Spektrofluorymetria w badaniach biologicznych

advertisement
Ćwiczenie 1. Zastosowanie średniociśnieniowej chromatografii cieczowej
do izolacji i charakterystyki biomakromolekuł
W nowoczesnej biochemii rosnące znaczenie, szczególnie dla celów analitycznych, lecz także
w coraz większym stopniu dla celów preparatywnych zyskują metody wysokorozdzielczej
chromatografii cieczowej. Należą do nich: średniociśnieniowa chromatografia cieczowa –
MPLC (ang. medium pressure liquid chromatography), gdzie stosowane nadciśnienia
mieszczą się w zakresie 0.6 – 5 MPa oraz wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa –
HPLC (ang. high pressure liquid chromatography), z nadciśnieniami powyżej 5 MPa.
Techniki te charakteryzują się wysoką rozdzielczością i krótkim czasem separacji. Sprzęt
stosowany do nich jest jednak dość drogi, kosztowne są także specjalne złoża
chromatograficzne. Poszczególne elementy zestawu muszą sprostać zwiększonym
wymaganiom. Pompy powinny wytwarzać stałe, wolne od pulsacji nadciśnienie, przy
zwiększonym ciśnieniu zwrotnym. Kolumny i złoża muszą być odporne na wyższe ciśnienia
wytwarzane w zestawie. Detektory charakteryzować się powinny krótkim czasem odpowiedzi
na sygnał. Metody średniociśnieniowe znalazły szczególne zastosowanie w separacji białek.
Firma Pharmacia Biotech wprowadziła na rynek zestawy FPLC (ang. fast protein liquid
chromatography), które obecnie stanowią już standardowe wyposażenie coraz większej liczby
laboratoriów. W zestawie tym nadciśnienie wytwarzane jest przez precyzyjne pompy tłokowe
skonstruowane ze szkła borokrzemianowego, tytanu i teflonu. Użycie tych materiałów
minimalizuje możliwość denaturacji białek, a z drugiej strony umożliwia stosowanie buforów
zawierających wysokie stężenia jonów chlorkowych – niezbędnych dla chromatografii
jonowymiennej. Dla celów FPLC opracowane zostały specjalne złoża chromatograficzne,
m.in: Mono Q, Mono P, Resource Q,. Resource P dla chromatografii jonowymiennej,
Superdex 200 dla filtracji żelowej, Phenyl Superose dla chromatografii hydrofobowej. Złoża
te, utworzone z doskonale sferycznych mikrogranulek, zapewniają duże natężenia przepływu
przy zachowaniu wysokiej rozdzielczości. W skład podstawowego zestawu FPLC wchodzą
oprócz dwóch pomp detektor UV, rejestrator, kolektor frakcji i moduł sterujący. Ten ostatni
element – mózg układu – umożliwia zaprogramowanie profilu elucji kolumny, w tym kształtu
gradientu czynnika elucyjnego, i zapewnia ciągłą kontrolę parametrów podczas procesu
chromatograficznego. Bardziej zaawansowane wersje systemu FPLC, sterowane
komputerowo, dają możliwość realizacji złożonych procesów chromatograficznych,
obejmujących kilka kolejnych etapów.
1.1. Chromatografia kolumnowa białek- podstawy teoretyczne
Chromatografia kolumnowa – polega na rozdzieleniu mieszaniny poprzez wprowadzenie jej
na stacjonarną fazę stałą (adsorbent) umieszczoną w cylindrycznej kolumnie i rozdzieleniu jej
na składniki przy użyciu ciekłej fazy ruchomej. Przepływ fazy ruchomej może być
grawitacyjny lub wymuszony przez niewielkie nadciśnienie wprowadzanego eluentu
uzyskiwane np. za pomocą pompy perystaltycznej lub sprężonego gazu. Składniki mieszaniny
przemieszczają się ku dołowi z szybkością zależną od siły oddziaływań ich cząsteczek z
adsorbentem. Siła tych oddziaływań zależy od budowy cząsteczek, dlatego poszczególne
składniki mieszaniny przemieszczają się z różną szybkością. Dzięki temu rozdzielone
składniki można kolejno odbierać na dole kolumny. W zależności od wielkości kolumn i
ilości rozdzielanego materiału chromatografia kolumnowa może być wykonywana w skali
analitycznej, laboratoryjnej (półpreparatywnej, preparatywnej) i przemysłowej.
