Ćwiczenie III

Ćwiczenie IV
1. Wybrane markery genetyczne
2. Rozdział agarozowy produktów reakcji RAPD
3. Trawienie produktów reakcji PCR (MWG2230) enzymem restrykcyjnym BsuRI
Marker genetyczny - dowolna, genetycznie kontrolowana cecha fenotypowa lub też dowolna różnica
genetyczna wykorzystywana dla ujawnienia polimorfizmu osobniczego.
Polimorfizm - całokształt różnic występujących między poszczególnymi gatunkami, odmianami,
osobnikami, a także komórkami organizmu, które mogą być ujawniane za pomocą odpowiednio
dobranego systemu markerowego.
Początkowo do analizy zmienności organizmów stosowano markery morfologiczne, czyli cechy
fenotypowe tzn. przejawiające się w wyglądzie zewnętrznym. Następnie wprowadzono markery
cytologiczne bazujące na obserwacji cechy morfologicznych chromosomów. Analiza polimorfizmu
polipeptydów przyczyniła się do pojawienia się pierwszych markerów molekularnych: izoenzymów,
białek strukturalnych i zapasowych.
Obecnie, najczęściej stosuje się markery DNA ujawniające zmienność sekwencji nukleotydowej
zarówno w rejonach kodujących, jak i niekodujących.
Wady markerów morfologicznych, cytologicznych i białkowych:
- ograniczona ilość,
- zależność od modyfikującego wpływu środowiska,
- często złożone podłoże genetyczne,
- trudności w rozróżnianiu homozygoty od heterozygoty.
Dobre markery genetyczne powinny charakteryzować się:
- wysokim polimorfizmem
- kodominującym charakterem dziedziczenia (polega na zdolności markera do wykrywania stanu
heterozygotycznego, tzn. poszczególnym allelom z jednego locus odpowiadają markery o odmiennej
ruchliwości w żelu)
- niezależnością od fazy rozwojowej oraz modyfikującego wpływu środowiska
- wysoką powtarzalnością i wiarygodnością
- prostą i szybką metodą identyfikacji
MARKERY DNA - to określonej długości fragmenty DNA uzyskiwane w formie prążków na żelach lub
membranach będące efektem końcowym reakcji enzymatycznych (trawienia restrykcyjnego i/lub
amplifikacji) bądź hybrydyzacji.
Ze względu na sposób identyfikacji markera wyróżniamy:
- markery będące efektem hybrydyzacji (bez zwiększania początkowej ilości matrycowego DNA)
- markery powstające w wyniku reakcji PCR
- markery powstające w wyniku połączenia technik
Wybrane systemy markerowe:
RFLP Restriction fragment length polymorphism
RAPD Random amplified polymorphic DNA
ISSR Inter Simple Sequence Repeats
AFLP Amplified fragment length polymorphism
SSR
Simple sequence repeats
SNP
Single nucleotide polymorphism
CAPS Cleaved amplified polymorphic sequence
1
RFLP — (ang. restriction fragment length polymorphism)
polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych
Technika RFLP przebiega w następujących etapach:
1. trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi
2. rozdział produktów trawienia na żelu agarozowym
3. transfer rozdzielonych fragmentów DNA na membranę
4. związanie DNA z membraną
5. hybrydyzacja DNA ze specyficzną sondą znakowaną radioaktywnie lub fluorescencyjnie
(sondy - zwykle DNA lub cDNA o wielkości 300–500 pz)
6. wizualizacja polimorfizmu sygnałów hybrydyzacyjnych (autoradiografia lub fluorescencja)
Polimorfizm identyfikowany metodą RFLP jest wynikiem delecji, insercji np. pojedynczego
nukleotydu lub też metylacji DNA, a w efekcie utraty bądź też pojawienia się miejsca restrykcyjnego w
obrębie lub w bliskiej odległości od sekwencji rozpoznawanej przez sondę.
Zaletami tej metody są: kodominujący charakter dziedziczenia markerów RFLP, wysoka
częstotliwość wykrywanego polimorfizmu oraz bardzo duża wiarygodność.
