Reakcja PCR

PCR
Aleksandra Sałagacka
Reakcja PCR
• naśladuje proces replikacji DNA in vitro
• pozwala na amplifikację określonego krótkiego
(kilkadziesiąt – kilka tys.pz) fragmentu DNA
• obecnie najważniejsze narzędzie biologii
molekularnej
Polymerase Chain Reaction
Polimerazowa reakcja łańcuchowa
Łańcuchowa reakcja polimerazy
• produkt powstały w jednym cyklu reakcji zostaje użyty
jako matryca w następnych cyklach
– reakcja łańcuchowa
• reakcja katalizowana przez polimerazę DNA
Cechy reakcji PCR
• szybkość
– kilka godz.
• wydajność
– 106 – 109 kopii
• selektywność
– powielana jest tylko wybrana
sekwencja
• czułość
– możliwe powielenie
pojedynczej cząsteczki DNA
ryzyko kontaminacji!!!
• prostota wykonania
Kary Mullis
• opracował metodę PCR
1993 r.– Nagroda Nobla z chemii
Składniki reakcji PCR
• polimeraza DNA – katalizuje reakcję
• bufor
– zapewnia odpowiednie środowisko reakcji
(pH, siła jonowa)
• Mg2+
– kofaktor polimerazy DNA
• dNTP
– substraty do budowy nowych nici DNA
• DNA
– matryca do budowy nowych nici
• startery
– wyznaczają miejsce amplifikacji
Polimeraza DNA
• termostabilna
– polimeraza Taq
Thermus aquaticus
• od syntezy nowej nici DNA wymaga istniejącej już
nici – matrycowe DNA
• może wydłużać jedynie istniejący już fragment DNA –
starter (primer)
Startery (primers)
• oligonukleotydy o dł. 15-30 pz
• syntetyzowane chemicznie
• komplementarne do sekwencji otaczających
(flankujacych) powielany region
– konieczna znajomość tych sekwencji do
zaprojektowania starterów !
• zapewniają selektywność reakcji PCR
• dostarczają wolny koniec 3’ do syntezy nowych nici
przez polimerazę DNA
dNTPs
• trifosforany wszystkich czterech
deoksyrybonukleozydów:
dATP, dCTP, dGTP, dTTP
• substraty do syntezy nowych nici DNA
NH2
N
N
O
-
O P
O
-
O
O
P
-
O
O
O P
O
N
N
O
O
HO
Etapy reakcji PCR
denaturacja
matrycowego
DNA
25-40x
wydłużanie
(elongacja)
starterów –
budowa nowych
nici DNA
przyłączanie
(annealing)
starterów do nici
matrycowych
Denaturacja – 92-96ºC
Pod wpływem wysokiej temperatury (92-96ºC) dochodzi do
rozerwania wiązań wodorowych między komplementarnymi
zasadami dsDNA
Annealing – 45-65ºC
Startery hybrydyzują z sekwencjami komplementarnymi na
końcach 3’ powielanego fragmentu DNA.
Elongacja – 72ºC
Polimeraza dobudowuje kolejne nukleotydy do starterów – następuje
synteza nici komlementarnych do nici matrycowej.
Kierunek syntezy: 5’→ 3’
94°
94°
72°
55°
72°
55°
72°
55°
jeden cykl
• kolejne etapy reakcji PCR wyznaczane są przez zmianę
temperatury
• termocykler
Teoretycznie, w n cyklach z jednej cząsteczki
powstaje jej 2n kopii.