1.2. Aparatura
W zestawie FPLC nadciśnienie wytwarzane jest przez precyzyjne pompy tłokowe
skonstruowane ze szkła borokrzemianowego, tytanu i teflonu. Użycie tych materiałów
minimalizuje możliwość denaturacji białek, a z drugiej strony umożliwia stosowanie buforów
zawierających wysokie stężenia jonów chlorkowych – niezbędnych dla chromatografii
jonowymiennej. Dla celów FPLC opracowane zostały specjalne złoża chromatograficzne,
m.in: Mono Q, Mono P, Resource Q,. Resource P dla chromatografii jonowymiennej,
Superdex 200 dla filtracji żelowej, Phenyl Superose dla chromatografii hydrofobowej. Złoża
te, utworzone z doskonale sferycznych mikrogranulek, zapewniają duże natężenia przepływu
przy zachowaniu wysokiej rozdzielczości. W skład podstawowego zestawu FPLC wchodzą
oprócz dwóch pomp detektor UV, rejestrator, kolektor frakcji i moduł sterujący (Fot. 1). Ten
ostatni element – mózg układu – umożliwia zaprogramowanie profilu elucji kolumny, w tym
kształtu gradientu czynnika elucyjnego, i zapewnia ciągłą kontrolę parametrów podczas
procesu chromatograficznego. Bardziej zaawansowane wersje systemu FPLC, sterowane
komputerowo, dają możliwość realizacji złożonych procesów chromatograficznych,
obejmujących kilka kolejnych etapów.
Fot. 1 Zestaw AKTA-FPLC firmy Pharmacia Biotech
1.3. Zastosowanie FPLC w badaniach biologicznych
Podstawowym zastosowaniem metod chromatogrficznych jest oczyszczanie makrocząsteczek
biologicznych. Najprostszy schemat strategii oczyszczania obejmuje etapy: 1) ekstrakcji
makromolekuł ze źródeł biologicznych, 2) stabilizacji i koncentracji 3) wstępnego
podczyszczenia preparatu oraz 4) uzyskania preparatu o wysokiej czystości. Metody
chromatograficzne wykorzystuje się w dwóch końcowych etapach.
Metodą chromatograficzną najczęściej stosowaną we wstępnych etapach oczyszczania
makromolekuł jest chromatografia jonowymienna (ang. ion exchange chromatography IEX).
Złoża IEX wykazują wysoką zdolność wiązania i są odporne na trudne warunki oczyszczania
związane z nanoszeniem na kolumny surowej mieszaniny makromolekuł. Białka są
wymywane z kolumny IEX w gradiencie soli lub poprzez zmianę pH buforu elucyjnego.
Typowy chromatogram elucji mieszaniny białek przedstawia Rys1.
Rys. 1 Klasyczny schemat elucji gradientowej IEX
Zaletą metody IEX jest możliwość nanoszenia na kolumnę dużych objętości próbki, o
wysokim stężeniu białka oraz uzyskanie wstępnie podczyszczonych preparatów w krótkim
czasie, przy niewielkim wykorzystaniu buforów elucyjnych.
Przykładem kolumny jonowymiennej jest anionit RESOURCE Q (firmy GE HealthCare Life
Sciences). Rys. 2 przedstawia przykładowy chromatogram procesu oczyszczania pankreatyny
ma kolumnie Resorce Q 1ml w gradiencie NaCl.