Metoda ta wymaga dużej ilości DNA niezbędnego do trawienia restrykcyjnego, jest
pracochłonna i droga.
MARKERY losowe
RAPD — (ang. random amplified polymorphic DNA)
losowo amplifikowany polimorficzny DNA
ISSR — (ang. inter simple sequence repeats)
polimorfizm sekwencji międzymikrosatelitarnych
RAPD to system markerowy bazujący na reakcji PCR z zastosowaniem startera o przypadkowej
sekwencji i długości 9–11 pz. Każdy taki starter hybrydyzując do matrycy DNA, zapoczątkowuje
amplifikację w wielu rejonach genomu jednocześnie. Produkty amplifikacji rozdziela się na żelu
agarozowym, a ich detekcja odbywa się z użyciem bromku etydyny. Metoda jest szybsza, wydajniejsza
i mniej pracochłonna niż RFLP. Wymaga również znacznie mniejszych ilości DNA, ponieważ jest on
powielany w kolejnych rundach amplifikacji.
Markery RAPD wykazują dominujący charakter dziedziczenia.
Cechy charakterystyczne metody RAPD:
- niska temperatura przyłączania startera (około 34-38 stC)
- duża wrażliwość na zmienne warunki reakcji PCR (składniki, warunki cyklu temperaturowego)
- krótkie startery około 10 pz
Markery ISSR umożliwia identyfikację polimorfizmu długości obszarów DNA, zawartych pomiędzy
przeciwlegle skierowanymi, identycznymi sekwencjami mikrosatelitarnymi (sekwencje mikrosatelitarne
to wielokrotne powtórzenia krótkich motywów nukleotydowych o długości od 1 do 6 pz).
W reakcji ISSR stosowane są startery o długości 16–18 pz odpowiadające motywom
mikrosatelitarnym, które posiadają kilka selektywnych nukleotydów na końcu 3’ lub 5’. Podczas reakcji
powstaje od 10 do 60 produktów wielkości 200-2000 pz, które poddaje się rozdziałowi na żelu
agarozowym lub poliakrylamidowym oraz wizualizacji. Źródłem polimorfizmu są mutacje w miejscu
przyłączenia startera lub w obrębie powielonego fragmentu DNA. ISSR jest bardzo popularna ze
względu na prostotę tej techniki, porównywalną z RAPD. Jednak w przeciwieństwie do RAPD, ISSR
cechuje bardzo wysoka powtarzalność wyników oraz znaczny polimorfizm. Markery ISSR i RAPD
wykazują zwykle dominujący charakter dziedziczenia.
2
MARKERY BAZUJĄCE NA REAKCJI PCR Z ZASTOSOWANIEM SPECYFICZNYCH STARTERÓW
SSR — (ang. simple sequence repeats) = mikrosatelity = proste powtórzenia tandemowe (STR)
SSR opiera się na analizie sekwencji mikrosatelitarnych DNA, składających się z powtarzalnego
motywu długości 1–6 nukleotydów. Liczba powtórzeń wynosi 10–50, a wielkość markera
mikrosatelitarnego zwykle zawiera się w granicach 100-400 pz. W zależności od liczby powtórzeń
motywu amplifikowane są odcinki DNA o różnej długości, rozdzielane następnie na żelu
poliakryloamidowym. Różne allele tego samego locus mogą mieć zmienną liczbę powtórzeń elementu
podstawowego (np. u 5 różnych genotypów może występować 10 różnych alleli w tym samym locus)
Zaletą markerów SSR jest wysoki polimorfizm oraz kodominacyjny sposób dziedziczenia.
SNP — (ang. single nucleotide polymorphism)
polimorfizm pojedynczych nukleotydów
SNP różnice w pojedynczym nukleotydzie w obrębie badanej sekwencji DNA. Jest wiele metod
wykrywania różnic punktowych (sekwencjonowanie produktów PCR, minisekwencjonowanie,
pyrosekwencjonowanie, analiza heterodupleksów, analiza CAPS).
