Metody detekcji i identyfikacji bakterii
advertisement
Metody detekcji i identyfikacji bakterii Dorota Żabicka Zakład Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej Narodowy Instytut Leków Warszawa Budowa komórki bakteryjnej Badanie mikrobiologiczne Cel: identyfikacja czynnika etiologicznego zakażenia i oznaczenie wrażliwości na antybiotyki Tok badania mikrobiologicznego Pobranie materiału Badanie materiału: Metody klasyczne Badanie mikroskopowe Hodowla i identyfikacja drobnoustroju Oznaczenie wrażliwości bakterii na antybiotyki Metody immunologiczne Metody molekularne Pobieranie i przesyłanie materiału Rodzaj podłoża transportowego i rodzaj pojemników są dostosowywane do rodzaju materiału i kierunku badania (bakterie, wirusy, obecność przeciwciał) Badanie mikroskopowe Mikroskop świetlny Preparaty barwione metoda Grama metody specjalne np. barwienie na obecność zarodników Laseczka tężca Clostridium tetani, zarodniki na końcu komórki bakteryjnej nadające kształt pałeczki dobosza Ściana komórkowa bakterii Bakterie Gram-dodatnie Bakterie Gram-ujemne Badanie mikroskopowe Neisseria meningitidis Preparat z osadu płynu mózgowordzeniowego barwiony metodą Grama Cryptococcus neoformans Preparat tuszowy z osadu płynu mózgowo-rdzeniowego Badanie mikroskopowe Preparat z ciemnym polem widzenia (Treponema pallidum) Mikroskop fluorescencyjny Badanie mikroskopowe Mikroskop kontrastowo-fazowy grzyby z rodzaju Candida Badanie mikroskopowe Mikroskop elektronowy Hodowla bakterii Stosowane podłoża bakteriologiczne płynne i stałe Hodowla prowadzona w warunkach najbardziej odpowiednich dla poszukiwanych drobnoustrojów Czas hodowli od kilku godzin (np. pałeczki okrężnicy czyli Escherichia coli) do kilkunastu dni (np. prątki gruźlicy czyli Mycobacterium tuberculosis) Wymagania wzrostowe bakterii Zapotrzebowanie na tlen Źródło węgla Tlenowe – O2 Beztlenowe – mniej niż 1-0,5% O2 Mikroaerofilne – mieszanina 5% O2, 10% CO2, 85% N2 Autotroficzne – CO2 Heterotroficzne – aminokwasy, peptydy, cukry, lipidy Pozostałe związki niezbędne do wzrostu Sole nieorganiczne Witaminy Czynniki fizykochemiczne Temperatura pH Psychrofile – optimum 0-10C Mezofile – optimum 20-40C Termofile – optimum 50-60C Większość bakterii preferuje neutralne wartości pH ~ 7.0 Ciśnienie osmotyczne Wiekszość preferuje aw ~ 0,99 Wzrost hodowli bakterii w podłożu płynnym Hodowla i identyfikacja drobnoustrojów Podłoże agarowe wzbogacone krwią – widoczna strefa hemolizy dookoła kolonii Hodowla i wstępna identyfikacja drobnoustrojów CPS Podłoża wybiórcze, wybórczo-różnicujące chromogenne i specjalne MacConkey agar Oznaczanie mechanizmów oporności na antybiotyki – podłoża chromogenne MRSA ESBL VRE Hodowla i identyfikacja drobnoustrojów Identyfikacja drobnoustrojów z zastosowaniem testów wykonywanych na płytkach wrażliwość na bacytracynę test CAMP Hodowla i identyfikacja drobnoustrojów Identyfikacja drobnoustrojów z zastosowaniem zestawów probówkowych gotowych testów identyfikacyjnych Systemy automatyczne Systemy automatyczne stosowane są do hodowli drobnoustrojów (np. Bactec do posiewów krwi) lub do identyfikacji i oznaczenia lekowrażliwości wyhodowanych wcześniej na podłożach stałych drobnoustrojów VITEK 2 Compact BioMerieux Phoenix BD Diagnostic Systems System VITEK 2 Compact System automatyczny do identyfikacji i oznaczenia lekowrażliwości drobnoustrojów wyhodowanych wcześniej na podłożach stałych Oznaczenie lekowrażliwości drobnoustrojów Oznaczanie metodą rozcieńczeniową Gotowe testy diagnostyczne do odczytu manualnego Oznaczanie za pomocą systemów automatycznych Oznaczanie lekowrażliwości i mechanizmów oporności na antybiotyki Dyfuzja z krążka Podłoże z antybiotykiem Dyfuzja z paska Szczep gronkowca złocistego (Staphylococcus aureus) oporny na wszystkie antybiotyki -laktamowe (MRSA) Metody immunologiczne Testy lateksowe, ELISA, immunofluorescencyjne wykrywające całe komórki lub antygeny bakterii (białka powierzchniowe, wielocukry otoczkowe, toksyny) Pozwalają wykryć bakterie w materiale pobranym od chorego lub pomagają w identyfikacji wyhodowanych bakterii Stosowane gotowe testy manualne lub automatyczne Aglutynacja lateksowa Metody immunologiczne - EIA Metody immunologiczne – systemy automatyczne System VIDAS Nowe metody oparte o metody immunologiczne Spektrometria MALDI-TOF Spektrometria MALDI-TOF Spektrometria MALDI-TOF Metody molekularne Stosowane głównie metody oparte o reakcje PCR lub real-time PCR Dostępne różne gotowe testy komercyjne w dwóch wariantach Zestaw odczynników do wykrywania bakterii, reakcja w dowolnym aparacie do PCR lub real-time PCR Zestawy odczynników lub zamknięte systemy diagnostyczne przeznaczone do użycia w aparacie określonej firmy Testy zarówno do wykrycia bakterii np. M.tuberculosis jak i identyfikacji ważnych epidemiologicznie bakterii np. MRSA lub wykrycia toksyn bakteryjnych Genom bakteryjny Chromosom bakteryjny o różnej wielkości w zależności od gatunku bakterii oraz obecności wbudowanych elementów ruchomych (plazmidów, transpozonów, bakteriofagów) Metoda PCR DNA Ruler 100 6018/99 6758/99 ATCC43300 ATCC 29213 Ruler100 Metoda PCR mecA ok. 550 kb mecA gen występujący u MRSA Real-time PCR Krzywe reakcji real-time PCR Szybkie testy molekularne np. GeneXpert Sondy typu Scorpion Dwa rodzaje sond typu Scorpion stosowane w testach z serii GeneXpert rysunki: źródło Cepheid Zintegrowana kontrola wewnętrzna w mieszaninie reakcyjnej Mg 2+ target scorpion Taq DNA Polymerase IC scorpion dCTP dGTP dUTP Internal Control (IC) dATP rysunki źródło Cepheid Mikromacierze Bakteriofagi – wirusy bakteryjne Bakteriofagi - morfologia Bakteriofagi – cykle życiowe Bakteriofagi – zastosowanie w diagnostyce Typowanie bakterii w celu określenia pokrewieństwa izolowanych szczepów łysinka Bakteriofagi – zastosowanie w detekcji i identyfikacji bakterii Bakteriofagi – zastosowanie w detekcji i identyfikacji bakterii Bakteriofagi – zastosowanie w detekcji i identyfikacji bakterii Dziękuję za uwagę