Rys.2 Chromatogram oczyszczania pankreatyny na
kolumnie Resource Q 1ml
Rekomendowany przepływ buforu elucyjnego: 110 ml/min; maksymalne ciśnienie robocze 1.5MPa;
objętość martwa kolumny 1ml
Kolejną często stosowaną techniką chromatograficzną jest chromatografia wykorzystująca
oddziaływania hydrofobowe makrocząsteczek ze złożem (ang. hydrophobic interaction
chromatography HIC). Separacja opiera się na odwracalnej interakcji między białkiem i
hydrofobową powierzchnią złoża. Oddziaływanie to jest wzmacniane przez zastosowanie
buforów o wysokiej sile jonowej. Metoda stanowi najczęściej „kolejny krok” stosowany w
procedurze oczyszczania białek po etapie frakcjonowanego wytrącania siarczanem amonu lub
wymywania prób przy wysokich stężeniach soli metodą IEX. W celu zwiększenia wydajności
wiązania białka ze złożem zawierających nawet 1.5M (NH4)2SO4 lub 4M NaCl. Białka
związane wymywane są z kolumny w gradiencie zmniejszającego się stężenia soli np.:
(NH4)2SO4.(Rys.3). Inną metodą elucji jest zmiana polarności eluentu poprzez zastosowanie
gradientu glikolu etylenowego do 50%, dodatek soli chaotropowych (mocznik,
chlorowodorek guanidyny), detergentów lub poprzez zmianę pH buforów.
Rys. 3 Klasyczny schemat elucji gradientowej HIC
Wyjątkową metodą z punktu widzenia specyficzności oddziaływania makromolekuła:
złoże jest chromatografia powinowactwa (ang. affinity chromatography AC). Podstawą
separacji w tej metodzie są specyficzne oddziaływania biologiczne. Funkcja biologiczna
spełniana w komórkach przez większość makrocząsteczek biologicznych, takich jak:
przeciwciała, białka transportowe, białka receptorowe, enzymy, kwasy nukleinowe, jest
rezultatem oddziaływania ze specyficznymi cząsteczkami - ligandami. Połączenie
makrocząsteczki z ligandem i utworzenie kompleksu makrocząsteczka: ligand powoduje
odpowiedź biologiczną. Odpowiedzią taką może być: działanie immunologiczne, kontrola
procesów metabolicznych, działanie hormonów, katalityczne przekształcenie substratu,
transport przez błony biologiczne. Uzyskanie odpowiedzi biologicznej zależy od właściwego
rozpoznania i wiązania ligandu. Do przeprowadzenia chromatografii powinowactwa
niezbędne jest otrzymanie złoża w postaci nierozpuszczalnej fazy stacjonarnej, do której
przyłącza się trwałymi wiązaniami chemicznymi cząsteczki odpowiedniego liganda.
Mieszanina nanoszona na złoże może zawierać wiele typów makrocząsteczek, ale tylko takie,
które rozpoznają specyficzny ligand i wiążą się z nim są zatrzymywane w swym ruchu
wzdłuż kolumny. Po wymyciu makrocząsteczek niezwiązanych ze złożem i przemyciu
kolumny buforem, pożądane makrocząsteczki wymywa się poprzez łagodne rozbicie
kompleksu makromolekuła: ligand. Elucji dokonuje się poprzez zastosowanie czynnika
elucyjnego, który wiąże się z ligandem na złożu lub niespecyficznie poprzez zmianę pH, siły
jonowej lub polarności buforów. Podstawowe etapy oczyszczanie z zastosowaniem AC
przedstawia Rys. 4.
Rys. 4 Typowy profil separacji w AC
Dzięki wykorzystaniu metod AC możliwe jest oczyszczanie białek fuzyjnych,
skonstruowanych tak, aby posiadały w swojej strukturze dodatkowy fragment – domenę,
oddziałującą ze złożem. Białka fuzyjne zawierające domenę oligohistydynową, obejmującą
sześć kolejno po sobie występujących reszt histydynowych, oczyszczane mogą być przy
wykorzystaniu chromatografii metalopowinowactwa. Związane ze złożem jony Ni2+ (lub
innych metali grup przejściowych) kompleksują grupy imidazolowe His. Przykładem złoża
wykorzystywanego do oczyszczania białek, zawierających ogon oligoHis jest IDA-agaroza
(His-Bind Resin, Novagen). Jest to złoże posiadające jako grupy aktywne reszty kwasu
iminodioctowego (Rys. 5). Grupa ta stosunkowo słabo chelatuje jony metali, ponieważ
posiada tylko trzy ligandy zdolne do kompleksowania. Chelatowany jon metalu w geometrii
oktaedrycznej posiada aż trzy wolne miejsca koordynacyjne, które potencjalnie mogą służyć
do wiązania oczyszczanego białka. IDA jest grupą wywierającą niewielki efekt steryczny na
pozostałe wolne miejsca koordynacyjne jonu metalu – w efekcie obniża to selektywność
wiązania oczyszczanych białek.