CAPS — (ang. cleaved amplified polymorphic sequence )
polimorfizm trawionych amplifikowanych sekwencji
Technika CAPS polega na wykrywaniu mutacji punktowej w sekwencji uzyskanej po reakcji PCR przy
wykorzystaniu trawienia enzymem restrykcyjnym. Metoda CAPS alternatywnie określana jest jako
PCR-RFLP.
System CAPS służy do identyfikacji zmienności w sekwencji DNA, gdy amplifikowane fragmenty DNA
nie dają się zróżnicować pod względem długości. Pozwala to na wykrycie osobników
heterozygotycznych i homozygotycznych, tak więc markery CAPS dziedziczą się kodominacyjnie.
MARKERY BAZUJĄCE NA REAKCJI PCR I TRAWIENIU RESTRYKCYJNYM
AFLP — (ang. amplified fragment length polymorphism)
polimorfizm długości amplifikowanego fragmentu
AFLP to technika polega na:
1) trawieniu matrycowego DNA enzymami restrykcyjnymi,
2) ligacji adaptorów,
3) preamplifikacji (PCR nieselektywny)
4) amplifikacji selektywnej
5) rozdział produktów na żelu poliakryloamidowym
Enzymy trawiące są dobrane w ten sposób, że jeden rozpoznaje liczne miejsca trawienia w obrębie
DNA (4pz), natomiast drugi trawi DNA w małej liczbie miejsc (6pz). Kombinacja dwóch enzymów
restrykcyjnych umożliwia uzyskanie tzw. lepkich końców, które są niezbędne do połączenia produktów
trawienia z oligonukleotydowymi (20-30 nt.) odcinkami tzw. adaptorami. Po ligacji adaptorów przy
udziale ligazy prowadzona jest reakcja preamplifikacji z zastosowaniem starterów komplementarnych
do adaptora i miejsca restrykcyjnego, posiadających na końcu 3’ selektywny nukleotyd. Po reakcji
amplifikacji niespecyficznej prowadzi się amplifikację specyficzną z użyciem starterów, które na końcu
3’ posiadają 2–4 nukleotydy selektywne zachodzące na sekwencję genomowego DNA w czasie
przyłączania starterów. Rozdział produktów PCR następuje na żelu poliakryloamidowym, a detekcja
poprzez barwienie srebrem bądź autoradiograficznie. Metodę tą charakteryzuje bardzo wysoki
polimorfizm. Niekiedy możliwe jest rozróżnienie homozygot i heterozygot, poprzez ocenę
intensywności prążka.
3
1) TRAWIENIE PRODUKTU PCR ENZYMEM RESTRYKCYJNYM
Na lodzie
1.
Przygotować i opisać 1 probówkę 0,2 ml dla każdej próbki PCR (mwg2230), odpipetować 5ul
produktu PCR na spód probówki nie dotykając ścianek.
2.
Opisać probówkę 0,2 ml na mix do trawienia. W grupach obliczyć ilości składników potrzebne
do strawienia określonej liczby próbek (+ 1 próbka lub 5% więcej miksu na rozpipetowanie).
Przygotować mieszaninę zgodnie z poniższą tabelą
składnik
R+ bufor (X) (2)
Enzym BsuRI (3)
PCR-DNA
Woda (1)
vol
Na 1
St0 StK
reakcji
rozcien próbkę Na … próbek
10
1
10
0,1
1
10
2
10
0,2
0,2
10
50
10
5
5 /w probówce
1
10
0
3,8
3.
Mix wymieszać przez pipetowanie i rozpipetować do końcowej objętości reakcji = 10 uL (na
bok probówki, pipeta pod kątem 45 stopni, 2 mm od górnej krawędzi otworu probówki, do
pierwszego oporu)
4.
Zwirować krótko i wstawić na termocykler uruchomić cykl TRAW.
