ANTYIMMUNOGLOBULINA ZWIERZĘCA PRZECIW
POSZUKIWANYM PRZECIWCIAŁOM.
METODY IMMUNOENZYMATYCZNE (EIA, ELISA)
BEZPOŚREDNIE - BADANE ANTYGENY REAGUJĄ
Z PRZECIWCIAŁAMI, KTÓRE, ZWIĄZANE SĄ Z ENZYMEM
NP.: PEROKSYDAZĄ CHRZANOWĄ.
DLA UWIDOCZNIENIA KOMPLEKSU
ANTYGENU Z PRZECIWCIAŁEM
DODAJE SIĘ ODPOWIEDNIO
DOBRANY SUBSTRAT
I PO INKUBACJI
ODCZYTUJE SIĘ WYNIK
REAKCJI BARWNEJ
JAKOŚCIOWO
LUB ILOŚCIOWO.
METODY POŚREDNIE
ZASTOSOWANIE: DIAGNOSTYKA ZAKAŻEŃ
WYWOŁANYCH PRZEZ DROBNOUSTROJE Z RODZAJU:
BORRELIA, LEGIONELLA, CHLAMYDIA.
METODY NIEHODOWLANE (2)
METODY BIOLOGII MOLEKULARNEJ
POSZUKIWANIE KWASÓW NUKLEINOWYCH W
MATERIALE KLINICZNYM LUB HODOWLI
DROBNOUSTROJÓW;
• PCR (METODA POLIMERYZACJI REAKCJI
ŁAŃCUCHOWEJ),
• HYBRYDYZACJA KWASÓW NUKLEINOWYCH
PRZY UŻYCIU SOND MOLEKULARNYCH
METODA POLIMERAZOWEJ REAKCJI
ŁAŃCUCHOWEJ (PCR)
POZWALA NA WYKRYCIE ZNIKOMEJ ILOŚCI DNA
W BADANEJ PRÓBCE,
NAWET GDY DROBNOUSTROJE W MATERIALE
ZAKAŹNYM SĄ MARTWE.
HYBRYDYZACJA KWASÓW
NUKLEINOWYCH - PRZY UŻYCIU SOND
MOLEKULARNYCH.
BADANIE TRWA OK. 2 GODZ. I UMOŻLIWIA W
ZALEŻNOŚCI OD RODZAJU DROBNOUSTROJU
WYKRYCIE DNA PRZY ILOŚCI 10 3
DROBNOUSTROJÓW.
INNE METODY IDENTYFIKACJI
ANALIZA CHROMATOGRAFI GAZOWEJ
METODA STOSOWANA JEST DO JAKOŚCIOWEGO LUB
ILOŚCIOWEGO ROZDZIAŁU SUBSTANCJI (SKŁADNIKÓW
KOMÓREK BAKTERYJNYCH LUB PRODUKTÓW ICH
METABOLIZMU) O MAŁEJ MASIE CZĄSTECZKOWEJ.
WYSOCE PRECYZYJNA I CZUŁA.
STOSOWANA JEST GŁÓWNIE DO IDENTYFIKACJI PRODUKTÓW
METABOLIZMU BAKTERII BEZTLENOWYCH (KWASY
TŁUSZCZOWE).
POZWALA TEŻ NA SZYBKĄ IDENTYFIKACJĘ GRZYBÓW I
BAKTERII Z RODZAJÓW MYCOBACTERIUM, NEISSERIA.
TYPOWANIE BAKTERIOFAGAMI
MA NA CELU IDENTYFIKACJĘ OKREŚLONYCH
GATUNKÓW WYHODOWANYCH BAKTERII
(RZADKO) LUB OZNACZANIE ICH TYPÓW
FAGOWYCH.
OZNACZANIE TYPÓW FAGOWYCH STOSOWANE
JEST W DOCHODZENIU EPIDEMIOLOGICZNYM,
W CELU USTALENIA ŹRÓDŁA ZAKAŻENIA I
DRÓG SZERZENIA W ŚRODOWISKU
SZPITALNYM I POZASZPITALNYM.
OKREŚLENIE LEKOWRAŻLIWOŚCI
POZWALA NA WYBÓR CHEMIOTERAPEUTYKU O
NAJWĘŻSZYM ZAKRESIE DZIAŁANIA I
NAJWIĘKSZEJ SKUTECZNOŚCI PRZECIWKO
WYIZOLOWANEMU DROBNOUSTROJOWI.
DOSTĘPNE SĄ KOMERCYJNE METODY
OZNACZANIA LEKOOPORNOŚCI BAKTERII WG
SYSTEMU ATB:
ATB G - DLA RODZINY ENTEROBACTERIACEAE
ATB - STAPH 5 - DLA GRONKOWCÓW
ATB - ANA - DLA BAKTERII BEZTLENOWYCH
WYKRYWANIE MECHANIZMÓW OPORNOŚCI
BAKTERII NA LEKI - TESTY SPECJALNE
METODA DYFUZYJNO - KRĄŻKOWA
Aglutynacja lateksowa
WYKRYWANIE BIAŁKA PBP 2’ - IDENTYFIKACJA
GRONKOWCÓW OPORNYCH NA METYCYLINĘ
(MRSA, MRCNS)