Rys. 5 Schemat złoża IDA. X - wolne miejsca koordynacyjne jonu metalu zdolne do
kompleksowania z resztami białka; Me – chelatowany przez złoże jon metalu, np. Ni2+
Białka niezwiązane lub słabo związane wymywane są ze złoża przy pomocy buforów
zawierających niskie stężenia imidazolu. Elucji pożądanego białka dokonuje się w gradiencie
wzrastającego stężenia imidazolu, który charakteryzuje się większym powinowactwem do
złoża IDA-agaroza.
Technika AC obok możliwości specyficznego oczyszczenia pożądanej makromolekuły
umożliwia również szybkie usunięcie proteaz serynowych z ekstraktów bezkomórkowych i
stanowi atrakcyjną alternatywę dla zastosowania specyficznych inhibitorów tych enzymów.
Dla specyficznego wiązania m. in. trypsyny, chymotrypsyny oraz ich zymogenów
wykorzystuje się złoża ze
aminobenzamidyną (Rys. 6).
związanym
specyficznym
inhibitorem
proteaz:
p-
Rys. 6 Schemat struktury Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow
(firmy GE HealthCare Life Sciences )
Elucji białek dokonuje się poprzez obniżenie pH buforu, zastosowanie kompetytywnego
eluenta: p-aminobenzamidyny lub buforu zawierającego czynniki denaturujące np.: 8 M
mocznik czy 6 M chlorowodorek guanidyny.
Dotychczas omawiane metody chromatograficzne umożliwiały rozdzielanie substancji na
podstawie różnic w polarności, ładunku lub specyficznych oddziaływań z ligandem. Metoda
filtracji żelowej lub inaczej chromatografii wykluczania (ang. size exclusion chromatography
SEC) wykorzystuje różnice w wielkości cząsteczek. Biocząsteczki posiadają masy
cząsteczkowe od około 100 D do kilku megaD, tak więc jest zrozumiałe, że metoda
umożliwiająca oddzielenie molekuł o masie np. 10 kD od innych o masie 100 kD znalazła
szerokie zastosowanie w biochemii eksperymentalnej. Technikę filtracji żelowej
wykorzystuje się do celów preparatywnych (oczyszczanie białek, kwasów nukleinowych) i
analitycznych (wyznaczanie masy cząsteczkowej, ilościowa analiza oddziaływań
międzycząsteczkowych).
W filtracji żelowej najpowszechniej używa się czterech typów żeli: dekstranowych,
poliakrylamidowych, agarozowych i mieszanych. Historycznie pierwszymi były żele oparte
na naturalnym polisacharydzie - dekstranie. Są one produkowane przez firmę firmy GE
HealthCare Life Sciences pod handlową nazwą Sephadex®.. Poprzez usieciowanie dekstranu
N,N’-metylenobis-akrylamidem możliwe jest otrzymanie żelu o większym zakresie
frakcjonowania. Takie żele są znane pod handlową nazwą Sephacryl. Żele poliakrylamidowe
są wytwarzane w wyniku kopolimeryzacji akrylamidu i N,N’-metylenobisakrylamidu. Są one
produkowane prze firmę BioRad pod nazwą BioGel P®. Żele agarozowe charakteryzują się
dużymi wartościami granicy wykluczenia. Agaroza, naturalny, obojętny polisacharyd będący
składnikiem agaru zbudowany jest z podjednostek galaktozy i anhydrogalaktozy. Struktura
żelu jest stabilizowana wiązaniami wodorowymi oraz w wyniku sieciowania
epichlorohydryną. Żele agarozowe są produkowane przez firmy GE HealthCare Life Sciences
pod nazwą Sepharose® i przez firmę BioRad jako BioGel A®.
Mieszane żele poliakrylamido-agarozowe łączą wysoką rozdzielczość i szeroki zakres
frakcjonowania z dużą sztywnością żelu, umożliwiającą osiągnięcie stosunkowo dużych
wartości natężenia przepływu. Są one wytwarzane m.in. przez firmę Pharmacia Biotech pod
nazwą Superose®. Tabela 5 zawiera właściwości niektórych żeli dostępnych handlowo.