2) ROZDZIAŁ AGAROZOWY PRODUKTÓW REAKCJI RAPD
2.a. Przygotowywanie żelu agarozowego
Objętość żelu:
Ilość agarozy na żel 1,5%
Ilość agarozy na żel 3.0%
Ilość buforu TBE 1X
Ilość roztworu EtBr 2%
150 ml
2.25
4.5
do 150 ml
1,5 L
UWAGA: praca z EtBr; stosować środki ochrony indywidualnej.
1.
odważyć w zlewce odpowiednią ilość agarozy;
2.
zalać buforem TBE 1X do odpowiedniej objętości;
3.
rozmieszać agarozę na mieszadle magnetycznym do uzyskania jednorodnego roztworu bez
bryłek agarozy,
4.
przykryć zlewkę lub kolbkę folią plastykową odporną na działanie mikrofali
5.
podgrzać w mikrofalówce do zagotowania
UWAGA: roztwór nie może wykipieć z naczynia, gotować i przenosić ostrożnie,
po zagotowaniu używać do przenoszenia chwytaka; Nie wstrząsać gwałtownie grozi poparzeniem
6.
schłodzić roztwór agarozy w zlewce z zimną wodą na mieszadle magnetycznym pod
przykryciem. W tym czasie przygotować stanowisko do wylania żelu.
7.
po wystygnięciu roztworu do temperatury 60 C dodać do niego POD WYCIĄGIEM bromku
etydyny z zachowaniem szczególnych środków ostrożności. UWAGA: końcówkę po dodaniu EtBr
należy wrzucić do specjalnego zamykanego pojemnika na odpady niebezpieczne. Po dodaniu
bromku naczynie przykryć szczelnie folią i wymieszać na mieszadle magnetycznym.
8.
wylać żel do przygotowanego korytka. Umyć na świeżo zlewkę i mieszadło.
2b. Nakładanie próbek na żel agarozowy
1) Do probówek dodać 2,5 uL buforu do ładowania na agarozie, próbki krótko zwirować.
2) Przygotować listę próbek, ustawić probówki w kolumnach na statywie zgodnie z listą, najpierw
produkty RAPD, produkty STS (mwg2230) przed trawieniem, produkty STS trawione.
3) poszczególne osoby ładują swoje próbki
4) uruchamiamy elektroforezę, sprawdzamy.
4
5) czas rozdziału 1,5 h.
6) zdjęcie
7) analiza obrazu
2c. Analiza obrazu
Uzyskany obraz prążkowy produktów RAPD przepisujemy na matrycę 0-1, gdzie 0 oznacza brak prążka
o określonej wielkości, natomiast 1 oznacza obecność prążka. Obecność prążków odczytujemy
równocześnie dla całego zestawu porównywanych genotypów (w grupach). Określamy orientacyjną
wielkość prążka na podstawie porównania z markerem wielkości.
Prążek\genotyp
1) ……… pz
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
2) ……… pz
3) ……… pz
4) ……… pz
Matrycę binarną można wykorzystywać m.in. do:
- obliczania wzajemnych podobieństw genetycznych,
- do badania związku genotyp-fenotyp,
- do poszukiwania markerów genetycznych danej cechy fenotypowej
Interpretacja obrazu prążkowego produktów markera mwg2230. Produkt nietrawiony 300 pz. Po
trawieniu mogą występować prążki o wielkości 260 lub 200 pz. Równoczesne występowanie obu
prążków świadczy o heterozygotyczności testowanego genotypu. Obecność produktu 200 pz świadczy
o niższej mrozoodporności odmiany (efekt do 30%)
3. Nastawienie reakcji PCR: marker SSR Bmag353
STS
składnik
Fermentas bufor (X)
starter_L (uM)
starter_R (uM)
MgCl2 (mM)
dNTP (uM)
Fermentas Taq