Wizualizacja produktu reakcji PCR
• elekroforeza w żelu agarozowym, poliakrylamidowym
z użyciem barwników: bromek etydyny, sole srebra
Optymalizacja PCR
• potencjalnie wiele zmiennych
• każda para starterów musi być optymalizowana
Zwykle optymalizacji wymagają:
– stężenia
• Mg2+
parametry
• starterów
krytyczne
• matrycy
– temperatura annealingu
– czas wydłużania
Stężenie Mg2+
• jony magnezowe – kofaktor polimerazy DNA
→ wpływ na aktywność enzymatyczną
• stężenie zbyt niskie → słaby produkt lub brak
produktu
• steżenie zbyt wysokie → niespecyficzne produkty
Tepreatura annealingu
odpowiednia
3´
5´
3´
5´
zbyt wysoka
3´
zbyt niska
5´
3´
3´
5´
5´
5´
5´
3´
5´
brak przyłaczania
→ brak produktu
5´
3´
3´
5´
3´
3´
przyłaczanie niespecyficzne
→ niespecyficzne produkty
Modyfikacje PCR
Modyfikacje PCR
·AFLP
·Alu-PCR
·AS-PCR
·Asymmetric PCR
·Colony PCR
·DD-PCR
·Degenerate PCR
·Hot-start PCR
·Inverse PCR
·In situ PCR
·Long-PCR
·Methylation Specific PCR
·Multiplex PCR
·Nested PCR
·PCR-ELISA
·PCR-RFLP
·PCR-SSCP
·QC-PCR
·RACE-PCR
·RAPD
·Real-Time PCR
·Rep-PCR
·RT-PCR
·Touchdown PCR
Gniazdowy PCR (nested PCR)
• dwie różne pary starterów – „zewnętrzne” i
„wewnętrzne”
• dwie reakcje PCR: pierwsza ze starterami
„zewnętrznymi”, druga ze starterami „wewnętrznymi”
• produkt pierwszej reakcji stanowi matrycę w reakcji
drugiej
• sekwencja powielana przy użyciu starterów
„wewnętrznych” leży w obrębie sekwencji
powielanej przy użyciu starterów „zewnętrznych”
• zwiększona czułość i swoistość reakcji
Multiplex PCR
• jedna reakcja PCR
• więcej niż jedna para starterów
• jednoczesne powielanie więcej niż jednej sekwencji,
np.:
– dwóch różnych genów,
– kilku różnych fragmentów tego samego genu
• szybkie analizowanie dużych obszarów DNA –
oszczędność czasu i pracy
• reakcje z tzw. wzorcem wewnętrznym
– poza wybranym fragmentem DNA powielany jest matryca
standardowa – możliwość kontrolowania poprawności przebiegu
reakcji i porównawczych analiz ilościowych
Reverse Transcription - PCR
• PCR poprzedzona reakcją odwrotnej transkrypcji (RT)
• odwrotna transkrypcja – przepisanie sekwencji mRNA
na tzw. komplementarne DNA (cDNA)
– starter
• oligo-dT
• starter specyficzny dla wybranego mRNA
• 6-ciomery tzw. Random Hexamer Primers (RH)
– odwrotna transkryprtaza
• ocena ekspresji genów (jakościowa lub półilościowa)
R
T
P
C
R
Metody wykrywania mutacji
niezdefiniowanych
PCR-SSCP
• Single strand conformation polymorphism
– polimorfizm konformacji fragmentów
jednoniciowych
• ssDNA przyjmuje w warunkach niedenaturujących
unikalną strukturę drugo- i trzeciorzędową
• konformacja ta jest zależna od sekwencji nukleotydowej
• różne konformery różnią się ruchliwością elektroforetyczna
• pojedyncze różnice w sekwencji, wywołane mutacją punktową
powodują zróżnicowaną migrację i charakterystyczne położenie
w żelu poliakrylamidowym.