Żele nowej generacji, np. sferoidalne żele kompozytowe agarozowo-dekstranowe, takie jak
Superdex® (firmy GE HealthCare Life Sciences ) umożliwiają osiągnięcie dobrej
rozdzielczości przy natężeniach przepływu do 1 ml/min.
Metodę SEC wykorzystać można do wielu zastosowań. Jednym z nich jest odsalanie
oczyszczanego preparatu (Rys. 7). Sole nieorganiczne, rozpuszczalniki organiczne i inne małe
cząsteczki są powszechnie używane dla oczyszczania makrocząsteczek biologicznych.
Filtracja żelowa jest prostą, tanią i szybką metodą usuwania tych małych cząsteczek z
oczyszczanego preparatu - alternatywną wobec dializy.
Rys. 7 Profil elucji próby odsalanej metodą SEC.
Innym zastosowaniem SEC jest wymiana buforu. Podczas oczyszczania makrocząsteczek
biologicznych często zdarza się, że przejście do następnego etapu wymaga zastąpienia buforu
z etapu poprzedniego przez inny. Operacji tej można łatwo dokonać za pomocą filtracji
żelowej. Małą kolumnę równoważy się nowym buforem, a następnie przepuszcza przez nią
próbkę, dokonując elucji także nowym buforem. Alternatywą dla filtracji żelowej jest w tym
przypadku wyczerpująca dializa lub kilkukrotna ultrafiltracja.
Najpowszechniejszym zastosowaniem filtracji żelowej jest oczyszczanie makrocząsteczek
biologicznych. Dzięki zdolności żeli do frakcjonowania cząsteczek na zasadzie różnic w ich
wymiarach, filtracja żelowa stanowi cenne uzupełnienie technik separacyjnych
wykorzystujących różnice w polarności i ładunku. Dużą zaletą filtracji żelowej jest jej
zachowawczość. Praktycznie nie są znane przypadki denaturacji białek podczas filtracji
żelowej. Należy jedynie pamiętać, że jeżeli dla stabilności danego białka jest wymagana
obecność jakiegoś związku o małej masie cząsteczkowej, to powinien on stanowić składnik
buforu elucyjnego.
Metodę SEC wykorzystuje się również do określania masy cząsteczkowej makrocząsteczek
biologicznych. Objętość elucji danej substancji w filtracji żelowej jest proporcjonalna do
wymiarów geometrycznych cząsteczek tej substancji (Rys. 8).
Rys. 8 Zależność objętości elucji od masy cząsteczkowej makromolekuł.
Filtracja żelowa jest więc powszechnie wykorzystywana dla wyznaczania masy
cząsteczkowej przede wszystkim białek i, w mniejszym stopniu, kwasów nukleinowych. Za
pomocą zestawu białek wzorcowych, o znanych masach cząsteczkowych dokonuje się
kalibracji kolumny żelowej. Następnie roztwór zawierający białko o nieznanej masie
cząsteczkowej poddaje się procesowi chromatograficznemu na wykalibrowanej kolumnie w
warunkach identycznych do tych, które stosowano podczas kalibracji i mierzy objętość elucji.
Masę cząsteczkową badanego białka można wówczas odczytać wprost z krzywej wzorcowej.
Metoda ta jest prosta w wykonaniu, tania, szybka i wystarczająco dokładna. Można jej
używać także do próbek zanieczyszczonych, nawet w obecności innych białek, pod
warunkiem, że dysponujemy metodą selektywnej detekcji badanego białka, np. poprzez
pomiar specyficznej aktywności enzymatycznej. Oczywiście metoda posiada także pewne
ograniczenia. Należy bardzo ostrożnie dobrać odpowiedni żel, tak aby masa cząsteczkowa
badanego białka mieściła się w liniowym zakresie krzywej wzorcowej, pożądana jest zatem
możliwość zgrubnego oszacowania tej wartości. W teorii filtracji żelowej zakłada się, że
wpływ na proces elucji mają tylko efekty steryczne i podziałowe. Jeżeli białko oddziałuje z
żelem w sposób adsorpcyjny lub jonowy, to oddziaływania takie powodują opóźnienie elucji i
zaniżenie eksperymentalnie wyznaczonej masy cząsteczkowej. Zakłada się także, że
cząsteczki białek mają kształt sferyczny, co nie zawsze jest zgodne z prawdą.