DNA
Woda MQ
Startery:
Cykl: SSR58B
St0
10
10
10
25
2000
1
10
1
StK
1
0,25
0,25
2,5
250
0,6
30
objętość
Ilość
reakcji
składnika na
Dil. rate 1 próbkę
(L)
15
0,1
1,5
15
0,03
0,38
15
0,025
0,38
15
0,1
1,5
15
0,1
1,88
15
0,6
15
3,0
15
5,78
5
4. Obliczenia podobieństwa genetycznego
Hipotetyczne dane
Prążek\genotyp
G1
1) ……… pz
0
G2
0
G3
0
G4
1
2) ……… pz
1
0
1
1
3) ……… pz
0
1
1
1
4) ……… pz
1
1
0
1
5) ……… pz
1
1
1
1
6) ……… pz
0
1
1
1
7) ……… pz
1
1
0
0
8) ……… pz
1
1
1
0
Zapis liczbowy dla dwóch porównywanych genotypów x i y
n11 = liczba prążków typu x=1 i y=1
n00 = liczba prążków typu x=0 i y=0
n01 = liczba prążków typu x=0 i y=1
n10 = liczba prążków typu x=1 i y=0
Dla każdej pary genotypów określić podobieństwo Dice’a wg wzoru:
2*n11/((2*n11)+n01+n10) – Dice
Wypełnij tabelę wartościami podobieństw Dice’a
Prążek\genotyp
G1
G2
G3
G4
G1
1
G2
G3
G4
1
-
-
1
1
Grupowanie genotypów lub populacji. Analiza skupień np. metody średnich połączeń
(UPGMA)
Algorytm UPGMA
1) Wyszukaj w matrycy pary obiektów (i,j) które są do siebie najbardziej podobne (lub najmniej
zróżnicowane)
2) Połącz te obiekty w nowe skupienie (cluster)
3) Uaktualnij matrycę, tak żeby oddać utratę pary obiektów (i,j), które zostały połączone i uzupełnij ją
o „nowy” obiekt utworzony przez cluster. Należy wykonać obliczenia podobieństw lub zróżnicowań
pomiędzy istniejącymi obiektami i powstałym skupieniem.
4) Jeśli rozmiar matrycy jest większy niż 2x2 wróć do punktu 1, w przeciwnym razie zakończ.
Odległości pomiędzy skupieniami w metodzie UPGMA:
S(G1,G2),G3 = (SG1G3 + SG2G3)/2
Testowanie istotności dendrogramu
Metoda „bootstrap”
polega na tworzeniu nowych danych poprzez pobieranie próby N cech losowo z zastępowaniem.
Wynikowy zestaw danych ma taką samą wielkość jak dane wejściowe, lecz niektóre cechy zostały
opuszczone a niektóre podwojone. Losowa zmienność wyników jest uzyskiwana po przeanalizowaniu
wielu (100-2000) matryc danych uzyskanych w wyniku „bootstrap”. To robią programy (np. Winboot,
Phylip) – bez analizy istotności dendrogramu nie wolno wnioskować o podobieństwie badanych
genotypów.
6
Ćwiczenie V
ROZDZIAŁ PRODUKTÓW AMPLIFIKACJI NA ŻELU POLIAKRYLAMIDOWYM I BARWIENIE
SREBREM
1. Przygotowania zdenaturowanego żelu poliakrylamidowego oraz barwienie DNA
srebrem
2. Przygotowanie żelu poliakrylamidowego i elektroforeza markera
mikrosatelitarnego.
Żel poliakryoamidowy powstaje w efekcie polimeryzacji monomerów akryloamidowych w długie
łańcuchy, które są następnie łączone kowalencyjnie przez N,N’-metyleno-bisakrylamid. Polimeryzacja
żelu poliakryloamidowego jest inicjowana przez wolne rodniki dostarczane przez nadsiarczan amonu i
stabilizowane przez TEMED (N,N,N,N’-tetrametyloetylenodiamina). Wielkość por w żelu
poliakryloamidowym zależy od procentowej zawartości akryloamidów. Zwiększenie procentowości żelu
prowadzi do zmniejszenia wielkości por. Czas polimeryzacji nie powinien być krótszy niż 30 min.