PCR-SSCP – etapy:
1) reakcja PCR – powielenie badanego fragmentu
DNA
1) denaturacja dsDNA (silna zasada, formamid,
wysoka temp.) - powstają ssDNA
1) elektroforeza żelowa ssDNA w warunkach
niedenaturujących
1) wykrywanie konformerów pojedynczych nici w
żelu (np. wybarwienie bromkiem etydyny)
PCR-HDA
• Heteroduplex analysis - analiza heterodupleksów
• ssDNA, powstałe w procesie denaturacji dsDNA, podczas powolnej
renaturacji łaczą się przypadkowo w struktury dwuniciowe, tzw.
dupleksy
• możliwe jest łączenie się nici w pełni do siebie komplementarnych
(homodupleksy), jak i nie (hereodupleksy)
– homozygoty – homodupleksy
– heterozygoty – hetero- i homodupleksy
• heterodupleksy posiadają mniejszą ruchliwość elektroforetyczną
(rozluźnienie struktury w miejscu niepełnego sparowania)
HDA – etapy:
1)
reakcja PCR – powielenie badanego fragmentu
DNA
1)
denaturacja dsDNA (wysoka temp.) – powstają
ssDNA
1)
renaturacja ssDNA – łączenie ssDNA w homoi/lub heterodupleksy
1)
elektroforeza dupleksów w żelu
poliakrylamidowym
1)
wykrywanie dupleksów w żelu (np. wybarwienie
bromkiem etydyny)
PCR-CMC
• Chemical mismatch cleavage – chemiczne
rozszczepianie niesparowanych heterodupleksów
• podobnie jak HDA wykorzystuje zjawisko powstawania
heterodupleksów
• niesparowane zasady w heterodupleksach poddaje się
modyfikacji chemicznej
(cytozyna – hydroksylamina, tymina – czterotlenek osmu)
• zmodyfikowane cząsteczki DNA ulegają przecięciu pod
wpływem piperydyny → zmiany w obrazie elektroforetycznym
PCR-DGGE
• Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
- elektroforeza w żelu z gradientem czynnika
denaturującego
• dsDNA ulega denaturacji przy różnych stężeniach związków
denaturujących w zależności od składu zasad i sekwencji
nukleotydowej
– zw. denaturujace: formamid, mocznik, chlorowodorek guanidyny
• produkty PCR o rożnej sekwencji będą w rożnych miejscach żelu
ulegać denaturacji → zmiany w obrazie elektroforetycznym
• jeśli czynnikiem denaturującym jest temperatura – PCR-TGGE
Metody wykrywania mutacji
zdefiniowanych
PCR-RFLP
•
Restriction Fragment Length Polymorphism
– polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych
•
mutacja powoduje powstanie lub zanik miejsca
rozpoznawanego przez określony enzym restrykcyjny
→ zmiana w obrazie elektroforetycznym po
trawieniu e. restrykcyjnym
(zmiana liczby i długości fragmentów DNA)
PCR-RFLP – etapy:
1)
reakcja PCR – powielenie badanego fragmentu
DNA
1)
trawienie produktu PCR enzymem restrykcyjnym
1)
elektroforeza produktu reakcji trawienia
1)
ocena wzoru prążkowego
Allele Specific PCR (AS-PCR)
• dwie równoległe reakcje PCR dla tej samej próby badanej
• jeden starter wspólny dla obu reakcji
• drugi starter swoisty dla sekwencji zmutowanej lub
niezmutowanej – komplementarny do sekwencji, w której
możliwa jest zmiana mutacyjna
•ocena mutacji – obecność/braku produktu w obydwu
reakcjach PCR
PCR-ASO
• Allele specific oligonucleotide – hybrydyzacja z
allelowo-specyficznymi sondami oligonukleotydowymi
• sondy – znakowane oligonukleotydy (fluorescencyjnie,
izotopowo)
• dwie sondy - jedna komplementarna do allela dzikiego,
druga do allela zmutowanego
PCR-ASO – etapy:
1) reakcja PCR – powielenie badanego fragmentu DNA
1) naniesienie produktu PCR na membrany nylonowe
1) naniesienie sond na membrany
1) hybrydyzacja sondy-produkt PCR
1) detekcja sygnałów do shybrydyzowanych sond
– ocena genotypu