Zasada rozdziału substancji metodą SEC oparta jest więc na wykorzystaniu porowatości
wypełnienia kolumny. Wypełnienia te przygotowuje się z materiałów nieorganicznych lub
organicznych wyprodukowanych w ten sposób, że podczas procesu technologicznego w
materiale tworzą się liczne mikroskopijne kanaliki lub pory o kontrolowanej wielkości.. Gdy
gęsta zawiesina takiego złoża w buforze tworzy wypełnienie kolumny, całkowitą objętość
utworzonego wypełnienia można wyrazić wzorem:
Vt = V0 + Vm + Vi ,
gdzie:
V0 - objętość cieczy poza złożem ( tzw. objętość martwa)
Vm - objętość samego żelu
Vi - objętość cieczy zawartej w porach żelu
Cząsteczki substancji znajdujących się w roztworze naniesionym na kolumnę ulegają
podziałowi pomiędzy fazy V0 i Vi ze specyficznym dla każdej substancji współczynnikiem
podziału Kd, zależnym od wielkości cząsteczek substancji rozpuszczonej. Małe cząsteczki
wnikają do porów i są w ten sposób relatywnie zatrzymywane w stosunku do molekuł dużych,
które przechodzą swobodnie pomiędzy ziarnami złoża.
Uwzględniając współczynnik Kd można zapisać:
Ve = V0 + Kd x Vi, lub Kd = (Ve - V0)/Vi,
gdzie Ve jest objętością elucji substancji. Gdy zdefiniujemy retencję R jako V0/Ve, to:
R = V0/(V0 + Kd x Vi)
Prawie wszystkie objętości ujęte w powyższych równaniach mogą być zmierzone
eksperymentalnie. V0 wyznacza się przepuszczając przez kolumnę substancję o masie
cząsteczkowej tak dużej, że nie wnika w ogóle do porów i kanalików żelu. W tym celu
najpowszechniej stosuje się tzw. Blue Dextran - polisacharyd, do którego kowalencyjnie
przyłączono molekuły barwnika Cibaron Blue. Blue Dextran ma masę cząsteczkową około 2
6
x 10 D. Vi można wyznaczyć przepuszczając przez kolumnę substancję barwną o bardzo
małej masie cząsteczkowej, Vt natomiast oblicza się bezpośrednio z wymiarów
geometrycznych kolumny. Pozostającą objętość Vm często pomija się jako dużo mniejszą od
pozostałych.
W filtracji żelowej istnieje bezpośrednia zależność pomiędzy objętością elucji a wymiarami
geometrycznymi cząsteczek substancji chromatografowanej. Dla większości substancji
wymiar geometryczny jest z kolei skorelowany z masą cząsteczkową. Empiryczny opis tej
korelacji jest dany równaniem:
Ve = A + B log MWs,
gdzie A i B są stałymi charakterystycznymi dla danej kolumny upakowanej określonym
złożem. Wykreślając Ve w funkcji log MWs otrzymuje się najczęściej wykres liniowy,
przynajmniej w pewnym zakresie mas cząsteczkowych, charakterystycznym dla danego
rodzaju żelu. Równanie stanowi dla eksperymentatora stosunkowo godną zaufania podstawę
dla wyznaczania mas cząsteczkowych, pod warunkiem, że dostępne są substancje wzorcowe markery - o znanych MWs dla wykalibrowania kolumny. Tylko w ten sposób można
wyznaczyć parametry A i B.
1.4. Eksperymenty
Eksperyment 1. Oczyszczanie białka fuzyjnego z domeną His-tag z wykorzystaniem
minikolumny HisTrapFF
Minikolumna HisTrapFF pozwala na oczyszczanie białka fuzyjnego, zawierającego domenę
oligohistydynową, obejmującą sześć kolejno po sobie występujących reszt histydynowych.