Akryloamidy i bisakryloamidy (standardowy stosunek 29:1) łatwo ulegają rozkładowi do kwasu
akrylowego, który wpływa na ruchliwość cząsteczek przechodzących przez matrix żelu – roztwory
należy chronić przed światłem. Nadsiarczan amonu jest stabilny w roztworach tylko przez tydzień w
temperaturze 4st C, może być przygotowywany na lodzie, rozpipetowany w ilościach wymaganych do
przygotowania żelu do probówek i mrożony w -20st C. Płyty szklane należy bardzo dokładnie myć,
dotykając rękawiczkami jedynie krawędzi szyb. Nie wolno dotykać rękawiczkami powierzchni
roboczych szyb. Akrylamid niespolimeryzowany jest neurotoksyczny, kumuluje się w organizmie a
efekty mogą wystąpić po latach. Po procesie polimeryzacji, swobodne monomery mogą pozostawać w
żelu.
Wszystkie roztwory (mocznik, TBE i akryloamid) wykorzystywane do przygotowania żelu
denaturującego powinny być filtrowane (0,45 um) i odpowietrzone. Roztwory należy łączyć tak by nie
powstawały pęcherzyki powietrza.
Gęstość sieciowania oraz rozmiary porów można regulować, dobierając odpowiednio stężenie
akryloamidu i bisakryloamidu. Właściwości żelu opisują dwa parametry:
Całkowite stężenie akryloamidu: T[%]=((akryloamid + bisakryloamid) [g]/objętość [ml])
Wagowy stosunek ilości substancji sieciującej do sumy akryloamidu i substancji sieciującej:
C[%]= (bisakryloamid [g]/ (akryloamid + bisakryloamid) [g]) x 100.
Ze wzrostem T maleje średni rozmiar porów. Minimalny rozmiar porów, przy zadanej wartości T
uzyskuje się dla wartości C=5%. Powyżej i poniżej tej wartości rozmiary porów wzrastają.
Zakres rozdziału liniowego DNA w różnych stężeniach poliakryloamidu
Stężenie poliakryloamidu w żelu [%]
Zakres rozdziału liniowego DNA [pz]
4
100-1000
5
80-500
8
40-400
12
10-200
20
<10
Właściwości żeli poliakryloamidowych
Stosowany do rozdziału fragmentów DNA do 1000 pz, oligonukleotydów, RNA i białek, również
jednoniciowego DNA.
Czułość – wyższa niż przy barwieniu bromkiem etydyny, dziesiąte ng – białka, 1-10 pg DNA/mm2
Zalety – rozdzielczość do 1 pz
Wady – bardziej czasochłonne
Azotan srebra dzięki płaskiej konformacji interkaluje między sąsiadujące ze sobą pary zasad
nukleinowych w DNA i tworzy z nim trwałe kompleksy.
7
PRZYGOTOWYWANIE PŁYT DO ELEKTROFOREZY POLIAKRYLAMIDOWEJ
-
Umyć jedną stronę płyty pod bieżącą wodą z detergentem, przepłukać wodą destylowaną;
Osuszyć płyty ręcznikiem papierowym;
Przemyć czystą stronę płyty 2 razy etanolem;
Przygotować Bind Silane Solution [wg przepisu];
Bind Silane Solution wylać na czystą stronę większej płyty i rozprowadzić papierowym
ręcznikiem po całej płycie;
Płytę pozostawić na 4 minuty;
Następnie przemyć większą płytę 2 razy 96% etanolem w odstępach 2 minutowych;
Zmienić rękawiczki; mniejszą płytę przetrzeć ręcznikiem nasączonym 1 ml akrylazy- jedno
mycie na 2 elektroforezy;
Na większą płytę nałożyć przekładki [z gąbką, 0,4mm]
Złączyć obie płyty, założyć metalowe klamry, zabezpieczyć przed kurzem;
PRZYGOTOWYWANIE ŻELU POLIAKRYLAMIDOWEGO
-
Przygotować żel wg przepisu;
Wyjąć grzebień spomiędzy szyb; klamry boczne nie mogą być wysunięte poza przekładki
Całość wymieszać i wylać równomiernie miedzy szyby, ustawione pod kątem około 7,5
stopnia do powierzchni blatu (bez ręcznika na dole);
Ułożyć szybę poziomo, przemyć grzebień etanolem;
Włożyć grzebień gładką stroną około 0,5 cm w głąb płyty i uważać, aby nie powstały
pęcherzyki powietrza na styku żel-grzebień;
Ścisnąć górne krawędzie wybranymi 3 klamrami;
Wytrzeć dokładnie pozostałości żelu z blatu;
Pozostawić do polimeryzacji na 1,5-2,5 godziny; po tym czasie dodatkowo zabezpieczyć
brzegi szyb wilgotnymi papierowymi ręcznikami i/ lub folią;
PRZYGOTOWYWANIE APARATU DO ELEKTROFOREZY
-
Włączyć blok grzejny do temperatury 960 C;
Przygotować 1x TBE do elektroforezy.
5X TBE
200 ml
woda
800 ml
-
Wyjąć grzebień z płyty, powierzchnię płyty przemyć wodą destylowaną w celu usunięcia
resztek żelu; nie może być powietrza miedzy szybami w dolnej części żelu- zalać wodą lub
TBE;
Złożyć aparat do elektroforezy
Wlać bufor 1XTBE do komór aparatu;
Nałożyć grzebień na żel „ząbkami” do dołu na głębokość około 0,5 mm, ząbki powinny się
wbić w żel na głębokość 0,2-0,5 mm;
Ostrożnie przepłukać przestrzeń między szybami w celu usunięcia jakichkolwiek nieczystości i
pęcherzyków powietrza;
Załadować do studzienek bufor obciążający w ilości 3,5 l na „kieszonkę”;
Włączyć aparat do elektroforezy;
Pre -elektroforezę prowadzić około 30 minut;
Po pre- elektroforezie zdenaturować próby :
- do produktu amplifikacji dodać buforu obciążającego w ilości równej
objętości próbki PCR;
- denaturować w 950C przez 5 minut;
- przenieść i wbić w lód na min. 3 minuty
-
-
Nałożyć na żel po 7 l próby
8
-
Rozdzielać przez 1,15 godz. przy 2000V, 60W, 100mA.
Wyjąć płyty z aparatu, zdjąć i umyć (detergent, woda, etanol) płytę mniejszą (posmarowana
akrylazą );
Duża szybę z przyklejonym żelem przeznaczyć do wybarwienia
Zlać bufor i oznaczyć na butelce ile razy jest używany.
Umyć aparat do elektroforezy i posprzątać stanowisko pracy
BARWIENIE ŻELU METODĄ SREBROWĄ
Miejsce
wykonania
barwienia:
pomieszczenie
do
elektroforezy,
pod
wyciągiem
chemicznym
-
Płytę z żelem umieścić w kuwecie i zalać 10% kwasem octowym, kołysać min. 30 minut;
odczynnik musi obmywać całą płytę;
Przepłukać 3 razy w wodzie destylowanej po 2 minuty;
Przygotować azotan srebra wg przepisu;
Zalać płytę AgNO3, kołysać min. 30 minut + 10 minut
Przepłukać szybko wodą destylowaną;
Przygotować węglan sodu wg przepisu tuż przed końcem mieszania z azotanem srebra;
Zalać żel wywoływaczem [Na2CO3] i obserwować pojawiające się prążki;
Po wybarwieniu wlać do wywoływacza 10% kwas octowy [utrwalacz]
Utrwalać ok. 10 minut;
Odlać utrwalacz i kołysać w wodzie destylowanej przez 10- 30 minut;
Wyjąć żel z kuwety i pozostawić na powietrzu do wyschnięcia;
Suchy żel opisać i sfotografować;
9
ODCZYNNIKI DO ELEKTROFOREZY POLIAKRYLAMIDOWEJ
Bind Silane
Solution
Składnik
Etanol 100%
Kwas octowy 99,5%
Bind Silane
Żel poliakrylamidowy
Ilość
950 l
50 l
2 l