Związane ze złożem jony Ni2+ są kompleksowane przez reszty imidazolowe reszt His co
skutkuje związaniem białka fuzyjnego ze złożem. Ekstrakt bezkomórkowy, powstały w
wyniku sonifikacji komórek nadprodukujących białko fuzyjne i odwirowaniu fragmentów
stałych jest w eksperymencie nanoszony na złoże kolumny HisTrapFF. W kolejnym etapie
następuje wymycie białek niezwiązanych oraz elucja właściwego białka w gradiencie
imidazolu.
Materiały
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Ekstrakt bezkomórkowy (EB)
Bufor do nanoszenia zawierający 5 mM imidazolu
Bufor elucyjny zawierający 500mM imodazol
Minikolumna HisTrapFF
Zestaw AKTA FPLC
Kolektor frakcji
Wykonanie eksperymentu
1. Zrównoważyć kolumnę buforem do nanoszenia (dwie objętości kolumny)
2. Nanieść 2 ml EB
3. Wymyć białka niezwiązane buforem do nanoszenia (dwie objętości kolumny)
4. Dokonać elucji białka związanego z wypełnieniem kolumny przy pomicy rozdziału
buforu elucyjnego.
5. Na podstawie obrazu chromatogramu zebrać i oznaczyć właściwe frakcje.
6. Dokonać pomiaru stężenia białka w ekstrakcie bezkomórkowym oraz w zebranej
frakcji, wyznaczyć całkowitą ilość białka w obu frakcjach i określić procentową
zawartość białka fuzyjnego w EB.
Eksperyment 2. Wyznaczenie masy cząsteczkowej białka metodą filtracji żelowej
Kolumna SuperdexTM 200 pozwala na oszacowanie mas cząsteczkowych białek w zakresie
10-600 kDa. W celu dokonania rozdziału, zagęszczony preparat białka, uzyskany w procesie
oczyszczania jest w eksperymencie nanoszony na kolumnę Superdex 200. Stężenie
nanoszonego białka powinno mieścić się w zakresie 1- 2 mg/ml. Przed naniesieniem próby na
aparaturę, kolumnę równoważy się wcześniej przygotowanym 20mM buforem fosforanowym
o pH=7 z dodatkiem 0.15M NaCl.
Materiały
Uwaga: wszystkie bufory muszą być odgazowane przed użyciem. Można to zrobić poprzez
wygotowanie lub przy użyciu pompy próżniowej.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Kolumna SuperdexTM 200
Bufor elucyjny: 20mM bufor fosforanowy 0.15M NaCl pH 7.0
Próbka nieznanego białka o stężeniu 1-2mg/ml w buforze elucyjnym
System AKTA FPLC z detektorem UV280 oraz kolektorem frakcji
probówki szklane
kolorymetr (np. Spekol 11)
odczynniki do oznaczania stężenia białka
Wykonanie eksperymentu
1.
2.
3.
4.
5.
Zrównoważyć kolumnę buforem elucyjnym (dwie objętości kolumny).
Nanieść 0.5 ml zagęszczonej próby białka.
Wymyć białko buforem elucyjnym przy prędkości 0.5ml/min.
Na podstawie obrazu chromatogramu zebrać i oznaczyć właściwe frakcje.
Wykorzystując poniższe dane sporządzić wykres Ve jako funkcji log MWs dla
podanych białek
6. Na podstawie uzyskanej wartości Ve badanego białka i dostępnych danych
wyznaczyć jego masę cząsteczkową.
7. Porównać wyznaczone eksperymentalnie masy cząsteczkowe z danymi literaturowymi
podanymi przez prowadzącego ćwiczenie dla nieznanego białka. Podać przyczyny
ewentualnego błędu oznaczenia.
Cytochrom C
Anhydraza węglanowa
BSA
Dehydrogenaza alkoholowa
β-amylaza
M [kDa]
12.4
29
66
150
200
Ve [ml]
17.48
16.48
14.02
13.14
12.1
Objętości elucji i masy cząsteczkowe białek wzorcowych
Download
Random flashcards
66+6+6+

2 Cards basiek49

Prace Magisterskie

2 Cards Pisanie PRAC

słowka

2 Cards kksenia.kot1997

Create flashcards