Azotan srebra [AgNO3]
Składnik
Woda destylowana
AgNO3
Formaldehyd
Ilość
1000 ml
1g
1,5 ml
5x TBE
Składnik
Ilość
Trisma Base (Tris)
54 g
Boric acid
27,5g
0,5M EDTA
20 ml
woda destylowana do 1000 ml
1 M Tris- HCl
Składnik
Ilość
Trisma Base (Tris)
121,1 g
HCl
42 ml
Woda destylowana do 1000 ml
Mocznik 5M
Składnik
Mocznik
woda destylowana do
Składnik
Mocznik
10x TBE
akrylamid
APS
TEMED
Węglan sodu [Na2CO3]
Składnik
Woda destylowana
Na2CO3
Formaldehyd
Tiosiarczan sodu 1%
Ilość
60,8 ml
9,6 ml
9,6 ml
150 l
40 l
Ilość
1000 ml
30 g
1,5 ml
200 l
0,5M EDTA
Składnik
Ilość
EDTA (disodium salt)
186,1 g
NaOH
20 g
Woda destylowana do 1000 ml
40% Akrylamid
Składnik
190g Akrylamidu
10g bisakrylamidu
dopełnić wodą do 500 ml
Ilość
Ilość
10
Ćw. 4. rozdział RAPD i/lub ISSR, trawienie MWG2230 PCR – SSR dla Sbm1 analiza
podobieństwa
Mwg2230_R+L
TRAW składnik
R+ bufor (X)
Bsu, Hinf,
Enzym Mva
PCR-DNA
woda
GG
St0
STS
SSR50B
2.5
+
Bsu
vol
ile
StK reakcji rozcien 1X 55X
10
1
10
0,1
1
55,0
10
10
1
2
50
10
10
10
0,2 0,2
11,0
5 4,5 /prob
0 4,3 236,5
302,5
CYKL:
STS
vol
Lr37_B
składnik
St0
StK
reakcji
rozcien
ile 1X
50x
Fermentas bufor (X)
10
1
25
0,1
2,5
125,0
starter1
Y15F
(uM)
10
0,25
25
0,025
0,625
31,3
starter2
Y15R
(uM)
10
0,25
25
0,025
0,625
31,3
MgCl2
(uM)
25
2,5
25
0,1
2,5
125,0
dNTP (uM)
2000
100
25
0,05
1,25
62,5
Fermantas TAQ
1
0,8
25
0,8
40,0
DNA
40
100
25
2,5
woda
1
25
14,2
710,0
cykl: Lr37_1 Kontrola +: Kris
vol
Lr37_F
składnik
St0
StK
reakcji
rozcien
ile 1X
50X
Fermentas bufor (X)
10
1
20
0,1
2
100,0
starter1
cslVrga_L (uM)
10
0,25
20
0,025
0,5
25,0
starter2
cslVrga_R (uM)
10
0,25
20
0,5
25,0
MgCl2
(uM)
25
2,5
20
2
100,0
dNTP (uM)
2000
100
20
0,05
1
50,0
Fermentas TAQ
1
0,8
20
0,8
40,0
DNA
40
100
20
1
woda
1
20
12,2
610,0
Cykl: SSR55B Kontrola +: Kris
11
CAPS
0,025
0,1
Mwg2230
Mwg2230
Mwg2230_R+L
STS_E1/ssr50b
aga_PCR
AATgATgTTgCTTTCCTgTTTgCTC
STS
składnik
Fermentas bufor (X)
starter_L (uM)
starter_R (uM)
MgCl2 (uM)
dNTP (uM)
(10mM)
spermidyna
Fermentas TAQ
DNA
woda
St0
vol
reakcji
StK
10
10
10
25
2000
10
1
20
1
ACAgATgATgATggCgTgCAgCTTT
1
0,25
0,25
2,5
200
0,6
0,5
50
25
25
25
25
25
25
25
25
25
rozcien ile 1X 17X
0,1
2,5 42,5
0,025 0,625
0,025 0,625
0,1
2,5 42,5
0,1
2,5 42,5
0,06
1,5 25,5
0,5
8,5
2,5 42,5
11,75 199,8
12